一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法与流程

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法。背景技术：2.脊髓损伤是一种高致残率，高死亡率的急性创伤性疾病。脊髓损伤后神经元回路的建立对脊髓功能的恢复至关重要，神经元回路与生理功能之间关系的检测也是研究过程中的关键部分。3.目前，电生理技术是其中的一种检测手段，但是现有的电生理技术有着诸多局限性，比如体内动作电位检测只允许对大量神经元进行记录，对神经元之间的联系无法评价；而膜片钳技术只能对单个细胞进行检测，对组织多个细胞时间与空间上电信号的变化无法实现同时监测。4.活体脊髓切片可以做到体外多位点、多层次电信号的记录，可检测神经环路的完整性，可研究原有神经环路不同神经元之间的相互作用。目前相关文献已经证实活体脊髓能够检测出电信号。5.与活体动物相比，离体脊髓切片排除了血脊髓屏障，可直接检测脊髓神经元的放电情况，也可同时检测多个截面上脊髓神经元的电信号；改变灌流人工脑脊液或气体成分即可控制标本环境，调节或改变神经元兴奋性，也有利于长时间观察。体外检测神经元电生理活动使研究者能够观察到在脊髓损伤模型中在不同剂量、作用时间等条件下神经元的病理生理改变。6.然而，目前活体移植放入电极或者离体组织膜片钳这些技术很难实现从时空两个维度同时稳定监测多个神经元连续的电信号活动。7.多电极阵列(multi-electrode array,mea)是一种表面由多个微电极构成的设备，可以测量由动作电位产生的细胞外场电位，也可以刺激细胞，以研究心脏病学和神经科学中细胞群体的电生理，同时也为神经元回路连接的研究提供了可能性。技术实现要素：8.为了克服现有技术的缺陷，申请人提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法，实现了从时空两个维度同时监测神经元群体的生理活动，从而为脊髓损伤微环境调控，神经回路的有效建立带来了一种新的检测手段。9.因此，本发明的目的是提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法。10.本发明采用如下技术方案来实现。11.本发明提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法，该方法包括如下步骤：12.(1)将脊髓从活体中快速取出，在液体微环境中保持脊髓细胞的活性，得到离体脊髓；13.(2)用震荡切片机对步骤(1)取出的离体脊髓进行切片，得到离体脊髓切片；14.(3)采用多电极阵列对步骤(2)得到的离体脊髓切片进行检测。15.优选地，在步骤(1)中，所述脊髓取自哺乳动物，例如人，大鼠等。16.优选地，在步骤(1)中，所述脊髓在2-3分钟内取出。17.优选地，在步骤(1)中，所述液体微环境的构成为：低温，氧气和二氧化碳的存在下，人工脑脊液、神经营养因子nt3、神经营养因子bdnf和蔗糖溶液。18.优选地，所述人工脑脊液与所述蔗糖溶液的体积比为3：1-5：1，优选为4：1。19.优选地，所述神经营养因子nt3的浓度为40ng/ml-60ng/ml；优选为50ng/ml。20.优选地，所述神经营养因子bdnf的浓度为10ng/ml-50ng/ml，优选为30ng/ml。21.优选地，所述蔗糖溶液的浓度为230mmol/l-250mmol/l，优选为230mmol/l。22.优选地，所述氧气的浓度为92％-98％，优选为95％。23.优选地，所述二氧化碳的浓度为2％-8％，优选为5％。24.优选地，所述低温是指温度为0～-5℃，优选为0℃。25.优选地，在步骤(3)中，检测时间为1-20分钟。26.采用本技术的方法成功检测到多个神经元同时连续放电的电信号。27.本发明能够实现从时空两个维度同时稳定监测多个神经元连续的电信号活动，进而为脊髓损伤神经回路的研究带来了一种成熟稳定的新技术。本发明适用于神经退行性疾病、脊髓损伤、脑损伤的基础研究中，此技术可以帮助我们去探索神经元细胞在不同疾病模型中的不同时期的一些病理机制，从而达到时空两个维度全面掌握神经元细胞的生理状态。脊髓损伤的治疗需要在损伤中心建立起新的神经元回路连接，而此技术可以作为其中的检测手段。附图说明28.图1为实验用的2个月雌性wistar大鼠照片。29.图2为从大鼠中取出离体脊髓的照片。30.图3为将去除的离体脊髓置于液体微环境中。31.图4为去除硬膜的照片。32.图5为将活体离体脊髓放入事先准备好的琼脂糖块上的照片。33.图6为将活体离体脊髓进行震荡切片的照片。34.图7为将切好的脊髓切片放到待测板上的照片。35.图8实施例1检测得到的放电热图。36.图9实施例1检测得到的神经元细胞连续放电波形图(局部放大图)。37.图10实施例1检测得到的神经元细胞连续放电波形图。38.图11实施例1检测得到的频率点图。39.图12对比例1检测得到的放电热图。40.图13为实施例2的实验结果，左侧为热图，右侧为波形图。41.图14为实施例3的实验结果，左侧为热图，右侧为波形图。具体实施方式42.以下将结合具体实施例详细解释pd在防治呼吸道炎症疾病中的应用以及具体药物的技术方案。43.以下实施例中使用的仪器及试剂如下：44.多孔微电极阵列(mea)系统，厂家：axion biosystems；品牌：maestro；型号：pro。45.震荡切片机，厂家：leica biosystems,品牌：leica；型号：vt1000swistar大鼠，公司：北京维通利华实验动物技术有限公司。46.人工脑脊液，公司：北京酷来搏科技有限公司，产品编号：sl6630-500ml。47.nt3蛋白；神经营养因子3(nt3)重组蛋白，品牌：lmai bio，型号规格：50μg。48.bdnf蛋白；脑源性神经营养因子(bdnf)重组蛋白，品牌：卡特彼勒，货号：50240-mnas，规格：20微克。49.蔗糖试剂；公司：阿拉丁；产品编号s112236，规格：1kg。50.实施例1一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法51.本实施例提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法，该方法包括如下步骤：52.1、准备wistar大鼠，麻醉(雌雄都可以，品系无差别，可以选取从新生鼠到成熟大鼠)，本实验采取2个月雌性wistar大鼠，见图1。53.2、充分暴露，取出离体脊髓(最好在2-3分钟内完成)，见图2。54.3、构建离体脊髓体外适宜的液体微环境，在液体微环境中保持脊髓细胞的活性，得到离体脊髓，见图3；55.其中，所述液体微环境的构成为：低温，氧气和二氧化碳的存在下，人工脑脊液、神经营养因子nt3、神经营养因子bdnf和蔗糖溶液。56.所述神经营养因子nt3浓度：50ng/ml。57.神经营养因子bdnf浓度：30ng/ml。58.蔗糖溶液浓度：230mmol/l。59.氧气浓度：95％。60.二氧化碳浓度：5％。61.人工脑脊液与蔗糖溶液的体积比：4：1。62.低温条件：0度。63.4、去除硬膜，见图4。64.5、将活体离体脊髓放入事先准备好的琼脂糖块上(琼脂糖块制备好也要低温0度放置)，见图5。65.6、将活体离体脊髓进行震荡切片(采用leica vt1000s震荡切片机进行活体离体脊髓切片)，见图6。66.7、将切好的脊髓切片放到待测板上(待测板为axion biosystems公司mea检测系统6孔专用板)，见图7。67.8、上机检测68.结果如图8-图11所示。69.从图8的放电热图上，可看到多个电极同时检测到了电信号，实现了多个神经元细胞同时放电。70.从图9-10的神经元细胞连续放电波形图，可观察典型神经元细胞自发放电的波形信号，且同时出现多个波形曲线。71.从图11的频率点图，可观察到神经元细胞可以自发连续放电。72.实施例2一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法73.本实施例提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法，该方法包括如下步骤：74.1、准备wistar大鼠，麻醉(雌雄都可以，品系无差别，可以选取从新生鼠到成熟大鼠)，本实验采取2个月雌性wistar大鼠。75.2、充分暴露，取出离体脊髓(最好在2-3分钟内完成)。76.3、构建离体脊髓体外适宜的液体微环境，在液体微环境中保持脊髓细胞的活性，得到离体脊髓；77.其中，所述液体微环境的构成为：低温，氧气和二氧化碳的存在下，人工脑脊液、神经营养因子nt3、神经营养因子bdnf和蔗糖溶液。78.所述神经营养因子nt3浓度：40ng/ml。79.神经营养因子bdnf浓度：10ng/ml。80.蔗糖溶液浓度：230mmol/l。81.氧气浓度：92％。82.二氧化碳浓度：2％。83.人工脑脊液与蔗糖溶液的体积比：3：1。84.低温条件：0度。85.4、去除硬膜。86.5、将活体离体脊髓放入事先准备好的琼脂糖块上(琼脂糖块制备好也要低温0度放置)。87.6、将活体离体脊髓进行震荡切片(采用leica vt1000s震荡切片机进行活体离体脊髓切片)。88.7、将切好的脊髓切片放到待测板上(待测板为axion biosystems公司mea检测系统6孔专用板)。89.8、上机检测90.结果如图13所示。91.实施例3一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法92.本实施例提供一种多电极阵列检测离体脊髓切片的方法，该方法包括如下步骤：93.1、准备wistar大鼠，麻醉(雌雄都可以，品系无差别，可以选取从新生鼠到成熟大鼠)，本实验采取2个月雌性wistar大鼠。94.2、充分暴露，取出离体脊髓(最好在2-3分钟内完成)。95.3、构建离体脊髓体外适宜的液体微环境，在液体微环境中保持脊髓细胞的活性，得到离体脊髓；96.其中，所述液体微环境的构成为：低温，氧气和二氧化碳的存在下，人工脑脊液、神经营养因子nt3、神经营养因子bdnf和蔗糖溶液。97.所述神经营养因子nt3浓度：60ng/ml。98.神经营养因子bdnf浓度：50ng/ml。99.蔗糖溶液浓度：250mmol/l。100.氧气浓度：98％。101.二氧化碳浓度：8％。102.人工脑脊液与蔗糖溶液的体积比：5：1。103.低温条件：-5度。104.4、去除硬膜。105.5、将活体离体脊髓放入事先准备好的琼脂糖块上(琼脂糖块制备好也要低温0度放置)。106.6、将活体离体脊髓进行震荡切片(采用leica vt1000s震荡切片机进行活体离体脊髓切片)。107.7、将切好的脊髓切片放到待测板上(待测板为axion biosystems公司mea检测系统6孔专用板)。108.8、上机检测109.结果如图14所示。110.对比例1111.本实施例采用与实施例1相同的方法，区别仅在于，液体微环境的构成为：112.所述神经营养因子nt3浓度：20ng/ml。113.神经营养因子bdnf浓度：5ng/ml。114.蔗糖溶液浓度：220mmol/l。115.氧气浓度：90％。116.二氧化碳浓度：10％。117.人工脑脊液与蔗糖溶液的体积比：2:1。118.低温条件：0度。119.结果如图12所示，可以看出，测出的是单个放电或者少量神经元同时放电，甚至有些时候检测不到神经元放电。









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