α(v)β(6)整合素结合蛋白的计算设计的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术α(v)β(6)整合素结合蛋白的计算设计1.交叉引用2.本技术请求2019年10月25日提交的美国临时专利申请序列号为62/925868的优先权，通过引用将其全部并入本文。3.联邦资金说明4.这项发明是在国家卫生研究院颁发的授予号为r01 gm092802的政府资助下完成的。政府对这项发明有一定的权利。5.序列表说明6.序列表的计算机可读形式通过电子提交与本技术一起提交，并通过引用将其全部并入本技术。序列表包含在2020年10月21日创建的文件中，文件名为“19-1733-pct_sequence-listing_st25.txt”，大小为42kb。背景技术：7.整合素是一类异二聚体细胞表面蛋白，其广泛的参与包括细胞-细胞黏附、迁移、增殖和死亡的细胞功能。avb6是这些整合素中的一种，由av和b6亚单位组成，负责激活tgf-b1/b3。avb6的表达严格限于上皮细胞。在正常生理条件下，avb6的表达几乎完全局限于发育阶段的特定组织形态变化，导致其在完全分化的上皮细胞中低表达或不表达，但有一些例外。在病理组织重编程下，在肿瘤细胞迁移、伤口愈合和炎症中avb6的表达上调。总体而言，avb6表达水平与总生存不佳相关。技术实现要素：8.在一个方面，本发明公开了包含选自seq id no：1-3的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽与α(v)β(6)整合素(avb6)结合。在一个实施方案中，第8位的氨基酸残基为r，第9位的氨基酸残基为g，10位的氨基酸残基为d。在各种其他实施方案中，第12位的氨基酸残基为a；第13位氨基酸残基为e或t；第14位氨基酸残基为l；第15位氨基酸残基为m、r或k；第16位氨基酸残基为l；第37位的氨基酸残基为n、s或k；第38位氨基酸残基为g；其中，第39位的氨基酸残基为a、f或k；第40位氨基酸残基为e；第61位氨基酸残基为r或k；第62-67位的氨基酸残基为fp(g/r)(v/t)xt，其中x是表1、2或3中第66位所列举的任何残基，其中括号中的残基是该位置的可选方案；第17位的氨基酸残基为r；第36位氨基酸残基为n；和/或第65位的氨基酸残基为v，和/或第67位的氨基酸残基为t。9.在另一实施方案中，所述多肽包含至少与seq id no：4-30的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％一致性的氨基酸序列。在一个实施方案中，残基第8-10位是不变的，并且任选地，其中第12、13、14、15、16、17、36、37、38、39、40、61、62、63、64、65和67位的氨基酸残基中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个全部相对于参考序列不变，对于seq id no：4-28，从任选的n端蛋氨酸残基后的第一个氨基酸开始残基编号，对于seq id no：29-30，从可选的n端蛋氨酸残基后的第三个氨基酸(cys残基)开始残基编号。10.在另一个方面，本发明提供了与选自seq id no：4-30和36的氨基酸序列至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的多肽。在一个实施方案中，所述多肽与选自seq id no：21、25、29和30的氨基酸序列至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。在另一个实施方案中，来自参考蛋白质的氨基酸变化是保守的氨基酸置换。在另一个实施方案中，rgd序列是不变的。在一个实施方案中，第8-10位残基是不变的，并且可选地，其中第12、13、14、15、16、17、36、37、38、39、40、61、62、63、64、65和67位的氨基酸残基中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个全部相对于参考序列不变，对于seq id no：4-28，从可选的n端蛋氨酸残基后的第一个氨基酸开始残基编号，对于seq id no：29-30，从可选的n端蛋氨酸残基后的第三个氨基酸(cys残基)开始残基编号。11.在其他方面，本发明提供了编码本文所公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽的核酸；包含所述核酸的表达载体，所述核酸与控制(control)序列可操作地连接；包含本文公开的任何实施方案或实施方案组合中所述核酸或所述表达载体的宿主细胞或重组体；以及包含本文公开的任何实施方案或实施方案组合中所述多肽、核酸、表达载体、宿主细胞或重组细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。12.在一个方面，本发明提供了将本文所公开的任何实施方案或实施方案组合中所述多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、重组细胞或药物组合物用于任何合适目的的用途，包括但不限于在体内治疗和/或检测avb6(+)肿瘤，在体外阻断avb6介导的tgf-b信号，治疗如特发性肺纤维化(ipf)的肺纤维化。在另一方面，本发明提供了治疗avb6(+)肿瘤或肺纤维化(例如特发性肺纤维化(ipf))的方法，包括向需要其的受试者施用一定量的本文公开的任何实施方案或实施方案组合中的所述多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物，以有效治疗受试者的肿瘤或ipf。在另一个方面中，本发明提供了检测avb6(+)肿瘤的方法，包括向疑似患有avb6(+)肿瘤的受试者施用一定量本文所公开的可有效检测受试者肿瘤的任何实施方案或实施方案的组合中所述多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物。13.在另一方面，本发明提供了设计avb6结合多肽的方法，包括本文所公开的任何实施方案或实施方案组合中和所附附录中所述的步骤。附图说明14.图1a-i.a)αvβ6结合蛋白的计算设计策略：αvβ6整合素(曲面表示)与tgf-β1肽(卡通化表示，pdb id 4um9)复合物的结构。b)与tgf-β1肽的低rmsd匹配来自pdb数据库(带状表示)。c)然后使用rosettatm将非冲突(non-clashing)片段整合到α/β铁氧还蛋白折叠(卡通化表示)中。d)在rgd结合环固定的情况下进行rosettatm灵活序列设计。e)然后，用rosettatm结构预测识别设计结构为最低能量状态的序列。f)除了rgd结合基序外，还有两个环(环1和环2)介导与αv和β6亚基的接触。g)av6_3设计中的典型rgd基序与受体进行骨架水平的相互作用，asp与mg(ii)配位。h)紧随rgd结合环之后的-lxxl(seq id no：33)基序包装在β6亚基的疏水沟(groove)上。i)由环1和环2介导的额外相互作用，即分别与β6和αv亚基进行极性接触。15.图2a-k图a，设计的结合物的位点饱和突变分析：图b-e，大多数富集的变体与受体是电荷互补的(详情见正文)。图f和g，纯化的bp1和bp2对αvβ6的bli滴定。这两种突变体的kd均《1nm，每种滴定至少进行两次，结果相似。图h，bp1_disulf的晶体结构叠加在设计的模型上(结合物，αvβ6)。图i和j，二硫键和rgd环的设计模型与晶体结构图k的叠加。与存在电荷反转的αvβ8相比，a39k突变赋予αvβ6特异性(β6为glu963，β8为lys902)。图l，对稳定转染αvβ8的k562细胞进行bp1和bp2的细胞表面滴定。缺乏a39k突变的bp1以约7.3nm的kd与αvβ8结合，而含有a39k突变的bp2以》500nm的kd与αvβ8结合。16.图3,tmlc检测中bp1和bp2介导的tgf-β抑制。bp1和bp2均以相似的ic50(分别为199pm和151pm)阻断αvβ6介导的tgf-β激活。17.图4a-b，第一轮设计和第二轮设计策略中的晶体结构：a)第一轮设计中叠加在所述设计模型上的进化变体(seq id no:36)的晶体结构。虽然晶体结构的第一部分包括rgd环，与设计模型覆盖良好，但折叠的最后一个螺旋旋转了半圈。b)对于第二代设计，通过比对rgd基序，将上一轮的晶体结构叠加到αvβ6上。对两个环的长度和构象进行了采样，共16个设计在第二轮被有序采样。18.图5，所设计的蛋白质的代表性金属依赖性结合：所设计的蛋白质示出了与αvβ6的金属依赖性结合。与1mm ca(ii)/1mm mg(ii)(右侧)相比，在没有任何金属的情况下，没有可检测到的结合(左侧)。根据结合或sape荧光(y轴)绘制表达或fitc荧光图(x轴)。19.图6，使用50pm生物素化αvβ6将第二轮设计的12个克隆结合在酵母表面。表达或fitc荧光绘制在x轴上，结合或sape荧光绘制在y轴上。20.图7，第二轮设计中5种最强结合物的体外细胞表面竞争检测。与人αvβ8相比，av6_3对人αvβ6的选择性高。结合物的对数浓度(x轴)与平均荧光强度(y轴)相对应。21.图8，av6_3的ssm库的分类方案。第一轮分类在200pm的αvβ6上进行，然后使用100pm受体进行最终分类。22.图9a-b，图a.通过热处理从细胞裂解物中一步纯化bp2_disulf的sds-page凝胶。泳道1：梯形条带(ladder)，泳道2：bp2_disulf粗细胞裂解物。泳道3：在85℃下煮沸10分钟后的bp2_disulf细胞裂解物。图b.雾化前后bp2_disulf的cd光谱。具体实施方式23.本文引用的所有参考文献全部通过引用并入本文。在本技术中，除非另有说明，否则所使用的技术可在多个知名参考文献中找到，例如：molecular cloning:a laboratory manual(sambrook等人，1989,cold spring harbor laboratory press)，gene expression technology(methods in enzymology,vol.185,edited by d.goeddel,1991.academic press,san diego,ca)，“guide to protein purification”in methods in enzymology(m.p.deutshcer,ed.,(1990)academic press,inc.)；pcr protocols:a guide to methods and applications(innis等人，1990.academic press,san diego,ca)，culture of animal cells:a manual of basic technique,2nd ed.(r.i.freshney.1987.liss,inc.new york,ny)，gene transfer and expression protocols,pp.109-128,ed.e.j.murray,the humana press inc.,clifton,n.j.)和ambion 1998 catalog(ambion,austin,tx)。24.如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。25.如本文所用，“大约”是指所述数值的+/-5％。26.本发明任何方面的所有实施方案都可以组合使用，除非上下文另有明确规定。27.除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等词语应以包容性意义来解释，而不是以排他性或穷举的意义来解释；也就是说，为“包括但不限于”的意义。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。此外，本技术中使用的“本文(herein)”、“以上”和“以下”以及类似含义的词语应指本技术的全部，而不是指本技术的任何特定部分。28.如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(ala；a)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、精氨酸(arg；r)、半胱氨酸(cys；c)、谷氨酸(glu；e)、谷氨酰胺(gln；q)、甘氨酸(gly；g)、组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、蛋氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)，丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)和缬氨酸(val；v)。29.在一个方面，本发明提供了包含seq id no：1、2或3(如表1、表2或表3所示)的氨基酸序列的多肽，其中所述表格示出了多肽中每个位置的氨基酸选项，并且其中所述多肽与α(v)β(6)整合素(avb6)结合。如本文实例中所公开的，发明人已将所请求保护的多肽设计为avb6整合素结合蛋白。所述设计的蛋白质具有超热稳定性，并以高亲和力与avb6结合。所述多肽可以用于例如在体内治疗和/或检测avb6(+)肿瘤，在体外阻断avb6介导的tgf-b信号，以及治疗例如特发性肺纤维化(ipf)的肺纤维化。实施例提供了饱和研究以确定多肽中每个位置可能存在的残基。30.表1/seq id no：1，以氨基酸单字母代码示出了所述多肽中任何位置可能存在的氨基酸残基，基于下面实施例中描述的饱和突变研究。31.32.[0033][0034][0035]表2/seq id no：2通过氨基酸单字母代码示出了所述多肽中任何位置可能存在的氨基酸残基，包括在下面的实施例中描述的饱和突变研究中看到的更丰富的突变。[0036][0037][0038][0039]表3/seq id no：3通过氨基酸单字母代码示出了所述多肽中任何位置可能存在的氨基酸残基，包括在下面的实施例中描述的饱和突变研究中看到的更丰富的突变。[0040][0041][0042][0043][0044]在一个实施方案中，第8位的氨基酸残基为r，第9位的氨基酸残基为g，第10位的氨基酸残基为d。用于avb6结合的界面残基包括第8-10位残基，并且在该实施方案中，所述界面残基包括在残基第8-10位的rgd基序。[0045]在可以组合的各种其他实施方案中：[0046]第12位氨基酸残基为a；[0047]第13位氨基酸残基为e或t；[0048]第14位氨基酸残基为l；[0049]第15位氨基酸残基为m、r或k；[0050]第16位氨基酸残基为l；[0051]第17位氨基酸残基为r；[0052]第36位氨基酸残基为n；[0053]第37位的氨基酸残基为n、s或k；[0054]第38位氨基酸残基为g；[0055]第39位的氨基酸残基为a、f或k；[0056]第40位氨基酸残基为e；[0057]第61位氨基酸残基为r或k；[0058]第62-67位的氨基酸残基为fp(g/r)(v/t)xt(seq id no：35)，其中x是表1、2或3中第66位所列举的任何残基，其中括号中的残基为该位置的可选方案；[0059]第65位氨基酸残基为v；和/或[0060]第67位的氨基酸残基为t。[0061]在可以组合的其他实施方案中：[0062]第12位氨基酸残基为a；[0063]第13位氨基酸残基为e或t；[0064]第14位氨基酸残基为l；[0065]第15位氨基酸残基为m、r或k；[0066]第17位氨基酸残基为r；[0067]第36位氨基酸残基为n；[0068]第37位的氨基酸残基为n、s或k；[0069]第38位氨基酸残基为g；[0070]第第39位的氨基酸残基为a、f或k；[0071]第61位氨基酸残基为r或k；[0072]第62-67位的氨基酸残基为fp(g/r)(v/t)xt(seq id no：35)，其中x是表1、2或3中第66位(position 66)所列举的任何残基，括号中的残基是该位置的可选方案；[0073]第65位氨基酸残基为v；和/或[0074]第67位氨基酸残基为t。[0075]如下面实施例所述，所述多肽第12-17位、第36-40位、第61-65位和第67位的氨基酸残基可以直接接触avb6。[0076]在另一实施方案中，所述多肽包含至少与seq id no：4-28的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％一致性的氨基酸序列，其中括号中的残基是可选的。这些实施例方案中的每一个都包括未包含在seqid no：1-3中的可选n-末端蛋氨酸。因此，seq id no：4-28中的残基编号从可选n-末端蛋氨酸残基之后的第一个氨基酸开始。[0077]表4[0078][0079][0080][0081]aevrfvfrgdltelmlravkdhlkkegphwnitsrgnelevrgshesdakriqkefpsvqsttqa[0082]在其他实施方案中，所述多肽包含至少与seq id no：29-30的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％一致性的氨基酸序列，其中括号中的残基是可选的。这些实施例中的每一个都包括可选的n-末端蛋氨酸和n-末端的两个额外残基，它们不包括在seq id no：1-3中。因此，seq id no：29-30中的残基编号从可选n端蛋氨酸残基之后的第三个氨基酸(cys残基)开始。这些实施方案引入了允许二硫键结合的cys残基。二硫键的引入使这两种蛋白质都具有超热稳定性，根据非还原条件下的cd光谱数据，它们可以在95℃维持二级结构。[0083][0084]在一个实施方案中，所述多肽与选自seq id no：21(e13t)和seq id no：25(a39kg64r)的氨基酸序列至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。[0085]在一个实施方案中，第8-10位残基(从可选的n-末端蛋氨酸残基之后的第一个氨基酸开始残基编号)是不变的。如上所述，avb6结合的界面残基包括第8-10位残基。在另一实施方案中，或第12、13、14、15、16、17、36、37、38、39、40、61、62、63、64、65和67位的氨基酸残基中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个全部(对于seq id no：4-28，从可选的n端蛋氨酸残基后的第一个氨基酸开始残基编号，对于seq id no：29-30，从可选的n端蛋氨酸残基后的第三个氨基酸(cys残基)开始残基编号)相对于参考序列不变。如上所述，所述多肽第12-17、36-40位、61-65位和第67位的氨基酸残基可直接接触avb6。[0086]在另一个方面，本发明提供的多肽与选自seq id no：4-30和36的氨基酸序列至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。[0087]aevrfvfrgdltelmlravkdhlkkegphwnitsrgnelevrgshesdakriqkefpsvqsttqa(seq id no：36)。[0088]在一个实施方案中，该方面的所述多肽与选自seq id no:21(e13t)、25(a39kg64r)和29-30的氨基酸序列至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。[0089]在一个实施方案中，seq id no：4-30的第8-10位残基(从可选n-末端蛋氨酸残基之后的第一个氨基酸开始残基编号)或seq id no：29-30第10-12位残基是不变的。如上所述，avb6结合的界面残基包括第8-10位残基(或seq id no：29-30中的第10-12位残基)。在另一个实施方案中，第12、13、14、15、16、17、36、37、38、39、40、61、62、63、64、65和67位的氨基酸残基中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个全部相对于参考序列不变，对于seq id no：4-28，从可选的n端蛋氨酸残基后的第一个氨基酸开始残基编号，对于seq id no：29-30，从可选的n端蛋氨酸残基后的第三个氨基酸(cys残基)开始残基编号。如上所述，所述多肽的第12-17位、第36-40位、第61-65位和第67位的氨基酸残基可以直接接触avb6。[0090]在上述所有实施方案中的一个实施方案中，来自参考蛋白质的氨基酸变化可以是保守的氨基酸置换。[0091]这里使用的“保守的氨基酸置换”指：[0092]ο疏水性氨基酸(ala、cys、gly、pro、met、sce、sme、val、ile、leu)只能被其他疏水性氨基酸取代；[0093]ο侧链粗大的疏水性氨基酸(phe、tyr、trp)只能被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；[0094]ο侧链带正电的氨基酸(arg、his、lys)只能被其他侧链带正电的氨基酸取代；[0095]ο侧链带负电的氨基酸(asp、glu)只能被其他侧链带负电的氨基酸取代；并且[0096]ο侧链有极性不带电的氨基酸(ser、thr、asn、gln)只能被其他侧链有极性不带电侧链的氨基酸取代。[0097]在一个实施方案中，本发明所述多肽可以连接至可检测标签。该实施方式可以用于例如多肽的诊断用途。任何合适的可检测标签可被视为适用于预期用途，包括但不限于放射性标记物、荧光或发光蛋白、亲和素、生物素或过氧化物酶等酶。[0098]在所有实施方案中，所述多肽与α(v)β(6)整合素(avb6)结合，通过使用带有his标记的ni nta传感器利用生物膜层干涉所显示，如下面的实施例所述。在一个实施方案中，如下面实施例(表5)所述，通过使用带有his标记的ni nta传感器利用生物膜层干涉检测，所述多肽以亚纳摩尔结合亲和力与avb6结合。在另一实施方案中，使用k562细胞稳定转染时，与相应整合素α(v)β(8)整合素(avb8)、α(v)β(1)整合素(avb1)、α(v)β(3)整合素(avb3)、α(v)β(5)整合素(avb5)、α5β1(a5b1)、α8β1(a8b1)和α(iib)β(3)整合素(aiibb3)相比，所述多肽以至少100倍的选择性与avb6结合。[0099]在另一个方面，本发明提供编码本发明任何实施方案或实施方案组合所述多肽的核酸。所述核酸序列可以包括单链或双链rna或基因组或cdna形式的dna，或dna-rna杂合体，其中每一种可以包括化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。此类核酸序列可以包括用于促进编码多肽的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polya序列、修饰的kozak序列、编码表位标签的序列、输出信号序列、分泌信号的序列、核定位信号的序列和质膜定位信号的序列。对于本领域技术人员来说，基于本文的教导，什么样的核酸序列可以编码本发明的多肽是显而易见的。[0100]在另一个方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包含本发明任何方面的核酸，所述核酸可操作地与合适的控制序列连接。“表达载体”包括可操作地将核酸编码区或基因与能够影响基因产物表达的任何控制序列连接的载体。可操作地与本发明的核酸序列连接的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。控制序列不需要与核酸序列相邻，只要它们起到引导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在并入的未翻译但转录的序列，启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。其他此类控制序列包括但不限于多聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。这种表达载体可以是任何类型，包括但不限于质粒和病毒基表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中的表达的控制序列可以是组成性的(由包括但不限于cmv、sv40、rsv、actin、ef的多种启动子中的任何一种驱动)或诱导性的(由包括但不限于四环素、蜕皮激素、甾体-反应素的诱导性启动子中的任何一种驱动)。所述表达载体必须能够在宿主生物体内作为游离基因复制或整合到宿主染色体dna中进行复制。在各种实施方案中，所述表达载体可以包括质粒、病毒基载体或任何其他合适的表达载体。[0101]在另一方面，本发明提供了宿主细胞或重组细胞，所述宿主细胞或重组细胞包含本文所公开的核酸、表达载体(即：游离基因的或染色体整合的)和/或多肽，其中所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。可使用包括但不限于细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导、deae-葡聚糖介导、聚阳离子介导或病毒介导的转染等技术，瞬时或稳定地将细胞工程化以并入本发明的表达载体。[0102]在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括：[0103](a)本文公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽、核酸、表达载体或宿主细胞；和[0104](b)药物上可接受的载体。[0105]本发明的药物组合物可以用于例如本文所述的本发明的方法中。除本发明的多肽外，所述药物组合物还可包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)膨胀剂；(d)渗透调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲液。[0106]在一些实施方案中，药物组合物中的缓冲液为tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。所述药物组合物还可以包括冻干保护剂，例如蔗糖、山梨醇或海藻糖。在某些实施方案中，所述药物组合物包括防腐剂，例如苯扎氯铵、苯乙铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对苯甲酸甲酯、对苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及它们的各种混合物。在其他实施方案中，所述药物组合物包括膨胀剂，如甘氨酸。在其他实施方案中，药物组合物包括表面活性剂，例如聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60、聚山梨酯-65、聚山梨酯-80、聚山梨酯-85、泊洛沙姆-188、山梨糖醇酐月桂酸酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、山梨醇单油酸酯、三月桂酸山梨酯、山梨醇酐三硬脂酸酯、三油酸山梨坦或其组合。所述药物组合物还可以包括渗透调节剂，例如使该制剂与人类血液基本等渗或等渗的化合物。示例性渗透调节剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和盐酸精氨酸。在其他实施方案中，所述药物组合物还包括稳定剂，例如，一个分子，当与感兴趣的蛋白质结合时，所述分子可以基本上防止或减少感兴趣的冻干或液体形式的蛋白质的化学和/或物理不稳定性。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和盐酸精氨酸。[0107]所述多肽、核酸、表达载体和/或宿主细胞可以是所述药物组合物中的唯一活性剂，或者所述组合物还可以包含适合预期用途的一种或多种其他活性剂。[0108]在另一方面，本发明提供了本文所公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞或药物组合物用于任何合适目的的用途，包括但不限于在体内治疗和/或检测avb6(+)肿瘤，在体外阻断avb6介导的tgf-b信号，治疗如特发性肺纤维化(ipf)的肺纤维化。[0109]在另一方面，本发明提供了治疗avb6(+)肿瘤或肺纤维化(例如特发性肺纤维化(ipf))的方法，包括向需要的受试者施用一定量的本文公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、和/或药物组合物，以有效治疗受试者的肿瘤或ipf。[0110]如实施例所述，αvβ6的高水平表达与包括非小细胞肺癌(nsclc)和胰腺癌在内的多种癌症的总生存不佳有关。αvβ6介导的tgf-β激活也与多种纤维化疾病有关，是特发性肺纤维化(ipf)干预治疗的既定靶标。ipf是一种罕见的(每10万人中有10-60例)进行性不明原因的纤维化肺病，目前尚无治愈方法，占所有肺移植的57％。由于持续和恶化的cov-19疫情而导致的急性呼吸窘迫综合征(ards)患者的肺组织出现斑片状毛玻璃阴影，特别是在高危老年人群中，可能会发生肺纤维化。最近的研究表明，sars-cov-2感染和严重肺损伤后肺纤维化的其他驱动因素一起会增加肺和肺组织中tgf-βmrna的表达。因此，在一个实施方案中，受试者是患有ipf且感染sars-cov-2的人类受试者。[0111]受试者可以是任何合适的受试者，包括但不限于人类受试者。如本文所用，“治疗”指完成以下一项或多项：(a)降低疾病的严重程度；(b)限制或防止疾病特征性症状的发展；(c)抑制疾病特征性症状的恶化；(d)限制或防止先前患有该疾病的受试者再次出现该疾病；和/或(e)限制或防止之前出现该疾病症状的受试者的症状复发。实现任何数量的这种“治疗”对患有avb6(+)肿瘤或肺纤维化的受试者都是非常有益的。[0112]αvβ6靶向结合的短的血清半衰期(《2小时)、高特异性和高亲和力、易于使用大肠杆菌(e.coli)生产、超热稳定性和多肽的气雾剂处方性(如下面实施例所述)比现有疗法有显著改进。与抗体抑制剂相比，本发明的多肽可以配制用于具有内置可调血清半衰期和减少的全身暴露的组织特异性递送，这两个因素都有望提高安全性并减少不必要的副作用(例如，用于ipf的气雾剂αvβ6粘合疗法的肺部滞留和短的血清半衰期，可以在ipf患者的最终肺移植配置中支持更好的结果)。[0113]所述方法可以包括由出诊医务人员通过认为合适的任何适当途径施用，包括但不限于肺部递送(包括但不限于吸入和雾化)、静脉递送和肌肉内递送。[0114]在另一个方面，本发明提供了检测avb6(+)肿瘤的方法，包括向疑似患有avb6(+)肿瘤的受试者施用一定量本文所公开的可以有效检测受试者的肿瘤任何实施方案或实施方案的组合的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物。[0115]在所有实施方案中，受试者可以是任何合适的受试者，包括但不限于哺乳动物，例如人类。[0116]在另一个方面，本发明提供了设计avb6结合多肽的方法，包括本文所公开的任何实施方案或实施方案的组合的步骤。下面的实施例提供了详细信息。[0117]实施例[0118]整合素αvβ6是一个重要的治疗靶标，与tgf-β1/β3的激活有关，在多种癌症中上调，是包括特发性肺纤维化(ipf)在内的纤维化疾病的主要驱动因素，可由冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征(ards)触发。然而，很少有avb6高度特异性的抑制剂被开发出来。我们描述了超稳定抑制蛋白的从头设计，所述蛋白以亚纳摩尔的亲和力与人αvβ6连接，与其他rgd(arg-gly-asp)结合整合素相比特异性》2000倍。所述抑制剂的晶体结构与设计的模型密切匹配，其亲和力和特异性不仅源于含有环的rgd，还源于与β6亚基接触的第二个环。所设计的抑制剂在体外阻断αvβ6介导的tgf-β信号传导，并在体内实现αvβ6(+)肿瘤的特异性靶向性。当通过腹腔注射施用时，所设计的抑制剂在小鼠中对博莱霉素诱导的ipf示出重要的治疗效果，并且作为吸入疗法示出了期望的初步疗效。综上所述，这些结果说明了蛋白质从头设计在创造具有免疫肿瘤学和肺纤维化治疗潜力的高度特异性整合素抑制剂方面的能力。[0119]前言[0120]在肿瘤细胞迁移、伤口愈合和炎症过程中，组织重新编程后，αvβ6表达上调。在包括非小细胞肺癌(nsclc)和胰腺癌在内的多种癌症中，高水平的αvβ6表达与总生存不佳有关。αvβ6介导的tgf-β激活也与多种纤维化疾病有关，是特发性肺纤维化(ipf)干预治疗的既定靶标。ipf是一种罕见的(每10万人中有10-60例)进行性不明原因的纤维化肺病，目前尚无治愈方法，占所有肺移植的57％。由于持续和恶化的cov-19疫情而导致的急性呼吸窘迫综合征(ards)患者的肺组织出现斑片状毛玻璃阴影，特别是在高危老年人群中，可能会发生肺纤维化。最近的研究表明，sars-cov-2感染和严重肺损伤后肺纤维化的其他驱动因素一起会增加肺和肺组织中tgf-βmrna的表达。[0121]基于αvβ6与含rgd的肽(pdb id 4um9)的复合物的晶体结构，以及与整合素结合的含rgd的肽的其他结构一样，精氨酸和天冬氨酸侧链与整合素α和β亚基之间的界面上的残基形成多个氢键。在rgd的c端，所述肽有一个α螺旋转角(turn)，所述转角的两个亮氨酸装配进一个由β6亚基环形成的疏水袋。我们试图将αvβ6复合物结构中含有rgd的肽结合到一种从头设计的蛋白质中，所述蛋白质具有治疗候选物所需的特性。我们首先在硅片上筛选候选拓扑结构，以承载肽的8个残基延伸翻转构象(rgdlgala(seq id no：31，图1a)。我们在pdb数据库中搜索与肽骨架构象的低rmsd匹配，并提取由匹配肽加上n端五个侧翼残基和c端五个侧翼残基组成的片段。然后将这些延伸片段叠加在复合结构中的结合肽构象上，并丢弃与整合素发生骨架水平冲突的片段(图1b)。[0122]我们发现小的α/β铁氧还蛋白结构(图1c、1d)能够在不与整合素碰撞的情况下构建结合环，并选择该折叠进行后续从头设计计算。采用两步的方案设计铁氧还蛋白折叠的αvβ6结合物(binder)：第一步，按照构建理想蛋白质的规则，从片段中组装结构：取样不同的α-螺旋、β-折叠和环长度，同时使用rosettatm将rgd肽对应区域的扭转角限制在共晶体结构中观察到的扭转角(图1c)。在第二步中，通过叠加在结合环上，将得到的理想化铁氧还蛋白折叠结构与αvβ6整合素对接，并对结合表面的氨基酸进行优化以获得与靶的低能相互作用。在这些设计计算期间，结合rgd基序保持固定(图1d)。对最终设计模型进行从头结构预测测试，以确定这些序列的设计结构处于最低能量状态(图1e)。与之前大多数从头设计的蛋白-蛋白界面不同，αvβ6和设计的微型蛋白质之间的所有设计相互作用都是通过环介导的(图1f)。除了rgd环，还有两个与αv和β6亚基接触的其他环：环1连接片层2和片层3与β6亚基接触，环2连接螺旋2和片层4与αv亚基接触(图1f)。[0123]我们获得了9个编码不同长度螺旋、链和环的设计的合成基因(补充材料中示出组合细节)。在酵母细胞表面表达候选结合物的初始测试中，4个设计以预期的金属阳离子依赖的方式与荧光标记的αvβ6(用链霉亲和素、r-藻红蛋白偶联物(sape)标记的生物素化变体)结合。使用最强的粘合剂设计2作为起始模板，我们构建并通过易错pcr进行筛选，并在三轮酵母表面展示和荧光激活细胞分选(facs)后获得了一个具有5个突变(02_e2v_t12a_e40v_s44i_t63i)的新变体。我们在2a分辨率下解析了所述变体(seq id no：36)的晶体结构。虽然晶体结构的一部分(包括rgd环)与计算设计的模型重叠得很好，但折叠的最后一个螺旋旋转了半圈。这可能是由初始设计模型中部分暴露的phe56驱动的(图4)。[0124]为了生成与整合素有更广泛接触的αvβ6结合物，在第二轮设计中，我们通过叠加rgd环，将第一轮设计的结合物的晶体结构对接到αvβ6上，并在设计中确定了两个接近整合素的环区。我们对两个环的一系列长度和构象进行了取样，并选择了16个预测具有与整合素的有特定相互作用的环的设计，用于实验测试。我们获得了编码这16个设计的合成基因，并使用酵母表面展示和sape标记的生物素化αvβ6蛋白对结合进行测量。在16个有序设计中，12个在酵母表面表达良好，并发现以金属依赖性方式结合αvβ6(ca(ii)，mg(ii)，图5，facs数据)。我们使用4种不同浓度的生物素化αvβ6(50pm、100pm、300pm和500pm，补充信息)测定了酵母表面的结合。根据酵母表面展示实验(图6)，αv6_3示出了对αvβ6的结合信号最高，并且比原始结晶变体结合更紧密。我们在大肠杆菌中表达并纯化了5种最强的结合物(av6_3、av6_7、av6_9、av6_11和av6_15)。并确定了av6_3相对于负责tgf-β激活的另一整合素αvβ8，对αvβ6的选择性最高(图7)。在αv6_3中，tgf-β1前体结构域的典型rgdlxxl(seq id no：32)基序并入与铁氧还蛋白折叠的片层1和螺旋1接触的环中(图1g)。rgd环后面的两亲螺旋紧贴着β6亚基形成的疏水沟(图1h)，模拟tgf-β1肽与αvβ6的结合作用。asn37与来自β6亚基的asp901形成氢键，与连接αvβ6残基ser756和ile757的主链原子形成arg61氢键(图1i)。所有残基编号均基于rosettatm内部编号系统，从设计结合物的第一个残基开始。[0125]为了探索结合的序列决定因素，将设计av6_3中的每个残基分别突变为其他19种氨基酸，并对αvβ6结合进行两轮酵母表面展示和facs分选(facs，图8)。在选择前后对库进行深度测序，确定了在结合选择后富集的替代物(见表1-3)。主导αvβ6微型结合物的核心残基在很大程度上是保守的，这表明设计的残基接近最佳折叠(图2a)。由于这种三肽基序对结合的重要性，rgd环的突变如预期的那样高度缺失。界面上主要有5个富集突变：2个突变(e13/a39)与β6亚基相互作用，1个突变，m15位于αv和β6亚基形成的沟之间，p63/g64与αv亚基相互作用。紧接着两亲性螺旋，e13更倾向于疏水性或小的极性残基，这可能是由于整合素上近端带负电残基造成的；在这个位置富集的苏氨酸也存在于tgf-β1肽中。大多数其他高度富集的替代物也涉及电荷互补：m15r/k在αvβ6的d220和y250的氢键相互作用范围内(图2b)。环2上面向αv亚基的两个连续残基(p63和g64)为富集的带正电的lys或arg残基，它们可能与受体αv亚基上的两个酸性残基d218和d220形成盐桥(图2c和2d)。面对β6亚基的a39k替代物可能引入了一个带有glu963的盐桥(图2e)。我们表达、纯化和测试了这些选择的替代物的总共9个突变体(单独和组合)，并使用生物层干涉(bli)测量。所有变体对αvβ6表现出亚纳摩尔结合亲和力，而原始未参与的av6_3与αvβ6结合，kd为1.18nm(见表5)。选择了两种高亲和力变体进行进一步表征：bp1(av6_3_e13t)和bp2(av6_3_a39kg64r)，前者具有更紧密地再现tgf-β1肽序列的单取代，后者具有两个取代引入正电荷，与在αvβ6整合素的两个亚基中的负电荷互补。[0126]表5[0127][0128][0129]所设计抑制剂的功能特性：[0130]tgf-β是一种与潜态相关多肽(lap)形成的非活性复合物；αvβ6与这种非活性的lap(tgf-β复合物)结合并释放活性tgf-β。这种活性tgf-β随后与tgf-βri/rii相互作用并触发下游信号。αvβ6的表达主要局限于上皮细胞，在正常生理条件下，主要局限于发育过程中发生形态变化的组织，在完全分化的上皮细胞中几乎没有表达。然而，在病理条件下，αvβ6的表达在肿瘤细胞迁移、伤口愈合和炎症过程中的组织重新编程时上调，αvβ6的高水平表达与包括非小细胞肺癌(nsclc)和胰腺癌在内的多种癌症的总体生存不佳相关。这也引起了人们在肿瘤免疫中靶向αvβ6的极大兴趣。[0131]我们开始测试这些结合物与αvβ6(+)细胞结合并阻断tgf-β介导的下游信号传导的能力。我们通过马来酰亚胺化学的将alexafluor-488与工程化的c端半胱氨酸结合，生成荧光标记的bp1和bp2。用荧光标记的蛋白质对αvβ6阳性的人表皮样癌a431细胞进行滴定。bp1和bp2分别与kd值为167(±.028)pm和30(±.004)pm的a431细胞结合(数据未示出)。[0132]接下来，我们使用转化貂肺脏内报告细胞(tmlc)研究了这些设计的结合物阻断tgf-β信号的能力，tmlc产生荧光素酶以响应活性tgf-β。bp1和bp2均能阻断αvβ6介导的tgf-β激活，ic50值分别为199pm(95％ci[119pm，332pm])和151pm(95％ci[79.6pm，284pm])(图3)。bp1还阻断αvβ8介导的tgf-β激活，而bp2在最高试验浓度(333ng/ml)下没有作用，这与它们的体外结合特征一致(图10)。[0133]由于与bp1相比，bp2以更高的亲和力与a431细胞结合，并且对αvβ6更具特异性，因此我们选择bp2进行进一步的体内实验。为了研究进化的变体是否能在体内与αvβ6(+)肿瘤结合，我们通过化学方法将其与alexafluor-680 c-2马来酰亚胺偶联，通过工程化c端半胱氨酸生成荧光标记的bp2(af680-bp2)。给6-8周龄雌性无胸腺裸鼠的左肩和右肩分别注射a431细胞(αvβ6(+))和hek 293t(αvβ6(-))。当肿瘤直径达到5-10mm时，给小鼠注射1.5nmol的af680-bp2蛋白。af680-bp2在αvβ6阳性肿瘤中迅速积聚，并在注射后3小时内达到良好的肿瘤-肌肉荧光对比度(数据未示出)。在αvβ6阴性的hek-293t肿瘤上没有检测到荧光，表明alexafluor-680 c-2在体内对αvβ6有选择性。我们还对af680-bp2进行了半定量体内外生物分布分析。对不同组织的荧光强度分析显示，af680-bp2在αvβ6阳性肿瘤和肾脏(肿瘤与肾脏的比率为1：1.04，数据未示出)中积累，没有明显的脱靶结合(包括与αvβ6阴性肿瘤结合)。这些结果清楚地证明了使用设计的结合物在体内选择性靶向αvβ6阳性肿瘤。此外，尾静脉注射后af680-bp2的全身成像数据的量化表明，其血清半衰期约《2小时(数据未示出)，其可以通过肾小球滤过，通过肾脏进入尿液，并通过肝脏代谢过程进行消解。[0134]设计的结合物对其他rgd结合整合素的特异性的决定因素：[0135]如上所述，整合素αvβ8也在tgf-β1/tgf-β3的激活中发挥作用。αvβ8在t-reg细胞上过度表达，对抑制t细胞介导的炎症至关重要。对于治疗应用，与tgf-β的整体抑制相比，抑制αvβ6介导的tgf-β抑制是可取的。在bp2中，环2被定位为赋予两个整合素之间的特异性(图2j)：环2中的k39面对β6亚基中的e963和β8中的k901(图2j)。不同于αvβ8，bp2在使用稳定表达αvβ6/αvβ8的k562细胞进行的细胞表面结合试验中，对αvβ6的特异性大于5000倍。在这个位置有丙氨酸(a39)的bp1特异性要低得多(图2k)。bp1和bp2不会与其他rgd结合整合素发生交叉反应，包括αvβ1、αvβ3、αvβ5、α5β1、α8β1和αiibβ3(在使用稳定转染不同rgd结合整合素的k562细胞进行的细胞表面结合实验，浓度高达200nm)。[0136]为了进一步提高蛋白质稳定性，我们使用rosettatm扫描设计上的成对位置，以引入具有最佳几何形状的二硫键，并选择四个变体(每个构建物两个)进行实验表征。通过体积排除色谱，有或没有二硫键的两个版本的蛋白质都以单分散峰的形式洗脱。设计的圆二色性(cd)光谱示出了两个以208和222nm为中心的极小值，与混合α/β折叠一致(数据未示出)。二硫键的引入使这两种蛋白质高度耐热，根据非还原条件下的cd光谱数据(数据未示出)，它们在95℃维持二级结构。我们选择了其中两种蛋白质(bp1_disulf和bp2_disulf)进行进一步的体外和体内表征。bp1_disulf和bp2_disulf均可通过在85℃下煮沸10min从大肠杆菌细胞裂解物中一步纯化(图9)。bp2_disulf以亚纳摩尔亲和力与αvβ6结合，rgd到kge的敲除突变废止了其与受体的结合，证实rgd环是结合所必需的。[0137]我们解决了bp1的二硫化物稳定版本的晶体结构，该版本以亚纳摩尔亲和力与αvβ6结合，并且在95℃下bp1_disulf在xxarmsd下不熔化。晶体结构与设计模型非常匹配，均方根偏差(r.m.s.d.)为(图2h)。在晶体结构中，二硫键也采用了与所述设计模型类似的构象(图2i)。大多数核心疏水残基采用与设计模型相同的旋转异构体。与大多数设计的蛋白质抑制剂不同，bp1_sulf中的大多数相互作用是由环介导的。有三个环与αvβ6接触：1)rgd环2)环1和3)环2(图2f)。设计的rgd结合环长度为5个残基，采用与设计模型几乎相同的骨架构象(图2j)。除精氨酸外，回路上的所有残基均采用与设计模型类似的旋转异构体(图2j)。紧接着是rgd环，latl基序形成了一个两亲螺旋，可以紧贴β6亚基上的疏水沟。此前，已有研究表明，αvβ6不仅识别rgd环，还识别由lxxl(seq id no：33)基序形成的两亲螺旋，所述基序仅与β6相互作用，并提供了rgd序列以外的配体结合特异性和识别的蓝图。环1连接片层2和片层3使之与被设计为ggga-abego型的β6亚基接触。环2连接螺旋2和片层4使之与被设计为baab-abego型的αv亚基(图1f)接触。在晶体结构中，这两个环采用与设计模型几乎相同的主链构象(图2h)。在复合物的设计模型中，环1上的asn37与受体的β6亚基的asp901形成氢键，并与αvβ6中的ca(ii)原子处于配位距离内，而αvβ8则不存在这种配位距离。在设计的结构中，环1理想的定位以赋予β亚基特异性，提供容易获得整合素亚型特异性设计抑制剂的途径。[0138]bp2-disulf可降低博莱霉素激发小鼠的纤维化负担，并恢复肺功能：[0139]ipf是一种进展性疾病，其特征是在肺内形成瘢痕组织，诊断后的中位生存时间为3至5年。患者出现进行性呼吸短促和肺功能损害，表现为用力肺活量(fvc)降低、扩散减少、氧合减少，最终出现呼吸衰竭。肺纤维化的进展部分是由于αvβ6整合素激活tgf-β使smad 2/3通路恶化。在tmlc试验中确认bp2可以特异性阻断αvβ6介导的tgf-β信号后，我们研究了该分子在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化中的治疗效果。[0140]12周龄的雄性c57bl/6小鼠气管内注入50微升博莱霉素(1mg/kg体重)。从博莱霉素滴注后第7天开始，至第19天结束，每隔一天向小鼠腹腔注射bp2_disulf结合物，与未经治疗的小鼠相比，共进行了7次治疗(数据未示出)。与ny组相比，博莱霉素(blm、博莱霉素并用bp_2disulf处理)组的体重减轻(约为初始体重的5-8％)(数据未示出)。然而，与blm组相比，bp2_disulf处理可减少肺损伤后14天的总体体重减轻(数据未示出)。使用微型ct扫描仪获得小鼠的高分辨率肺部扫描，并允许纤维化的发展的实时可视化。肺部损伤最早可在第7天被发现，并在第14天和第21天成明显的(数据未示出)。使用bp2_disulf处理，到第21天，肺组织没有出现blm小鼠中普遍存在的大纤维化病变(数据未示出)。bp2_disulf处理的小鼠确实因博莱霉素攻毒而受到损伤，但损伤没有blm组那么严重。bp2_disulf处理小鼠的肺形态显示出纤维化病变，但维持了博莱霉素攻毒小鼠不存在的肺泡空隙(数据未示出)。未经治疗的小鼠呈现出4.107％的纤维化负荷，博莱霉素攻毒的小鼠呈现出11.01％的纤维化负荷，bp2_disulf处理的小鼠呈现出6.857％的纤维化负荷(数据未示出)。与blm组相比，bp2_disulf和nt小鼠的纤维化负荷显著降低。通过将亨氏(hounsefield)单位强度划分为若干个单元，并对扫描图像进行采样，以获取单元强度的频率，从而收集组织密度的频率。组织密度分布示出了博莱霉素损伤小鼠扫描图像向右偏移，表明与nt和bp2_disulf处理组小鼠相比，致密组织增加。bp2_disulf处理组的分布和nt分布相当(数据未示出)。tris，150mm nacl，ph＝8.0，1％bsa，1mm ca(ii)和1mm mg(ii)，洗涤缓冲液20mm tris，150mm nacl，ph＝8.0，0.5％bsa，1mm ca(ii)和1mm mg(ii)。[0148]ssm文库是根据之前描述的方案，通过对每个位置使用突变引物(序列见下文)生成的。产生的文库通过重复电穿孔(生物学重复)转入酵母。分选分两轮进行：首先用4um胰蛋白酶和0.8um糜蛋白酶处理文库5分钟，然后用200pm生物素化αvβ6标记，并收集前5％的结合物。在第二轮和最后一轮选择中，使用100pm的生物素化αvβ6和不合格率进行选择。对于所述不合格率选择步骤，将500nm未涉及的纯化av6_3添加到细胞中，并在37℃下翻滚1小时，然后对结合群体的前1％进行选择(图8)。从分类前后的文库中提取dna并进行条形码编码。在使用illumina对文库进行测序后，计算富集率。[0149]蛋白质表达和纯化：编码蛋白质变体的基因以来自idt的gblock基因片段的形式排列，并在具有c-末端组氨酸的ndei/xhoi限制性位点之间的pet29b中克隆。使用studier自诱导技术，在25℃的标准摇瓶中36小时，在bl21(de3*)中表达这些蛋白质的所有突变变体。收集细胞并在20mm tris、250mm nacl和20mm咪唑(裂解缓冲液)中再悬浮。使用微射流机裂解细胞，并以24000g离心45分钟分离细胞碎片。首先使用标准ni-nta亲和柱纯化可溶性蛋白质，然后在ge-akta纯化fplc系统上进行体积排除色谱(s7510/300增加)。收集对应于单体蛋白质的峰，并通过质谱进一步验证。对于博莱霉素诱导的ipf模型，进一步纯化蛋白质以达到内毒素水平《5eu/ml。[0150]设计的蛋白质的生物素化：为了产生单生物素化蛋白质，将avi标签序列(glndifeaqkiewhe；seq id no：34)引入蛋白质的n端。通过共转化感兴趣的蛋白质和pbira(用于体内生物素化的编码大肠杆菌生物素连接酶的载体)；或使用纯化的蛋白质和体外生物素化试剂盒，使用制造商的方案形成亲和性，对蛋白质进行生物素化。通过质谱进一步证实了生物素化。[0151]设计的蛋白质的结构分析：[0152]为了确定bp1_disulf的晶体结构，我们用nterm-tev可切割his标签表达了bp1_disulf。蛋白表达和纯化后，用(1/100)稀释的储存tev蛋白酶处理bp1_disulf，并在室温下对tbs进行透析过夜。在通过sds-page凝胶监测的切割完成后，蛋白质在第二重力ni-nta柱上运行，以从切割的蛋白质中分离切割的his标记和his标记的tev。在his标签裂解后，将蛋白质浓缩至约50mg/ml，并进行结晶试验。结合蛋白和bp1_disulf在24℃下通过蒸汽扩散结晶，方法是与等量的储层溶液混合：分别为0.2m kno3、20％peg3350和0.2m k3citrate、20％peg3350。晶体在含有15％peg200的贮存溶液中短暂冷冻浸泡，并在液氮中快速冷冻。使用mar225 ccd探测器在-173℃的先进光子源(aps)的gm/ca束流线上收集衍射数据，并使用xds进行处理。有趣的是，结合蛋白的衍射数据最初被缩放到p6122空间群，c轴1/3和2/3处具有大的patterson峰，表明沿着c轴有两个翻译的ncs分子。使用设计的模型找到了解决方案。模型在rosettatm中进行了修正，然后用phenix.autobuild进行了重建。autobuild能够重建模型的大部分序列，但r和rfree仍然非常高，在44％/47％的水平上具有较好的电子密度图。然后，数据被重新缩放到p31空间群，结构被修正，每个不对称单元包含12个分子，具有四面体孪晶(twinning)。autobuildtm用于构建三分之一的序列，并在coot中手动构建和使用phenix tm和refmactm精细化的许多迭代步骤的前几个步骤中多次使用。molprobitytm用于验证最终结构。[0153]表6x射线衍射的统计与结构修正[0154][0155][0156]a括号中的数字表示最高分辨率的shell。[0157]b rmerge＝sh si|ii(h)-《i(h)》|/shsi ii(h)，其中ii(h)和《i(h)》是ith，意味着反射强度h的测量。[0158]c每种唯一反射28的随机半数据集平均强度之间的皮尔逊相关系数。[0159]d sh||fobs(h)|-|fcalc(h)||/sh|fobs(h)|，其中fobs(h)和f calc(h)分别是观察到的和计算出的结构系数。no i/s(i)删除已应用。[0160]e用molprobity18计算。[0161]所设计的蛋白质的生物物理表征：[0162]使用jasco-1500 cd仪器测量蛋白质的二级结构和热稳定性。对于正常波长扫描，使用tbs中10-15um的蛋白质(20mm tris，50mm nacl，ph＝8.0)。cd光谱的测量范围为240-195nm，扫描速度为100nm/min。对于热熔融实验，222nm处的信号强度作为温度(4℃-95℃)的函数进行监测，温度梯度为2℃/min。测量前，样品在规定温度下保持至少5秒。为了研究工程化二硫键对稳定性的作用，向蛋白质中添加1毫米tcep，以测量还原条件下的热稳定性。[0163]用于测定蛋白质结合动力学的生物层干涉：[0164]数据收集在octettm red96(forte bio)上，并使用仪器软件进行处理。his标记的蛋白质结合物被固定在ni-ntaoctet传感器上。然后将尖端浸入含有不同浓度αvβ6的孔中。分别记录900秒和1200秒的结合和分离步骤。包括一个没有负载结合蛋白的空传感器，以丢弃αvβ6与octet尖端的任何非特异性结合。[0165]设计的结合物的荧光标签：[0166]对于体外结合试验和体内成像实验，设计的结合物分别用alexa fluortm 488 c5马来酰亚胺和alexafluortm 680 c2马来酰亚胺(thermo fisher scientific)，通过c端单个半胱氨酸变体来标记。在一个典型的标记实验中，在室温下用1mm tcep还原50-200μm蛋白质30分钟。向蛋白质溶液中加入3-5mol过量的马来酰亚胺，并在室温下翻滚过夜。然后在s75-10/300柱上纯化反应混合物，以从标记的蛋白质中分离游离染料。通过质谱进一步证实荧光团偶联。[0167]使用荧光标记的结合物的体外结合试验：[0168]表皮样癌细胞(a431)和人类胚胎肾293t细胞(hek 293t)从美国模式培养物集存库(atcc)购买，并在添加10％胎牛血清(fbs，gibco)的dulbecco改良eagle培养基(dmem,gibco)中，在37℃下，在5％co2的湿空气中进行生长。在a431癌细胞中进行结合试验。用无酶细胞解离缓冲液(gibco)从培养瓶中分离a431细胞。将不同浓度的ag-af488和e13t-af488与5x104a431细胞在含有0.1％bsa、1mm ca2+和1mm mg2+(btb)的1x tbs中孵育，在4℃下悬浮旋转，孵育5小时。使用足够的孵育体积以避免配体消耗超过5％。培养后，用btbs清洗细胞，并在accuritm c6仪器(bd biosciences)上通过流式细胞仪进行分析，并使用flowjotm软件(treestar)对数据进行量化。kd值通过使用prismtm 7(graphpad software)将数据拟合到一个位点特异性结合曲线来确定。[0169]使用tmlc分析，通过设计的抑制剂抑制αvβ6介导的tgf-β激活：[0170]表7给出了tmlc分析所用试剂的商业来源和说明。[0171]表7[0172][0173][0174]重组人tgfb1(r&d系统，目录240-b-010)[0175]根据制造商方案使用的荧光素酶检测系统(promega，目录e1501)[0176]reporter裂解缓冲液5x：5x(promega e397a)[0177]96孔细胞培养板(costar目录7107)[0178]96孔白底白壁聚苯乙烯optiplatestm(perkin elmer 6005290)[0179]抗体[0180]抗tgfb1，2，3migg1克隆1d11(r&d mab1835-500)0.5mg/ml[0181]小鼠igg1同型对照克隆11711(r&d mab002)0.5mg/ml[0182]抗av(cd51)migg1克隆l230(enzo alx-803-304-c100)0.1mg/ml[0183]抗avb6 3g9(内部)higg1 sp16-106 10.21mg/ml[0184]nip228 higg1(3g9的同型)(内部)[0185]抗avb8(内部)[0186]nip228 higg1(抗avb8的同型)(内部)[0187]抗avb6/b8 264rad(内部)bpd.95 sp10-362 10.45mg/ml[0188]tmlc检测的详细方案：[0189]共培养检测装置[0190]检测培养基：dmem+1％fbs+pen/strep[0191]1.使用accutase从烧瓶中取出tmlc细胞1lf，[0192]在10ml pbs中洗涤，并添加5ml accutase/烧瓶，[0193]在37℃下培养3-5分钟，[0194]加入检测培养基，旋转300x g 5分钟，[0195]在5ml检测培养基中悬浮并计数，[0196]悬浮在55ml检测培养基中，3.3e6/ml，总计1.65e7。[0197]2.使用台盼蓝排除法计数后，将细胞悬浮在浓度为300000细胞/ml的分析培养基中。[0198]3.在96孔组织培养板的适当孔中，每孔添加50ul细胞悬浮液(15000个细胞/孔)(见板布局)。[0199]4.将细胞放置3小时，以便tmlc粘附。[0200]5.以2倍最终浓度制备abs和结合蛋白。[0201]6.将200μl abs、结合蛋白或培养基添加到96孔深的pp板中的适当孔中。[0202]7.制备2μg/ml rhtgf-b1检测培养基中，[0203]储备量为20μg/ml：10000倍稀释(1/100，然后1/100)，[0204]2μl+198μl培养基，[0205]15μl(1/100)+1485μl培养基。[0206]准备浓度为2倍的细胞[0207]1)使用accutase从烧瓶中取出hela b8细胞。使用台盼蓝排除法计数后，以300000个细胞/ml悬浮细胞)，[0208]在42.1ml中，2.52e6/ml，总悬浮1.263e7。[0209]2)取大约数量的k562亲代和avb6转染细胞(30ml)，300x g旋转5分钟。在5ml检测培养基中重新悬浮细胞颗粒并计数。以1.2×106/ml的浓度悬浮细胞。[0210]k562亲代悬浮于17.7ml，4.25e6/ml，总计2.125e7。[0211]k562avb6悬浮于11.4ml，2.725e6/ml，总计1.36e7。[0212]3)将200μl细胞或培养基或2x rhtgf-b1添加到含有结合蛋白、抗体或培养基的深孔pp板中的适当孔中(参见步骤6)。[0213]4)在室温下孵育15分钟，使结合蛋白/抗体与细胞(tgf-b)结合。[0214]5)抽吸培养基，并将细胞+/-abs、培养基或1ng/ml rhtgf-b1+/-abs以100μl/孔添加到适当的孔中(见板布局)。[0215]6)在测量荧光素酶活性之前，将细胞在37℃、5％co2下培养18-20小时。[0216]荧光素酶检测[0217]1.使用多通道去除70ul培养上清液，并在-80℃下储存在96孔u底聚丙烯板中，以备日后检测细胞因子/基质金属蛋白酶。[0218]2.用200ul/孔pbs清洗细胞两次(清洗之间进行抽吸)，丢失k562细胞也不影响。[0219]3.向每个孔中加入100μl 1×reporter裂解缓冲液(1份5x裂解缓冲液+4份蒸馏水)，并在-80冷冻柜中冻融细胞，以充分裂解细胞。[0220]4.通过将荧光素酶检测缓冲液解冻至室温制备荧光素酶检测缓冲液，然后将其添加到冻干荧光素酶检测底物中。[0221]5.将80μl细胞裂解物转移至白色透明底板，并添加100μl荧光素酶检测试剂。[0222]6.立即在光度计上读取信号。[0223]envision超灵敏发光(96)分析[0224]统计分析[0225]所有值均报告为平均值±标准差。数据分析采用单因素方差分析，然后采用tukey事后检验进行多重比较。使用graphpadtm prism 6.0(graphpad，圣迭戈，美国)进行分析和绘图。p值《0.05的结果被认为具有统计学意义。[0226]本文报告的所有设计和进化的变体的序列：见表4[0227]对本发明实施方案的描述并非旨在详尽无遗或将本发明限制为所公开的精确形式。本文描述本发明的具体实施方案和示例是为了起到说明的目的，但如相关领域的技术人员所认知的，在本发明的范围内可以进行各种等效修改。









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