一种基于CRISPR/Cas12a与杂交链式放大反应的PSA检测方法

有机化合物处理,合成应用技术一种基于crispr/cas12a与杂交链式放大反应的psa检测方法技术领域1.本发明属于生物传感器的开发方法，涉及一种基于crispr/cas12a与杂交链式放大反应的psa检测方法。背景技术：2.目前为止，已开发出许多检测psa的方法，如荧光光谱法(clin cancer res 2019,25(1),177)、基于化学发光的免疫检测法(luminescence 2017,32(8),1547)、酶联免疫吸附检测法(elisa)(biosens bioelectron 2015,69,128)、电化学发光法(sens.actuators b chem.2020,315,128155)、表面增强荧光免疫酶法(acs nano 2017,11(5),4926)和表面增强拉曼散射法(biosens bioelectron 2018,119,126)。然而，这些方法大多基于免疫反应，存在一些不足，比如需要昂贵且易变性的抗体、专业的技术人员和特定的仪器设备，这为psa的检测增加了难度。另外，本课题组前期申请的“一种超灵敏检测前列腺特异性抗原psa的方法”发明专利，目前已在公开阶段，公开号cn112301095a，中国。该发明专利联合聚合酶链扩增技术(pcr)与动态光散射技术，通过监测金纳米颗粒(aunps)的直径变化实现psa的定量与超灵敏检测。该专利通过引入核酸适配体避免了抗体的使用，但由于需要使用pcr技术，仍然需要专业的技术人员的专业操作才能实现。此外，该发明专利与现申请专利的区别表现在：(1)pcr技术是一种变温放大技术，需要依赖特定的仪器设备，而现申请专利中的放大技术是等温放大技术，反应条件温和，室温下即可进行，不需要额外的仪器设备；(2)该发明专利是通过金纳米颗粒的直径变化来定量psa，而本发明专利是通过金纳米溶液的吸收光谱的变化来定量psa，并且可通过肉眼观察颜色的变化初步判断psa含量的高低。新发明避免了昂贵且易变性的抗体的使用，降低了检测过程对专业仪器设备与专业操作人员的依赖性，使psa的检测不再局限于实验室等特定场合。技术实现要素：3.要解决的技术问题4.为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种基于crispr/cas12a与杂交链式放大反应的psa检测方法，通过杂交链式放大反应将psa蛋白的检测转化为dna检测，crispr/cas系统的引入用于提高psa的检测灵敏度；金纳米颗粒的引入可实现psa的肉眼可视化检测。降低现有检测技术对仪器的依赖性。5.技术方案6.一种基于crispr/cas12a与杂交链式放大反应的psa检测方法，其特征在于：所需要的dna序列表为：[0007][0008]注：n是2-10中的随机数字，x是6-20中的随机数字，y是1-50中的随机数字；[0009]psa检测步骤如下：[0010]步骤1、制备脱氧核糖核酸dna修饰的aunps：将巯基修饰的dna即oligo 7和oligo 8；分别溶解于ph为5.0的醋酸盐缓冲溶液，再加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，以还原修饰在dna上的巯基为二硫键，然后将上述溶液全部转移至1-20.0ml aunps溶液中，室温孵育1.0-26.0小时；[0011]然后在接下来的10.0-64.0小时内，向金纳米粒子溶液中加入氯化钠溶液，并使最终溶液中nacl的浓度为10.0-400.0mm；[0012]修饰完成，将溶液离心处理多次，每次离心不少于15.0分钟，以除去未修饰到金纳米粒子表面的dna，得到脱氧核糖核酸dna修饰的aunps；[0013]步骤2、基于核酸适配体的杂交链式反应：将发卡结构的dna即oligo 3、oligo4、oligo 5；在80.0-105.0℃的条件下加热不少于5.0分钟，然后自然冷却至室温；将待检测溶液与适配体即oligo 2在20-40℃孵育不少于5分钟备用，接下来的延伸反应在20-40℃条件下进行；psa与适配体即oligo 2在含有但不仅限于tris-cl的缓冲溶液中20-40℃反应不少于5.0分钟，然后按1:10:10:10的比例加入oligo 1、oligo 3、oligo 4和oligo 5,在20-40℃条件下进行不少于30分钟的杂交链式反应，反应后的产物以离心不少于1分钟，取上清液；[0014]步骤3、crispr/cas12a反向酶切功能的激活：cas12a/crrna反应液中含有但不仅限于nacl、tris-hcl、mgcl2和牛胎血清蛋白成分；反应液中按1:1.2的比例加入cas 12a和crrna，再加入oligo 5，20-40℃孵育不少于10分钟，再加入步骤2得到的上清液，20-40℃反应不少于20分钟得反应液；[0015]步骤4、显色反应及吸收光谱的测量：向步骤3的反应液中加入步骤1中制备的脱氧核糖核酸dna修饰的aunps，等待不少于5分钟，若被测溶液中存在psa，溶液变色的向红色方向进行，证明被测溶液中存在psa。[0016]当检测到psa时，采用紫外可见吸收光谱测量溶液的吸收光谱与吸光度。[0017]所述溶液的psa的浓度与吸光度，在psa的浓度在0.1～4.0ng/ml范围时，psa的浓度与吸光度为线性关系，a＝0.1285+0.09281c，a为吸光度，c为psa浓度，单位为c:ng ml-1。[0018]所述步骤1的离心处理以不少于10000.0rpm转速的离心机处理，每次离心不少于15.0分钟。[0019]所述步骤2的离心速度为不少于1000.0转速。[0020]所述金纳米粒子aunps的制备：将柠檬酸钠溶液快速加入煮沸的氯金酸溶液中搅拌，待溶液颜色由淡黄色变为酒红色后，再回流搅拌，通过连续搅拌将溶液冷却到室温并储存在4.0℃的冰箱。[0021]所述本发明中用到的序列由生工生物技术有限公司合成。[0022]有益效果[0023]本发明提出的一种基于crispr/cas12a与杂交链式放大反应的psa检测方法，首先通过基于核酸适配体的杂交链扩增反应，将psa的信号转换为dna信号，杂交链反应产物的重复dna结构可识别并激活crispr/cas12a系统的反向酶切功能，并将连接两种金纳米颗粒的单链dna切成含2-4个碱基的片段，使金纳米颗粒由聚集变为分散状态，溶液的颜色表现为紫色向红色的变化。[0024]本发明通过紫外可见吸收光谱，肉眼可见的颜色变化和动态光散射(dls)研究了该方法的可行性。如图1a所示，随着psa的加入，溶液的吸光度呈现明显的增加，表明aunps从聚集状态变为分散状态。图1b中加入20.0ng ml-1psa前后，溶液颜色变化显著，在没有psa的情况下，溶液中的aunps聚集沉降并使溶液颜色呈现淡紫色，加入20.0ng ml-1psa后，溶液中的aunps不聚集，溶液颜色是红色。dls图像进一步证实这一结果，加入20.0ng ml-1psa前，aunps水合直径大，颗粒处于聚集状态，加入20.0ng ml-1psa后，aunps水合直径小，颗粒处于分散状态(图1c)。这些结果表明，该方法可以通过测量aunps的吸收光谱的变化来定量psa。[0025]对分析物的线性响应是分析的关键，因此该方法测定了不同浓度psa存在时球形核酸溶液吸收光谱的变化情况，并以522nm处吸收光谱值为判断依据。由图2可知，随着psa浓度的增加，522nm处球形核酸的吸收值逐渐增加，结果显示在0.1ng ml-1到4.0ng ml-1范围内，球形核酸的紫外吸收随psa浓度的线性减小。线性回归方程a＝0.1176+0.1058c(c:ng ml-1)和检出限))。24pg ml-1(3δ/斜率)。这些结果表明，该生物传感器能够实现psa的高灵敏度检测。附图说明[0026]图1：(a)吸收光谱的结果；(b)溶液的颜色；(c)动态光散射的结果；(a)没有加入psa的结果；(b)加入20.0ng ml-1psa的结果。[0027]图2：溶液的吸光度与psa浓度变化的线性关系，psa的浓度从0.1ng ml-1到4.0ng ml-1。误差棒表示三次测量值的标准差。具体实施方式[0028]现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：[0029]本方法的操作步骤如下：[0030]本方法实施例所需要的dna序列列于表1-1，由生工生物技术有限公司合成，具体如下表：[0031]1-1本发明中用到的序列[0032][0033][0034]注：n是2-10中的随机数字，x是6-20中的随机数字，y是1-50中的随机数字。[0035]本实施例的操作步骤如下:[0036]步骤1：金纳米粒子(aunps)的制备(参考已有的方法)。将2.0ml 38.8mm柠檬酸钠溶液快速加入煮沸的1.0mm氯金酸(haucl4)溶液中搅拌，待溶液颜色由淡黄色变为酒红色后，再回流搅拌15.0分钟，通过连续搅拌将溶液冷却到室温。最后aunps通过0.4μm尼龙滤膜过滤收集并储存在4.0℃的冰箱待用。[0037]接着制备脱氧核糖核酸(dna)修饰的aunps：首先，将巯基修饰的dna(oligo7和oligo 8)分别溶解于60.0μl的ph为5.0的醋酸盐缓冲溶液，再加入12.0μl的20.0mm的三(2-羧乙基)膦(tcep)，以还原修饰在dna上的巯基为二硫键，然后将上述溶液全部转移至1-20.0ml aunps溶液中，室温孵育1.0-26.0小时。[0038]然后在接下来的10.0-64.0小时内，向金纳米粒子溶液中加入5.0m的氯化钠(nacl)溶液，并使最终溶液中nacl的浓度为10.0-400.0mm。[0039]修饰完成，将溶液放置在13800.0rpm转速的离心机离心三次，每次离心不少于15.0分钟，以除去未修饰到金纳米粒子表面的dna(每次用ph 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-cl)缓冲溶液洗涤)。最后将制备的修饰了dna的金纳米粒子(球形核酸)稀释到所需浓度，储存于4.0℃冰箱于步骤3中使用。[0040]步骤2：基于核酸适配体的杂交链式反应。杂交链式反应(hybridization chain reaction，hcr)作为一种等温、无酶核酸放大技术备受关注，是在引发链的诱导下使两发夹探针发生级联杂交反应，形成长的、带缺口的双螺旋dna。hcr可以与多种探针结合，aunps是一种最常用的纳米材料，由于其比表面积大、光学性质独特、生物相容性好，被广泛用于传感平台的构建。当psa不存在时，oligo 1和oligo 2为dna/dna双链结构，无法引发链替换扩增反应，反应终止。当psa存在时，psa与适配体oligo 2结合释放引物oligo 1，释放的oligo 1因与发卡dna oligo 3部分互补形成dna/dna双链结构而打开发卡形成，发卡打开后，oligo 3的单链部分与发卡oligo 4部分互补形成双链而打开发卡oligo 4，oligo 4的单链部分与发卡oligo 5互补而打开发卡结构，而被打开的发卡(oligo 5)单链部分又与发卡oligo 4部分互补，继续打开另一条oligo 4发卡结构，以此往复循环进行杂交链式反应并形成具有oligo4/oligo 5重复双链结构单元。新生成的oligo 4/oligo 5重复双链结构单元在步骤(3)中可激发crispr/cas12a系统的反向切割活性，影响溶液中aunps的颜色和吸收信号的变化，以此实现检测信号的放大，通过观察颜色变化与测定吸收信号的变化可以定量psa。[0041]基于核酸适配体的杂交链式放大反应条件：将发卡结构的dna(oligo 3/oligo4/oligo 5)在80.0-105.0℃的条件下加热不少于5.0分钟，然后自然冷却至室温。将待检测溶液与适配体(oligo 2)在20-40℃孵育不少于5分钟备用，接下来的延伸反应在20-40℃条件下进行，溶液总体积50.0μl。5.0μl检测溶液与适配体(oligo2)在含有10.0mm tris-cl(ph 7.4)的缓冲溶液中0-40℃反应不少于5.0分钟，然后加入5.0μl 0.1μm oligo 1、5.0μl 1.0μm oligo 3、5.0μl 1.0μm oligo 4和5.0μl 1.0mm oligo 5,在20-40℃条件下进行不少于30分钟的杂交链式反应。反应后的产物在桌面离心机以8000.0rpm的速度离心1分钟，取上清液于步骤3中使用。[0042]步骤3：crispr/cas12a反向酶切功能的激活。cas12a蛋白(lbcpf1、fncpf1、ascpf1)同时具有正向(cis)和反向(trans)切割单链dna的活性。当cas12a与特定的crrna及其目标dna形成三元复合物时，该复合物获得强大反向切割活性，并将单链dna切成2-4个核苷酸片段。利用cas12a的这种性质，我们首先通过杂交链式反应将psa的信号检测转换为dna的信号检测，然后杂交链式反应的双链重复单元与设计的crrna(oligo 9)互补并激发cas12a的反向切割活性。[0043]crispr/cas12a反向酶切功能激活的反应条件：20μl ph为7.9的cas12a/crrna反应液中含有100.0mm nacl、50.0mm tris-hcl、10.0mm mgcl2和100.0μg ml-1牛胎血清蛋白(bsa)。反应液中加入100.0nm cas 12a、120.0nm crrna和400.0nm oligo 5，20-40℃孵育不少于10分钟，再加入5.0μl步骤2中的上清液，20-40℃反应不少于20分钟得反应液，留作步骤4中使用。[0044]步骤4：显色反应及吸收光谱的测量。因oligo 6可分别与oligo 7和oligo 8互补形成双螺旋而拉近oligo 7和oligo 8修饰的aunps的距离，使aunps由分散状态变为聚集状态，溶液颜色呈现紫色，但是激活的cas12a可以将oligo 6切成2-4nt的片段，使aunps不聚集，溶液颜色保持红色。[0045]显色反应及吸收光谱的测量条件：分别向步骤3的反应液中加入50.0μl 0.4nm步骤1中制备的球形核酸，等待不少于5分钟，通过肉眼观察溶液的变色情况，若被测溶液中存在psa，溶液变色的向红色方向进行，证明被测溶液中存在psa。[0046]再用紫外可见吸收光谱测量溶液的吸收光谱。[0047]所述溶液的psa的浓度与吸光度，在psa的浓度在0.1～4.0ng/ml范围时，psa的浓度与吸光度为线性关系，a＝0.1285+0.09281c，a为吸光度，c为psa浓度，单位为c:ng ml-1。[0048]实例一：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。具体过程如下：首先，向杂交链式放大反应的缓冲液中加入2％人血清和0.1ng ml-1的标准psa样品，经过杂交链式放大反应，用本发明方法检测到的psa浓度是0.1169ng ml-1，回收率是116.9％，相对标准偏差(rsd)是0.3％。[0049]实例二：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。具体过程如下：首先，向杂交链式放大反应的缓冲液中加入2％人血清和0.5ng ml-1的标准psa样品，经过杂交链式放大反应，用本发明方法检测到的psa浓度是0.5001ng ml-1，回收率是100.1％，相对标准偏差(rsd)是1.2％。[0050]实例三：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。具体过程如下：首先，向杂交链式放大反应的缓冲液中加入2％人血清和1.0ng ml-1的标准psa样品，经过杂交链式放大反应，用本发明方法检测到的psa浓度是0.915ng ml-1，回收率是91.5％，相对标准偏差(rsd)是1.4％。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!