一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及色谱分离的毛细管电色谱方法技术领域，具体地说，是一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用。背景技术：2.毛细管电色谱结合了电泳的高分离效能和色谱技术的高分离选择性双重机制，具有分离效率高、快速、样品用量少等特点。毛细管柱是分离的核心，多种开管柱、填充柱和整体柱的色谱固定相的制备方法已经受到广泛的研究。3.蛋白质是极具吸引力的改性材料，也是毛细管电色谱的常用固定相修饰基团之一。关于蛋白质修饰的高效液相色谱柱的制备及其应用，在我们早期翻译的《高效液相色谱方法发展》(张维冰等译，2001，华文出版社)一书中已经有详细介绍。刘震最早采用在流动相中添加蛋白质，基于蛋白质与毛细管壁硅羟基作用，制备了动态蛋白质修饰的毛细管电色谱柱，并应用于样品分离(《色谱》，1999，刘震)。蛋白质毛细管电色谱固定相具有独特的空间立体选择性，在复杂组分和手性样品的分离中呈现独特的分析效果。目前，已有多种蛋白被用于毛细管电色谱柱的改性及手性固定相的制备，包括牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、糖蛋白及一些酶类。4.目前，已有研究报道利用蛋清中的单一蛋白质制备毛细管电色谱柱，如溶菌酶蛋白包覆的开管柱(talanta 195(2019)190–196)，可用于分离肾上腺素、异丙肾上腺素和特布他林对映体等。单一蛋白质固定相制备的色谱柱具有分离选择性明晰，制备重复性好的特点，但相应的其可提供的作用位点的种类和数量有限。另外，已有混合蛋白涂覆毛细管的方法，例如混合脂蛋白在毛细管的内壁表面形成涂层(脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，cn 101750449a)，但是该混合蛋白是通过物理吸附或者化学键合固定，并保留蛋白的生物活性和生物相容性。以不同蛋白质、采用不同的固定化方法得到的蛋白质色谱柱(包括hplc柱和cec柱)已有商品化产品，并且在手性分离、药物分析等方面得到应用。5.蛋清中天然含有多种蛋白质，最主要的包括卵清蛋白、卵转铁球蛋白、类卵黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶等。混合的蛋清蛋白可以在92.5℃以上的环境中热变性，形成具有一定强度、厚度，和孔隙结构的胶体。其二级结构和三级结构遭到破坏，得到的蛋清蛋白含有特异性的立体结构与丰富的选择位点。使用天然蛋清作为开管/聚合物整体毛细管电色谱柱能够提供更加丰富的作用位点种类和数量，可极大地拓宽该类型电色谱柱的应用范围，通过发展适当的方法，可以取得更好地分离效果。技术实现要素：6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用。7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：8.一种蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用，其特征在于，其具体制备步骤包括以下步骤：9.(1)蛋清的提取与处理；10.(2)蛋清的涂覆；11.(3)蛋清的固化；12.(4)制备好的毛细管电色谱柱的保存；13.(5)毛细管电色谱柱的应用。14.步骤(1)的具体做法是：取新鲜鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋等，分离蛋黄与蛋清并取蛋清液体，未尽部分使用滴管吸取，肉眼可见的系带部分不选取。用60rpm-500rpm磁力搅拌器搅拌3min-10min，和/或超声震荡3min-20min，搅拌至蛋清溶液至质地均匀，并混有少量气泡；在1,000rpm-10,000rpm下离心3-10min，优选为5min，然后取上层清澈液体作为蛋清储备液，占总体积的40％-50％。15.步骤(2)的具体做法是：利用自动注射泵以10μl/min-180μl/min流速，优选为50μl/min的速度将上述蛋清储备液于15℃-30℃温度下泵入经naoh处理后的熔融石英毛细管柱/已经预先原位合成了聚合物基质的毛细管整体柱内,时间为1min-2h，优选为待柱后有蛋清储备液流出后停止蛋清输送；再使用氮气等惰性气体以0.5ml/min-5ml/min的吹扫速度用0.1h-0.5h将未反应完的物质吹出柱外；为了获得更好的蛋白涂覆载量，重复反应液的冲入与吹出的步骤2～3次。16.步骤(3)的具体做法是：蛋清的固化：将涂覆好蛋清的毛细管柱首尾分别插入硅橡胶垫中密封后，放入85℃-100℃的水浴或油浴中热变性固化，固化时间0.5h-1h；蛋清热变性固化后形成的涂层均匀，厚度为0.01μm-0.2μm。17.步骤(4)的具体做法是：将制备好的蛋清涂覆的开管/聚合物整体毛细管电色谱柱用氮气吹干，立即用胶塞封口冷却后置于4℃冰箱中保存。18.步骤(5)的具体做法是：将色谱柱用于手性化合物的分离，或者在反相色谱模式、亲水色谱模式下进行样品的分离。19.特别地，相关步骤的细节为：20.步骤(1)中，可使用一种来源或混合的蛋清溶液，蛋清可以不稀释或者用纯水稀释处理，稀释倍数为体积比1:2-2:1。21.步骤(2)中，一种可行的熔融石英毛细管柱的内径为25μm,50μm,或75μm，预处理方法为依次用0.1mol/l hcl和1mol/l naoh溶液冲洗毛细管约0.5h-3h，分别用超纯水冲洗后用氮气吹干备用。22.步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)-二甲基丙烯酸乙二醇酯(edma)整体毛细管柱，反压为13mpa–20mpa(以流动相为5μl/min的甲醇测定)。23.步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸丁酯(bma)-二甲基丙烯酸乙二醇酯(edma)整体柱，反压为13mpa–20mpa(以流动相为5μl/min的甲醇测定)。24.步骤(2)中，一种可行的聚合物整体柱为内径为25μm,50μm,或75μm的甲基丙烯酸十八烷醇酯(sma)-二甲基丙烯酸乙二醇酯(edma)整体柱，反压为13mpa–20mpa(以流动相为5μl/min的甲醇测定)。25.与现有技术相比，本发明的积极效果是：26.(1)本发明制备得到蛋清热固化涂覆的开管/聚合物整体毛细管电色谱柱，其涂覆材料为天然混合蛋白质，属于包覆蛋白。变性固定后，含有独特立体结构，可提供更为丰富的作用位点，支持多特性多成分物质的分析方法建立，对混合物质和对映异构体的分离具有更好效果；27.(2)与其他蛋白改性整体柱相比，由于蛋清特有的粘附性、热凝胶、热变性性质，使用该方法的蛋白涂覆和固定过程简便高效，并且键合蛋白来源广泛、成本低廉，所制备的毛细管电色谱柱分离效果优异且重现性好，适合实验室和工业的分析制备。附图说明28.附图1为本发明提供的蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用的流程示意图。29.附图2为使用本发明提供的蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法所产生的蛋清表面形态的显微图(倒置生物显微镜，日本尼康eclipse tiu,配备暗场聚光镜(0.8《na《0.95)、10×物镜，100w卤素灯光源)。30.附图3为本发明提供的蛋清热固化涂覆的开管毛细管电色谱柱分离酪氨酸对映体的分离色谱图。31.附图4为本发明提供的一种应用对比方式的酪氨酸对映体的分离色谱图。32.附图5为本发明提供的蛋清热固化涂覆的聚合物整体毛细管电色谱柱分离胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的色谱图。33.附图6为本发明提供的一种应用对比方式分离胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的色谱图。具体实施方式：34.以下提供本发明蛋清热固化涂覆毛细管电色谱柱的制备方法及应用的具体实施方式：35.实施例1:36.(1)取一只新鲜鸡蛋，清洗表面，分离鸡蛋清并用滴管吸取所有厚质层与薄质层蛋清，超声波震荡10min后，于10,000rpm下离心5分钟，取上清液，得到质地均匀的蛋清储备液；37.(2)用注射泵吸取蛋清储备液通过预先处理过的毛细管中，直至观察到毛细管另一端有液体流出。该毛细管内径为50μm，预处理方法为依次用0.1mol/l hcl和1mol/l naoh溶液冲洗毛细管约2h，用超纯水冲洗后氮气吹干。完成用注射泵充入蛋清后，用氮气在2ml/min吹扫速度下经15min反向吹出多余的蛋清溶液。重复用注射泵将蛋清溶液缓慢通过该毛细管与吹干的过程两次；38.(3)将得到的毛细管柱封口，放入90℃恒温油浴中反应30min后取出，得到蛋清热固化涂覆的开管毛细管电色谱柱。39.(4)将制备好的蛋清开管毛细管电色谱柱冷却，用氮气吹干、胶塞封口后置于4℃的冰箱中保存。40.实施例2:41.(1)取二只新鲜鸭蛋，清洗表面，将鸭蛋清分离出。使用磁力搅拌器在100rpm下连续搅拌3min，取蛋清(10g)与10ml纯水混合，再次使用磁力搅拌器在100rpm下连续搅拌5min，于8,000rpm下离心5分钟，取上清液，得到蛋清储备液；42.(2)用注射泵吸取1ml蛋清储备液缓慢通过预先制备的gma-edma聚合整体毛细管中，25℃下持续充入30min。该gma-edma聚合整体毛细管的内径为75μm，其制备方法为：分别称取功能单体gma(0.18g)、交联剂edma(0.12g)、环乙醇(0.405g)、十二醇(0.045g)和引发剂偶氮二异丁腈(0.003g)于离心管，氮气混合15min后充入经过naoh预处理的毛细管，将混合基质充至20cm处，留出10cm作为检测窗口。将该毛细管在50℃水浴下反应12h，而后依次用甲醇、纯水清洗。完成用注射泵涂覆蛋清后，用氮气在1ml/min吹扫速度下经30分钟吹出多余的蛋清溶液；43.(3)将得到的毛细管柱封口，放入95℃恒温水浴中加热固化1h后取出，得到蛋清热固化涂覆的聚合gma-edma整体毛细管电色谱柱。44.(4)将制备好的蛋清聚合gma-edma整体毛细管电色谱柱冷却，用氮气吹干、胶塞封口后置于4℃的冰箱中保存。45.应用实施例146.取实施例1所述蛋清热固化涂覆的开管毛细管电色谱柱，在20cm处用刮刀刮出3mm的检测窗口。取dl-酪氨酸样品配置1.2mg/ml的工作溶液，在毛细管电色谱模式下，以5mmol/l的na2hpo4水溶液作流动相，实验条件为20/35cm x 50μm i.d.；27℃；外加电压-10kv；流动相：5mmol/l na2hpo4(ph 6.5)；进样条件为-5kv x 5s；检测波长为210nm。得到如图3所示色谱图，可知该条件下酪氨酸对映体得到很好的分离，说明本发明制备出的蛋清热固化涂覆的开管毛细管柱对分离酪氨酸等手性物质具有良好的分离效果。47.应用对比例148.选用目前发展较成熟的牛血清白蛋白(bsa)作为固定相的开管柱，通过层层自组装的方法制备了bsa修饰的涂层开管柱(l.li,x.xue,h.zhang et al，chinese chemical letters 32(2021)2139–2142)。取dl-酪氨酸样品配置1.2mg/ml的工作溶液，在毛细管电色谱模式下，以5mmol/l的na2hpo4水溶液作流动相，实验条件为20/35cm x 50μm i.d.；27℃；外加电压-10kv；流动相：5mmol/l na2hpo4(ph 6.5)；进样条件为-5kv x 5s；检测波长为210nm。得到如图4所示色谱图，得知该bsa开管柱对酪氨酸对映体能够达到分离，但未达到基线分离，说明本发明制备出的蛋清热固化涂覆的开管毛细管柱与目前发展较成熟的bsa蛋白柱相比，同样能达到手性酪氨酸的分离，效果较优。49.应用实施例250.取实施例2所述蛋清热固化涂覆的gma-edma整体毛细管电色谱柱，取胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的标准品，溶于5％氨水中配制成各化合物质量浓度100mg/l的混合储备液，与超纯水混合制成40mg/l的工作溶液。在毛细管电色谱模式下，以5mmol/l的na2hpo4水溶液作流动相，实验条件为20/30cm x 75μm i.d.；27℃；外加电压-10kv；流动相：5mmol/l na2hpo4(含20％丙酮，ph 8)；进样：-5kv x 3s；检测波长为260nm。得到如图5所示色谱图，可知在该条件下核苷样品得到快速且较好分离，说明本发明制备蛋清热固化涂覆的gma-edma整体毛细管电色谱柱对胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷具有良好的分离效果。51.应用对比例252.取实施例2中步骤(2)所述预先制备的gma-edma聚合整体毛细管，聚合整体毛细管为20/30cm x 75μm i.d.；取胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的标准品，溶于5％氨水中配制成各化合物质量浓度100mg/l的混合储备液，与超纯水混合制成40mg/l的工作溶液。实验温度27℃，外加电压-10kv；流动相：5mmol/l na2hpo4(含20％丙酮，ph 8)；进样：-5kv x 3s；检测波长为260nm条件下，对胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的混合溶液进行分离。如图6，胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷溶液无法达到很好分离，说明蛋清热固化涂覆的gma-edma聚合整体毛细管相比直接采用未用蛋清热固化涂覆的gma-edma聚合整体毛细管进行核苷混合物的分离效果更优。53.本发明的优点为：蛋清可提供均匀、分散、多样、价格低廉的混合蛋白质，形成复杂样品和对映异构体分离分析所需的特异性空间结合位点。同时，卵黏蛋白和类卵黏蛋白是黏附性的主要来源。蛋清中的主要蛋白质在实验室易操作的条件下加热变性，形成具有一定强度的蛋白质固定相。通过简单的样品处理、涂覆、热变性固化等操作，可以用均匀混合组分的蛋白质制备开管毛细管柱/聚合物整体毛细管柱，特异性强、强度与重现性好，可用来发展多特性多成分物质的分离分析方法，并适合实验室和工业的分析制备。54.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。









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