一种检测金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒和方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种检测金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒和方法。背景技术：2.金黄色葡萄球菌是一种常见的人类病原体，其可分泌多种毒力因子(肠毒素、溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶等)，具有很强的致病性。金黄色葡萄球菌可以引起广泛的临床感染，从局部的皮肤和软组织感染到危及生命的坏死性肺炎，脓毒血症等。同时，它也是骨关节、胸肺、和医院设备相关感染的主要原因。因此，开发一种可靠、快速、准确的诊断方法用于金黄色葡萄球菌的检测，是临床上的迫切需求。3.传统的金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括：细菌培养法、免疫学方法、分子诊断方法。细菌培养法是临床微生物检测的常规方法。具有操作简便，所需设备简单，成本相对较低的优点。但其检测周期过长，通常需要2-5天才能得出诊断结果。为此，许多病人可能会错过最佳治疗期。此外，诊断结果出来前的临床经验性用药可能导致细菌产生耐药性。免疫学方法易受抗体纯度或质量影响，存在较为严重的交叉反应，假阳性多。分子诊断方法具有很高的灵敏度和特异性，并且可在短时间内完成检测。pcr方法，可以快速、灵敏地检测金黄色葡萄球菌，但pcr检测需要昂贵的实验仪器、试剂和熟练的操作人员，这不利于在基层医疗单位推广。4.随着分子生物学的发展和人们不断对传统核酸扩增技术的改进，2000年notomi等人报道了一种快速、便捷的核酸扩增方法：环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)。lamp技术利用四条引物来识别目标序列，具有高选择性和良好的扩增特异性。它可以在等温条件下(65℃左右)，一小时内将微量的初始dna拷贝扩增到一百万个拷贝，而且不需要模板的预变性。反应结果可通过浊度、电泳、荧光及比色等方法进行检测。lamp技术相比于传统技术具有反应时间短、操作简单等优势，但其引物设计复杂，快速检测过程中稳定性和准确率与常规pcr相比尚有一定差距。5.目前已有研究人员建立了基于lamp技术的检测金黄色葡萄球菌的方法，例如张小雨等人以金黄色葡萄球菌的nuc基因(genbank no.dq507379.1)为靶基因，设计引物构建了金黄色葡萄球菌的lamp检测方法，特异性良好，最低检测线27copies/μl，达到pcr方法的100倍(张小雨,王雯雯,马臣杰,吴晓玲,邓光存.金黄色葡萄球菌lamp检测方法的建立及应用[j].农业生物技术学报,2021,29(09):1845-1854.)；koide等人基于meca和spa基因作为靶基因构建了金黄色葡萄球菌的lamp检测方法，特异性高达100％，灵敏度分别为69.2％、52.9％(koide y,maeda h,yamabe k,et al.rapid detection of meca and spa by the loop-mediated isothermal amplification(lamp)method.[j].letters in applied microbiology,2010,50(4):386-392.)。可见，上述报道的现有技术所构建的lamp方法的检测灵敏度、准确性等方面均还有待进一步提升。[0006]因此，还需进一步探索建立更加简便、快速、准确地检测金黄色葡萄球菌的方法。技术实现要素：[0007]本发明的目的在于提供一种基于lamp技术的简便、快速、准确地检测金黄色葡萄球菌的方法。[0008]本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的引物组，它是能扩增靶基因的特异碱基序列的引物组；所述靶基因是duf1361 domain-containing protein，genbank登录号为cp038229.1，所述特异碱基序列是靶基因的第704683-705300位碱基序列，如seq id no.1所示。[0009]进一步地，它包括如下引物：[0010]外引物f3：序列如seq id no.2所示；[0011]外引物b3：序列如seq id no.3所示；[0012]内引物fip：序列如seq id no.4所示；[0013]内引物bip：序列如seq id no.5所示。[0014]本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，它包括上述的引物组。[0015]进一步地，它包括如下体积份数的各组分：[0016]10×缓冲液：2.5份、8.0u/μl的bst 2.0dna聚合酶：1份、100mm的硫酸镁水溶液：1.5份、10mm的dntp水溶液：3份、5m的甜菜碱水溶液：4份、10μm的外引物f3水溶液：0.5份、10μm的外引物b3水溶液：0.5份、10μm的内引物fip水溶液：4份、10μm的内引物bip水溶液：4份、水：2份；[0017]所述10×缓冲液中含有200mm的ph为8.8的tris-hcl、500mm的氯化钾、100mm的硫酸铵、20mm的硫酸镁和1％v/v的吐温-20。[0018]进一步地，上述水为无酶水。[0019]进一步地，上述试剂盒还包括显色剂，所述显色剂为羟基萘酚蓝、sybrtm green i、溴化乙啶或钙黄绿素；优选为羟基萘酚蓝。[0020]更进一步地，上述羟基萘酚蓝的用量为：1体积份的3mm羟基萘酚蓝水溶液。[0021]本发明还提供了一种检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：[0022](1)提取待测样品基因组dna；[0023](2)将步骤(1)提取的dna与上述的试剂盒的各组分混合形成反应体系；[0024](3)将步骤(2)得到的反应体系在60～65℃扩增反应30～60分钟，再于75～85℃保持1～3min终止反应。[0025](4)采用凝胶电泳法检测和/或肉眼观察得到扩增结果。[0026]进一步地，若上述反应体系中不含显色剂，步骤(4)采用凝胶电泳检测得到扩增结果。[0027]进一步地，若上述反应体系中含有显色剂，步骤(4)采用肉眼观察得到扩增结果。[0028]本发明的有益效果：本发明以一段金黄色葡萄球菌的特异基因duf1361domain-containing protein(genbank登陆号为cp038229.1(704683-705300))为靶基因，设计引物并构建了lamp反应体系，采用羟基萘酚蓝(hbn)显色剂反映扩增结果从而指示检测结果，可以通过肉眼对扩增结果进行判读，无需昂贵的仪器和繁琐的电泳分析即可实现可视化检测，并且检测快速、准确，特异性和灵敏度高，具有很好的推广应用价值。[0029]本发明所述无酶水为无核酸酶水。[0030]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0031]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明[0032]图1为hnb染料浓度优化结果。[0033]图2为lamp方法的特异性评估结果：a：肉眼可视化结果；b：电泳结果。[0034]图3为lamp方法的灵敏度评估结果：a：肉眼可视化结果；b：电泳结果。[0035]图4为lamp方法的临床诊断效率评估结果：a：肉眼可视化结果；b：电泳结果。具体实施方式[0036]本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施例中所用的材料及试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。[0037]本发明各实施例中部分材料为：bst 2.0dna聚合酶购自new england biolabs公司；甜菜碱(分析纯)，dntp购自生工生物工程股份有限公司；hnb购自阿拉丁试剂有限公司；载体，trans1-t1化学感受态细胞购自全式金生物技术有限公司；快速质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司。[0038]菌株：金黄色葡萄球菌标准株1株(atcc 25923)，非金黄色葡萄球菌标准株14株[肠道沙门氏菌(atcc 14028)、粘质沙雷氏菌(cmcc b 41002)、阴沟肠杆菌(cmcc b 45301)、肺炎克雷伯菌(cmcc b 46117)、粪产碱杆菌(atcc 8750)、大肠杆菌(atcc 25922)、粪肠球菌(atcc 29212)、表皮葡萄球菌(atcc 12228)、福氏志贺菌(atcc 12022)、痢疾杆菌(cmcc b 51105)、铜绿假单胞菌(atcc 27853)、副溶血性弧菌(atcc 17802)、溶藻弧菌(cicc 21664)、屎肠球菌(atcc 19434)]。注：atcc,美国模式培养物集存库；cmcc,中国医学细菌保藏管理中心；cicc，中国工业微生物菌种保藏管理中心。[0039]实施例1、本发明试剂盒[0040]本发明的试剂盒包括如下组分和用量(25μl体系)：[0041]原料用量10×缓冲液2.5μl8.0u/μl bst 2.0dna聚合酶1.0μl100mm mgso4(mg2+)1.5μl10mm dntp3.0μl5m甜菜碱4.0μl10μm f30.5μl10μm b30.5μl10μm fip4.0μl10μm bip4.0μl3mm hnb1.0μl无酶水2.0μl[0042]*其中，10x缓冲液由200mm tris-hcl(ph 8.8@25℃)，500mm kcl，100mm(nh4)2so4，20mm mgso4，1％v/v吐温-20组成。[0043]其中，hnb的用量可变，还可以为0μl、0.50μl,0.75μl,1.00μl,1.25μl,1.50μl。[0044]实施例2、本发明lamp检测体系构建与检测方法[0045](1)提取待测样品(菌株)的基因组dna：配制样本预处理液：a液(125mm naoh,1mm edta,0.1％吐温20)；b液(250mm hcl,10mm tris-hcl)。若原始材料为液体培养基样本，取1ml进行离心，10000rpm 1min，去除上清，生理盐水漂洗两次；若为固体培养基培养，直接挑取单菌落，生理盐水漂洗；将上述所得菌体样本中加入样本预处理a液，65℃裂解10min后，再加入样本预处理b液，于10000rpm离心5min，所得上清液即为样品dna模板。[0046](2)在以实施例1的试剂盒作为扩增体系的基础上，构建lamp反应体系：[0047]在200ulep管中配制25μl反应体系，体系中含有(如下浓度均是指反应体系中的终浓度)：1×缓冲液[20mm tris-hcl(ph 8.8@25℃)，50mm kcl，10mm(nh4)2so4，2mm mgso4，0.1％吐温-20]、0.32u/μl bst 2.0dna聚合酶、8.0mm mg2+(包括了来自于1×缓冲液的终浓度2mm的mgso4的mg2+，以及额外添加的来自于终浓度6mm的mgso4的mg2+)、1.2mm dntp、0.8m甜菜碱、120μm hnb、0.2μm的f3和b3、1.6μm的fip和bip、1.0μl步骤(1)提取的基因组dna(基因组dna用量可变)、无酶水，混匀。[0048]将上述反应体系置于64℃恒温反应45min，最后于80℃保持2min以终止反应。[0049]每次反应设置空白对照(以无酶水代替金黄色葡萄球菌基因组模板)。反应结束后以目测法观察扩增结果(阳性结果为天蓝色，阴性结果为淡紫色)并以电泳法进行结果再验证。[0050]以下通过实验例证明本发明的有益效果。[0051]实验例1、hnb染料浓度优化[0052]基于实施例2中所构建的lamp检测体系，将hnb为设置60、90、120、150、180μm，5个浓度梯度，从中筛选最佳浓度用于后续可视化检测。[0053]结果见说明书附图1，从图中可以看出，hnb浓度不低于120μm时蓝色与紫色显色明显，且容易区分，适于肉眼观测判别，综合考虑用量成本，最终选择终浓度为120μm的hnb作为最优选的浓度。[0054]实验例2、本发明lamp检测方法的方法学评价[0055]1、实验方法[0056](1)lamp方法特异性评估：使用实施例2的lamp反应体系的方法对15株标准细菌(金黄色葡萄球菌标准株1株(atcc 25923)，非金黄色葡萄球菌标准株14株[肠道沙门氏菌(atcc 14028)、粘质沙雷氏菌(cmcc b41002)、阴沟肠杆菌(cmcc b 45301)、肺炎克雷伯菌(cmcc b 46117)、粪产碱杆菌(atcc 8750)、大肠杆菌(atcc 25922)、粪肠球菌(atcc 29212)、表皮葡萄球菌(atcc 12228)、福氏志贺菌(atcc 12022)、痢疾杆菌(cmccb 51105)、铜绿假单胞菌(atcc 27853)、副溶血性弧菌(atcc 17802)、溶藻弧菌(cicc 21664)、屎肠球菌(atcc 19434))进行检测，根据显色反应观察结果，阳性反应显示为天蓝色，阴性显示为淡紫色。containing protein(genbank登陆号为cp038229.1)的引物进行扩增，利用羟基萘酚蓝显色实现快速的可视化检测，特异性高、灵敏度高，检测结果准确可靠，具有非常好的推广应用价值。









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