增强TBX1表达在修复心脏组织损伤中的用途

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术增强tbx1表达在修复心脏组织损伤中的用途技术领域1.本发明涉及心血管疾病治疗领域，尤其涉及tbx1在修复心脏组织损伤中的用途。背景技术：2.心血管疾病在我国是首要致死原因，且近年来死亡率仍呈上升态势。哺乳动物的心肌细胞仅在出生后短暂的窗口期内具有增殖能力，心肌成熟后便退出细胞周期，因此，心肌坏死通常不可逆，预后差，会导致严重后果，例如，高达60％的缺血性心肌梗死病人在初次发病后六年内会发展成心脏衰竭。目前，针对心梗治疗主要通过血管再通减少心肌缺血坏死，以及通过药物调控神经体液的调节机制减缓心室的不良重塑。然而，这些治疗方法不能完全阻断心梗后的心室重塑，相当一部分病人在没有继续缺血损伤的情况下在较短的时间内进展到心脏衰竭。3.因此本领域急需发展出新的心脏疾病疗法。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种新的有效治疗与心脏损伤相关的心脏疾病和/或淋巴管异常相关疾病的活性成分及其用途。5.本发明的第一方面，提供了一种活性成分的用途，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：6.(i)激活心脏淋巴管内皮细胞增生；7.(ii)抑制心脏自身免疫反应；8.(iii)促进m1型巨噬细胞向m2型巨噬细胞转化；9.(iv)修复心脏组织损伤；10.(v)治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病；和11.(vi)治疗淋巴管异常相关疾病；12.其中，所述活性成分包括：tbx1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。13.在另一优选例中，所述的编码序列包括dna、cdna、mrna。14.在另一优选例中，所述的“促进m1型巨噬细胞向m2型巨噬细胞转化”包括：促进心肌组织中m1型巨噬细胞(促进炎症反应)向m2型巨噬细胞(促进组织修复)转化。15.在另一优选例中，所述的“与心脏组织损伤相关的心脏疾病”是与免疫反应(尤其是自身免疫反应)相关的心脏疾病。16.在另一优选例中，所述与心脏组织损伤相关的心脏疾病选自下组：心肌梗死、心肌炎、特发性扩张性心肌病、chagas'心肌病、风湿性心脏病、新型冠状病毒肺炎(covid-19)引起的心脏损伤、或其组合。17.在另一优选例中，所述淋巴管异常相关疾病选自下组：淋巴管发育不良造成的原发性淋巴水肿、由于淋巴管破裂或阻塞造成的继发性淋巴水肿、turner综合征、黄甲综合征、hennekam综合征等遗传综合征所呈现的淋巴管水肿、或其组合。18.本发明的第二方面，提供了一种tbx1蛋白或其编码序列或其检测试剂的用途，用于制备一诊断试剂或诊断试剂盒，所述的诊断试剂或诊断试剂盒用于对心脏组织损伤相关的心脏疾病或淋巴管异常相关疾病进行预后判断。19.在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、芯片、抗体、或其组合。20.在另一优选例中，与正常人群或对照相比，如果tbx1表达量和/或活性上升，则提示被诊断的对象的预后好。21.在另一优选例中，与正常人群或对照相比，如果tbx1表达量和/或活性下降，则提示被诊断的对象的预后差。22.在另一优选例中，所述被诊断的对象患有或疑似患有心脏组织损伤相关的心脏疾病或淋巴管异常相关疾病。23.在另一优选例中，所述对心脏组织损伤相关的心脏疾病或淋巴管异常相关疾病进行预后的方法包括：提供一受试者样本，检测受试者样本中tbx1蛋白的表达水平t1，并与心肌梗死患者心脏淋巴管中tbx1蛋白的平均表达水平t0比较；24.若t1大于t0，则表明所述受试者的预后好；25.若t1小于t0，则表明所述受试者的预后差。26.在另一优选例中，所述的对心脏组织损伤相关的心脏疾病或淋巴管异常相关疾病进行预后的方法包括：提供一受试者样本，检测受试者样本中是否有tbx1编码和/或调节序列变异，如果tbx1变异是导致tbx1功能丧失或下降的变异，则提示所述受试者的预后差；如果tbx1变异是导致tbx1功能增强的变异，则提示所述受试者的预后好。27.在另一优选例中，所述tbx1功能是指促进淋巴管再生及免疫抑制微环境的形成。28.在另一优选例中，所述的心脏组织损伤相关的心脏疾病包括心肌梗死。29.在另一优选例中，所述受试者患有心肌梗死。30.在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类哺乳动物。31.在另一优选例中，所述样本包括心脏组织样本、心脏细胞样本、淋巴管内皮细胞样本、淋巴液样本、外周血样本细胞、或其组合。32.在另一优选例中，所述的样本包括细胞样本、dna样本、rna样本、或其组合。33.在另一优选例中，所述的试剂盒还包括检测额外标志物的检测试剂，所述的额外标志物选自下组：top2a、mki67、cenpe、aurkb、或其组合。34.在另一优选例中，这些额外标志物的表达水平(或表达量)上升，则提示tbx1变异是导致tbx1功能增强的变异。35.在另一优选例中，与正常人群或对照相比，如果这些额外标志物的表达水平(或表达量)上升，则提示则提示所述被诊断的对象的预后好。36.在另一优选例中，与正常人群或对照相比，如果这些额外标志物的表达水平(或表达量)下降，则提示所述被诊断的对象的预后差。37.本发明的第三方面，提供了一种可用于修复心脏组织损伤和治疗淋巴管异常相关疾病的活性成分，所述活性成分包括：tbx1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。38.在另一优选例中，所述活性成分为tbx1蛋白的促进剂。39.在另一优选例中，所述促进剂促进tbx1蛋白在心脏及机体其他部位的淋巴管内表达。40.在另一优选例中，所述促进剂上调tbx1蛋白在心脏及机体其他部位的淋巴管内的功能。41.本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有用于表达tbx1蛋白的表达盒。42.在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、质粒、真核表达载体、原核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。43.在另一优选例中，所述的表达载体特异性感染淋巴管内皮细胞。44.在另一优选例中，所述表达盒从5'端-3'端具有式i结构：45.z0-z1-z2(i)46.式中，47.各“‑”独立地为化学键或核苷酸连接序列；48.z0为无、或5'utr序列；49.z1为编码tbx1蛋白的核苷酸序列；和50.z2为无、或3'utr序列。51.在另一优选例中，所述表达盒还包括在与tbx1蛋白的编码序列可操作性连接的淋巴管内皮特异性启动子。52.在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。53.在另一优选例中，所述编码tbx1蛋白的核苷酸序列来源于人或非人类哺乳动物。54.在另一优选例中，所述核苷酸序列如seq id no.1所示。55.在另一优选例中，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。56.本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体。57.在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。58.在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、酵母细胞、或哺乳动物细胞。59.在另一优选例中，所述宿主细胞为淋巴管内皮细胞。60.在另一优选例中，所述宿主细胞为心脏淋巴管内皮细胞。61.本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述制剂含有(a)本发明第三方面所述的活性成分，或本发明第四方面所述的表达载体，或本发明第五方面所述的细胞，以及(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。62.在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。63.在另一优选例中，所述药物制剂为注射液。64.在另一优选例中，所述药物制剂还包含：额外的活性成分；65.较佳地，所述的额外的活性成分包括：bmp4、ccl28、抗cd8抗体、或其组合。66.本发明的第七方面，提供了一种本发明第三方面所述的活性成分，或本发明第四方面所述的表达载体，或本发明第五方面所述的细胞，或如本发明第六方面所述的药物制剂在制备用于治疗与心脏损伤相关的心脏疾病和/或淋巴管异常相关疾病的药物中的用途。67.在另一优选例中，所述与心脏损伤相关的心脏疾病选自下组：心肌梗死、心肌炎、特发性扩张性心肌病、chagas'心肌病、风湿性心脏病、新型冠状病毒肺炎(covid-19)引起的心脏损伤、或其组合。68.在另一优选例中，所述淋巴管异常相关疾病选自下组：淋巴管发育不良造成的原发性淋巴水肿、由于淋巴管破裂或阻塞造成的继发性淋巴水肿、turner综合征、黄甲综合征、hennekam综合征等遗传综合征所呈现的淋巴管水肿、或其组合。69.本发明的第八方面，提供了一种筛选tbx1蛋白的促进剂的方法，包括步骤：将候选药物施用于体外培养的淋巴管内皮细胞和/或实验动物，若体外培养的淋巴管内皮细胞或实验动物体内淋巴管组织的tbx1 mrna水平或tbx1蛋白水平相对于未施用候选药物的对照组升高，或tbx1蛋白功能相对于未施用候选药物的对照组增强，则候选药物可以作为tbx1蛋白的促进剂。70.在另一优选例中，所述tbx1蛋白的促进剂可用于治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病。71.在另一优选例中，所述tbx1蛋白的促进剂可用于治疗淋巴管异常相关疾病。72.本发明的第九方面，提供了一种治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病的方法，所述方法包括：将本发明第三方面所述的活性成分或本发明第六方面所述的药物制剂施用于有需要的对象。73.在另一优选例中，所述有需要的对象患有与心脏组织损伤相关的心脏疾病。74.在另一优选例中，所述与心脏损伤相关的心脏疾病选自下组：心肌梗死、心肌炎、特发性扩张性心肌病、chagas'心肌病、风湿性心脏病、新型冠状病毒肺炎(covid-19)引起的心脏损伤、或其组合。75.本发明的第十方面，提供一种治疗淋巴管异常相关疾病的方法，所述方法包括：将本发明第三方面所述的活性成分或本发明第六方面所述的药物制剂施用于有需要的对象。76.在另一优选例中，所述有需要的对象患有淋巴管异常相关的心脏疾病。77.在另一优选例中，所述淋巴管异常相关疾病选自下组：淋巴管发育不良造成的原发性淋巴水肿、由于淋巴管破裂或阻塞造成的继发性淋巴水肿,turner综合征、黄甲综合征、hennekam综合征等遗传综合征所呈现的淋巴管水肿、或其组合。78.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明79.图1显示了心梗后tbx1在淋巴内皮激活表达。(a)心梗后3及7天tbx1在心脏的表达。未损伤心脏(baseline，n＝2)、心梗后第3天(n＝2)、第4天(n＝2)及第7天(n＝6)。(b)心梗后第7天x-gal染色心脏切片vegfr3免疫染色(n＝3)。显示tbx1主要在淋巴管内皮细胞表达。(c)心梗后第14(n＝3)及28天(n＝3)整体心脏x-gal染色。dpmi：心梗后天数。80.图2显示了内皮细胞特异性敲除tbx1导致心梗后淋巴管再生异常及修复障碍。(a)tbx1功能缺失小鼠构建示意图，功能性基因组序列在cre的激活下被敲除；(b)心梗后28天心脏腹侧图。黑色箭头：左室前壁室壁瘤。绿色箭头：术后黏连；(c)心梗14天后心脏切片he染色(n＝3)，绿色箭头：单核浸润炎症细胞，蓝色箭头：出血点；(d)心梗后对照组及tbx1ckou-test,*p《0.05。88.图10显示了淋巴管内皮过表达tbx1降低心脏中细胞毒性作用cd8+t细胞比例。(a,b)流式分析心梗后第7天tbx1oe心脏中cd8+t细胞数目改变，数据显示为均值±标准误(n＝5)，*，p《0.05,mann-whitney u检验；pd-1+tnfα-耗竭性cd+8t细胞数量在tbx1oe组中明显增加,foxp3+cd25+调节性cd8+t细胞(treg)数量在tbx1oe组中明显升高。具体实施方式89.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地研发了一种可用于治疗与心脏损伤相关的心脏疾病的活性成分。本发明人发现，在心脏淋巴管的淋巴管内皮细胞中过表达tbx1蛋白，可促进淋巴管内皮细胞增生。此外，tbx1还可以发挥免疫调控作用，促进心梗后心肌内免疫抑制微环境的建立，抑制心脏组织损伤后的自身免疫反应，缓解并发的心脏组织炎症，促进损伤的心脏组织修复再生。实验证明，在心肌梗死小鼠模型中，在心脏淋巴管内皮过表达tbx1，明显改善了心梗后的心脏功能，促进了心梗后心脏组织修复。在此基础上，完成了本发明。90.术语91.为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。92.术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。93.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。94.如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。95.tbx196.本发明提供了一种可用于修复心脏组织损伤的活性成分，所述活性成分包括：tbx1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。97.tbx1基因编码t盒转录因子，位于人类染色体22q11.2区域，是22q11.2微缺失综合征的主要致病基因。该病在新生儿中发病率高达1:2000。75％患儿有先天性心脏病，伴有头面部发育异常、胸腺缺如等先天缺陷。在胚胎发育早期，tbx1在一部分具有分化潜能的心脏祖细胞中表达，对心脏淋巴管系统的发育也至关重要，然而成年后tbx1在心脏中的表达水平极低。98.tbx1基因在ncbi数据库中的基因id为6899，其表达的mrna序列有4种变异体(isoform)：nm_005992.1、nm_080646.2、nm_080647.1和nm_001379200.1。小鼠tbx1基因在ncbi数据库中的基因id为21380，其表达的mrna序列有4种变异体(isoform)：nm_011532.2、nm_001285472.1、nm_001285476.1和nm_001373938.1。如本文所用，tbx1蛋白的编码序列可以为上述任一序列或其变体，只要所述序列能够有效表达功能正常或增加的tbx1蛋白。所述功能为促进淋巴管再生及免疫抑制微环境的形成。99.在另一优选例中，所述tbx1蛋白的编码序列如seq id no.1所示。100.atgcacttcagcaccgtcaccagggacatggaagccttcacggccagcagcctgagcagcctgggggccgcggggggcttcccgggcgccgcgtcgcccggcgccgacccgtacggcccgcgcgagcccccgccgccgccgccgcgctacgacccgtgcgccgccgccgcccccggcgccccgggcccgccgccgccgccgcacgcctacccgtttgcgccggccgccggggccgccaccagcgccgccgccgagcccgagggccccggggccagctgcgcggccgcagccaaggcgccggtgaagaagaacgcgaaggtggccggtgtgagcgtgcagctagagatgaaggcgctgtgggacgagttcaaccagctgggcaccgagatgatcgtcaccaaggccggcaggcggatgtttcccaccttccaagtgaagctcttcggcatggatcccatggccgactatatgctgctcatggacttcgtgccggtggacgataagcgctaccggtacgccttccacagctcctcctggctggtggcggggaaggccgaccctgccacgccaggccgcgtgcactaccacccggactcgcctgccaagggcgcgcagtggatgaagcaaatcgtgtccttcgacaagctcaagctgaccaacaacctactggacgacaacggccacattattctgaattccatgcacagataccagccccgcttccacgtggtctatgtggacccacgcaaagatagcgagaaatatgccgaggagaacttcaaaacctttgtgttcgaggagacacgattcaccgcggtcactgcctaccagaaccatcggatcacgcagctcaagattgccagcaatcccttcgcgaaaggcttccgggactgtgaccctgaggactggccccggaaccaccggcccggcgcactgccgctcatgagcgccttcgcgcgctcgcggaaccccgtggcttccccgacgcagcccagcggcacggagaaagacgcggctgaggcccggcgagaattccagcgcgacgcgggcgggccagcagtgctcggggacccggcgcatcctccgcagctgctggcccgggtgctaagcccctcgctgcccggggccggcggcgccggcggcttagtcccgctgcccggcgcgcccggaggccggcccagtcccccgaaccccgagctgcgcctggaggcgcccggcgcatcggagccgctgcaccaccacccctacaaatatccggccgccgcctacgaccactatctcggggccaagagccggccggcgccctacccgctgcccggcctgcgtggccacggctaccacccgcacgcgcatccgcaccaccaccaccaccccgtgagtccagccgccgcggccgccgccgccgctgccgcagctgccgcggccgccaacatgtactcgtcggccggagccgcgccgcccggctcctacgactattgccccagataa(seq id no:1)。101.在另一优选例中，所述tbx1蛋白的编码序列如实施例中所用cds序列：102.atgatctccgccgtgtctagtccgtggctcacgcagctctcgcacttctgcgacgttgcagccttcgcagccagcagtctgagcggcctgggatccccgtcgcctggcgccgacccgttcggccctcgcgagccgccgccaccgcgctacgatccgtgcgctgcagtccccggtgccccgggcccgccgccgccgcgcgcctatcctttcgcgcccgcccccggggcggctggcagctcggcggcggagtccgagggtccgggggctagccgcgcggctgcggtcaaggctccggtgaagaagaacccgaaggtggccagcgtgagcgtgcagctggagatgaaggcgctgtgggacgagttcaatcagctgggcaccgagatgatcgtcaccaaggcaggcagacgaatgttccccacgttccaagtgaagctttttggaatggatcccatggccgactacatgctgctcatggactttgtgcccgtagatgacaagcgctaccggtatgctttccatagctcctcctggctggtggccggcaaggcagatcctgctacacctggccgagtacactaccacccggactcgccggctaagggcgcacagtggatgaaacagattgtgtctttcgacaagctgaaactgaccaataacctgctggatgacaatggccatattattctcaactccatgcacagatatcagccccgattccatgttgtctatgtggaccctcgaaaagacagtgagaaatatgcagaggagaacttcaaaacttttgtgtttgaggagacacgcttcactgcagtcactgcctaccagaatcaccggatcacgcagcttaagattgccagcaaccccttcgccaaaggcttccgggattgcgacccggaggactggccccggaaccaccggcccggagcgctgccgctcgtgagtgcctttgctcgctctcggaatcccgtggcttcccccacgcagcccaatggctcagacaaagacgctgcagaagcccggcgcgagttcgaccgtgactccggacccgcagcgctcggcgacgctacgcacccgccgcagctgctggcgcgcgtgctgagccccgcactgcccgggcctggcggcctcgtcccgctacccggcggatccggaggccgccacagtcccccgcacgccgatctgcgcctggaggcgccgggcgcgtccgagccgctgcaccaccatccctacaagtacccggccgccgcctacgaccactacctcggggccaagagccggccggcgccctacccgctgccaggcctgcgcggccacggctaccacccgcacgcgcacccgcacgcgcacccgcaccatcaccaccaccccgcggtgaacccggccgccgccgccgctgctgccgcagcagccaacgtgtactcgtcggcggccgcgccgcccggtgcctacgactactgccccagatag(seq id no:2)。103.心脏组织损伤104.如本文所用，术语“心脏组织损伤”是指包括心肌细胞变性、坏死以及心脏血管淋巴管变性、坏死在内的心脏组织损伤。心脏组织损伤后，可引起炎症以及自身免疫反应。105.本发明发现，tbx1蛋白、tbx1mrna或其促进剂可用于修复心脏组织损伤。在心脏淋巴管中过表达tbx1后，不仅可促进淋巴管内皮细胞增生，还可以调控自身免疫反应，缓解心脏炎症，从而可用于治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病。106.所述“与心脏组织损伤相关的心脏疾病”包括缺血、缺氧引起的急性心肌损伤、自身免疫性心脏疾病以及其它一些导致心肌损伤的疾病。在另一优选例中，所述与心脏组织损伤相关的心脏疾病选自下组：心肌梗死、心肌炎、特发性扩张性心肌病、chagas'心肌病、风湿性心脏病、新型冠状病毒肺炎(covid-19)引起的心脏损伤、或其组合。107.表达载体及宿主细胞108.本发明提供了一种表达载体，用于表达tbx1蛋白，它含有本发明的tbx1蛋白的编码序列。109.通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。110.在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、质粒、真核表达载体、原核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。111.优选地，包含编码tbx1蛋白的核酸序列作为载体，优选地作为表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在靶细胞(例如耳蜗支持细胞)中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、mmlv、galv、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、hiv、痘病毒和sv40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replication defective)，或者可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶细胞的基因组。用于向靶细胞引入编码tbx1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是aav载体。使用特定的aav血清型(aav血清型2到aav血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本可以实现选择性靶向。112.病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与试剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类试剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。113.载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在靶细胞中的表达。[0114]“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。[0115]本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达tbx1蛋白。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞、t细胞、nk细胞的动物细胞等。[0116]药物制剂[0117]本发明提供一种药物制剂或组合物，所述药物制剂或组合物含有(a)本发明第二方面所述的活性成分、或本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞，以及(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。[0118]在另一优选例中，所述药物制剂用于修复心脏组织损伤。[0119]在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病。[0120]在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗淋巴管异常相关疾病。[0121]本发明所述药物制剂中的“活性成分”是指tbx1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合，或本发明所述的表达载体，例如病毒载体。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病和/或淋巴管异常相关疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。[0122]本发明的制剂和/或组合物还可以包含bmp4、ccl28、抗cd8抗体以及其它与tbx1分子功能类似的活性成分。所述制剂和/或组合物可与本领域已知的其它治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病和/或淋巴管异常相关疾病的药物组合使用。[0123]组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。[0124]在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。[0125]药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。[0126]组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。[0127]筛选tbx1蛋白的促进剂的方法，[0128]本发明还提供了一种筛选tbx1蛋白的促进剂的方法，所述方法包括步骤：将候选药物施用于体外培养的淋巴管内皮细胞和/或实验动物，若体外培养的淋巴管内皮细胞或实验动物体内淋巴管组织的tbx1 mrna水平、tbx1蛋白水平或tbx1蛋白功能相对于未施用候选药物的对照组升高，则候选药物可以作为tbx1蛋白的促进剂。[0129]在本发明中，所述“候选药物”包括但不限于：小分子化合物、核酸药物、或蛋白药物。所述候选药物可直接作用于tbx1或间接作用于tbx1，但最终都使得体外培养的淋巴管内皮细胞或实验动物体内淋巴管组织的tbx1蛋白功能、水平或tbx1 mrna水平升高。[0130]在另一优选例中，所述tbx1蛋白的促进剂可用于治疗与心脏组织损伤相关的心脏疾病。[0131]本发明的主要优点在于：[0132](1)心脏损伤后倾向于发生自身免疫的损伤，但目前针对这种病理机制没有很好的控制手段，导致在相当一部分病人在心脏损伤后导致心衰的发生。本发明首次提出针对这一病理机制的控制手段，有望给这一相关病理机制导致心脏疾病带来新的治疗方法。[0133](2)本发明提出了一种全新的心脏内源性修复再生机制，本发明的活性成分(或组合)从抑制自身免疫反应以及增进淋巴管增生两个不同层面加强心脏损伤后的修复再生，因此具有很好的效果。为人类心梗损伤后再生修复提供了新策略与新方案。[0134](3)此外，本发明的活性成分(或组合)通过抑制自身免疫反应创造的良好微环境，对细胞移植进行心梗修复再生也能创造良好的条件。[0135]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。[0136]实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0137]实验方法[0138](1)构建rosa26-stop-tbx1/stop-tbx1(tbx1oe)品系小鼠：将loxp-stop-loxp-tbx1 cdna-p2a-zsgreen元件插入rosa26基因位点，其中tbx1 cdna为包含含有编码tbx1蛋白质的开放阅读框的核酸序列，如seq id no:2所示(图7)。在cre介导的loxp位点重组后，stop元件被切除，tbx1得以表达。该rosa26-stop-tbx1/stop-tbx1(tbx1oe)品系小鼠可健康存活。[0139](2)转录测序和分析：使用ls试剂(thermofisher science)提取rna，并按照illumina平台建库测序方法，使用1μg全rna进行高通量测序。每个样本生成至少1500万条原始配对序列(paired-end reads)。使用star(2.5.2b，mit license)将原始序列与小鼠基因组(gencode，grcm38，open access)进行比对。基因表达水平以单个基因为单位进行统计。用r语言分析包deseq2(1.20.0版，lgpl license≥3)鉴定差异表达的基因(鉴定标准按倍数变化≥1.5且p值≤0.05)。然后用metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/menu/term_service)对进行差异基因进行功能分析。[0140](3)心肌梗死动物模型：心肌梗死实验选用8-12周龄小鼠，方法参照之前的文献描述并稍作修改。简要实验步骤如下：[0141]小鼠气管插管后连接呼吸机(harvard apparatus)，异氟烷维持麻醉浓度为3％-5％，通气频率100次/分钟，潮气量350ul.结扎小鼠心脏冠状动脉左前降支诱发心肌梗死。假手术组除了没有结扎冠状动脉外其他手术步骤与实验组一致。动物苏醒后，迅速皮下注射丁丙诺啡(0.1mg/kg)，24小时后再注射一次。[0142](4)测量心脏功能：在心脏冠状动脉左前降支结扎7天、14天、28天后行经胸廓的心脏超声检测。使用vevo 2100系统(visual sonics)，所用探头频率为30mhz，帧率为30帧/秒。测量是采集图像为左心室心动周期中的长轴图像横截面，使用以下公式计算左心室收缩末期容积(lvesv)，舒张末期容积(lvedv)和左心室射血分数(lvef)。[0143][0144][0145]实施例1[0146]心肌梗死后tbx1在淋巴内皮激活表达[0147]通过构建小鼠心梗模型诱导成年小鼠心梗后，tbx1在心脏内皮细胞中表达量持续增高，且90％的tbx1表达阳性细胞是淋巴管内皮细胞(图1a-1c)。[0148]实施例2[0149]心脏淋巴管内皮细胞特异性敲除tbx1导致心梗后修复障碍[0150]构建了tbx1淋巴管内皮细胞特异性敲除小鼠(图2a)，同时诱导对照组和敲除组小鼠心梗。与对照组相比，tbx1缺失小鼠在心梗后修复变差，组织粘连严重，室壁瘤形成(图2b)。组织学检验表明，心脏中炎症消退减慢(图2c)。心脏射血功能减低及左室舒张末期容积变大(图2d-2e)。细胞学检验发现心脏淋巴管再生明显障碍(图2f-2g)。[0151]内皮转录组测序(图3a)及免疫荧光染色(图3b)显示，tbx1缺失能影响淋巴管增生基因表达显著改变：在心梗后一周心脏,促进淋巴管内皮生长的基因dtx1、dtx3、sema4c、foxc2等基因表达在心脏内皮细胞中下降。同时,抑制淋巴管内皮生长的基因notch1达升高(图3c)。[0152]实施例3[0153]tbx1调控心梗后自身免疫反应[0154]用免疫沉淀反应结合高通量测序法(chip-seq)检测tbx1作为转录因子在心脏内皮细胞基因组上的结合位点，与自身免疫耐受相关的基因明显富集，表明tbx1可能在心梗后调控自身免疫反应(图2h-2i)。[0155]内皮特异转录组显示，tbx1缺失导致内皮细胞中与调控免疫功能的mrna水平显著降低，例如icam1、ccl21、ccl28等。icam1是细胞表面黏附蛋白，对白细胞迁移，抑制白细胞自身免疫活性具有重要作用。ccl21和ccl28是调控免疫微环境的细胞因子，高浓度ccl21和ccl28能吸引调节性t细胞等具有免疫抑制功能的细胞进入炎症部位，减少自身免疫反应。同时，免疫荧光实验表明，小鼠心梗造模7天后,tbx1缺失小鼠的淋巴管内皮细胞表达的icam1、ccl21和ccl28的蛋白水平明显减少(图4a-b)。[0156]单细胞rna测序分析发现cd8+t细胞在tbx1缺失小鼠心脏中增殖活跃，细胞数目显著升高(图5a-5f)，而且具有与对照组cd8+t细胞相同毒性(图5g)。mhc i四聚体染色进一步显示f-cko组中针对α-心肌球蛋白的cd8+t细胞显著升高(图5h-5j)，提示tbx1敲除后导致心梗后自身免疫反应升高。[0157]实施例4[0158]tbx1缺失导致心梗后炎症巨噬细胞数量增加[0159]在成年tbx1缺失小鼠中行冠脉结扎心梗建模。在建模后第7天用流式细胞分析巨噬细胞亚群数量。结果发现，高表达f4/80、低表达ly6c的m2型巨噬细胞(这类细胞具有促进再生、介导炎症消退的功能)在tbx1缺失组中明显减少；同时，低表达f4/80、高表达ly6c的m1型巨噬细胞(这类细胞的富集通常表明组织处于炎症期，长期累积会导致慢性炎症及自身免疫反应)数量在tbx1缺失组中显著增加(图6a-b)。[0160]免疫组化染色也显示，心梗后第7天tbx1缺失组的心脏梗死部位m2巨噬细胞细胞数目减少(图6c-d)。[0161]实施例5[0162]淋巴管内皮过表达tbx1基因激活淋巴管内皮细胞增生[0163]淋巴管内皮细胞更有可能作为心梗损伤修复的重要功能细胞发挥作用。在心梗急性炎症期向修复期转变阶段，tbx1驱动淋巴管内皮细胞转录组改变，不仅能促进心脏淋巴管的再生，而且可以赋予其额外的免疫调控作用，从而抑制心梗后自身免疫反应，防止自身反应性t细胞持续攻击自身组织，造成慢性炎症。因此，在本实施例中，以淋巴管内皮为靶细胞，通过过表达tbx1，研究针对调控心脏免疫微环境来治疗心梗的可行性。[0164]首先构建了rosa26stop-tbx1-zg等位基因(tbx1oe小鼠，图7)。淋巴管特异prox1cre品系小鼠与tbx1 oe小鼠杂交获得双杂合小鼠。在成年双杂合小鼠中灌注tamoxifen诱导淋巴管内皮tbx1过表达。通过转录组测序技术分析心脏中淋巴管内皮基因表达谱改变，检测增强tbx1表达后的分子生物学效应及潜在靶点基因。[0165]结果发现，在成年小鼠心脏淋巴管中激活tbx1表达一周后，收集tbx1oe小鼠心脏cd31+内皮细胞，行转录组分析。[0166]结果显示，激活tbx1能增强心脏内皮细胞中增殖相关基因的表达，例如，top2a、mki67、cenpe、aurkb等表达水平均增加2倍以上(n＝3，p《1x10-5)(图8)。[0167]实施例6[0168]淋巴管内皮过表达tbx1对心梗后修复的影响[0169]淋巴管特异prox1cre品系小鼠与tbx1 oe小鼠杂交获得双杂合小鼠。在成年双杂合小鼠中灌注tamoxifen诱导淋巴管内皮tbx1过表达，一周后行冠脉结扎心梗建模。在建模后7、14、60天后用心脏超声法测量心脏功能。[0170]结果表明，tbx1过表达的小鼠在心梗2周后心脏射血分数显著优于对照组(图9a)，且可持续到心梗后2月，左心室舒张末期容积相应减少(图9b)。同时，组织学分析显示心脏心梗后60天tbx1oe小鼠瘢痕组织面积明显减少(图9c-d)。[0171]实施例7[0172]淋巴管内皮过表达tbx1降低心脏中细胞毒作用cd8+t细胞比例[0173]淋巴管特异prox1cre品系小鼠与tbx1 oe小鼠杂交获得双杂合小鼠。在成年双杂合小鼠中灌注tamoxifen诱导淋巴管内皮tbx1过表达，一周后行冠脉结扎心梗建模。在建模后第7天用流式细胞术分析cd8+t细胞亚群数量。[0174]结果表明，表达细胞表面抗原pd-1的耗竭性cd+8t细胞数量在tbx1oe组中明显增加，且tbx1oe组中细胞因子tnfα的表达水平在cd8+t中明显降低(图10a)。同时，具有免疫抑制功能的foxp3+cd25+调节性cd8+t细胞数量在tbx1oe组中明显升高(图10b)。[0175]讨论[0176]心梗后急性炎症发生及损伤修复是自我驱动的复杂过程，包括了各类免疫细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞等多种细胞类型参与，心梗后修复再生的研究大多围绕这些细胞类型开展。[0177]本发明的结果提示，淋巴管内皮细胞更有可能作为心梗损伤修复的重要功能细胞发挥作用。在心梗急性炎症期向修复期转变阶段，tbx1驱动淋巴管内皮细胞转录组改变，不仅可以促进淋巴管内皮细胞增殖，更能赋予其额外的免疫调控作用，从而抑制心梗后自身免疫反应，防止自身反应性t细胞持续攻击自身组织，造成慢性炎症。本发明首次意外地发现：tbx1在心脏淋巴内皮细胞中具有调控再生微环境、协调促进心梗修复再生的作用。tbx1可通过淋巴管内皮细胞，对心梗后损伤修复起到协助作用。[0178]本发明的另一特色是首次揭示了针对心梗修复期起始阶段出现的免疫调控修复再生机制，这一机制具有特殊的阶段性和细胞类型特异性，有别于既往的免疫干预心梗修复再生研究。既往的研究表明不加选择的炎症抑制并不利于心梗修复，目前的免疫干预治疗心梗临床研究都没有显示出明确的治疗效益。因此，本发明将为心梗后修复再生的有序调控机制提供新的维度，通过增强这一全新内源性修复再生机制，形成促进心梗损伤后再生修复的新策略与新方案。此外，抑制自身免疫反应创造的良好微环境，对细胞移植进行心梗修复再生也能创造良好的条件。[0179]心脏是有自身免疫倾向的器官。某些心肌细胞特异的蛋白通常在胸腺中不表达，使得针对心肌特异蛋白的自身反应性t细胞不能通过中枢耐受机制被清除，因而被释放到外周血液中。心脏损伤后心肌自身抗原被释放,从而激活自身反应性t细胞,导致自身免疫反应。除了缺血、缺氧引起的急性心肌损伤外,其它一些导致心肌损伤的疾病：例如心肌炎、一些特发性扩张性心肌病、chagas'心肌病、以及风湿性心脏病等都与持续的自身免疫反应相关。因此，本发明的研究提示，过表达tbx1也可用来治疗除心梗外的其它与自身免疫反应相关的心脏疾病。[0180]同时，尽管本发明中呈现的机制主要基于心脏损伤模型，但是，tbx1所调节的和淋巴管内皮生长相关基因都是淋巴管内皮细胞普遍表达的基因，这些tbx1调控的下游基因在其他组织的淋巴管内皮内皮细胞中也有相似的功能。因此，相似的机制能用于治疗各组织的淋巴管异常相关疾病，例如，淋巴管发育不良造成的原发性淋巴水肿、由于淋巴管破裂或阻塞造成的继发性淋巴水肿，turner综合征、黄甲综合征、hennekam综合征等遗传综合征所呈现的淋巴管水肿。[0181]在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。









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