构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法以及通过该方法构建的重组需钠弧菌及其应用与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于基因工程菌领域，具体而言，涉及构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法以及通过该方法构建的重组需钠弧菌及其应用。背景技术：2.香叶醇(geraniol)及其酯类衍生物被经常使用为日用香精的原材料。其无色，有着香甜的玫瑰气息和柑橘类植物的味道，常被用于制作香水和香精。其液体状态类似油，因此熔点低，沸点高，可溶于油。香叶醇可以制作多种药物。其提取物可治疗肝癌，治疗慢性支气管炎，制作抗菌剂，及驱虫剂等等。经过化学处理，可制取香叶醇酯(如乙酸香叶酯、甲酸香叶酯)、柠檬醛、香草醛、香草醇、维生素a、紫罗兰酮和羟基香草醛。3.香叶醇可从九里香(murraya paniculata)、大蒜(allium sativum)、月桂(laurus nobilis)、玫瑰、牻牛儿苗等植物中提取。其方法需使用大量能量及化学催化剂的添加，并且产生大量的排放污染，且其工业提取需使用大量植物，拥有着环境污染的隐患。而传统生物法生产香叶醇使用大肠杆菌作为底盘细胞，相比于其他方法，生物法应用天然成分，其无需植物添加，其优势为对环境的污染及生产成本大大减少，其不足为生产产量少。4.因此，需要进一步开发新的香叶醇生产方法。技术实现要素：5.因此，本发明的一个目的是提供一种构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法。6.本发明的另一个目的是提供通过上述方法构建的重组需钠弧菌。7.本发明的又一个目的是提供上述重组需钠弧菌应用。8.本发明的再一个目的是提供一种生产香叶醇的方法。9.一方面，本发明提供了一种构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法，该方法包括：将能够表达香叶醇的载体转化入出发菌需钠弧菌中得到重组菌。10.本发明中，所述需钠弧菌的拉丁学名为vibrio natriegens，可以是用于研究生产的模式菌株，例如，atcc 14048，cgmcc 1.8729，等等。11.本发明中，所述能够表达香叶醇的载体是指能够在宿主中实现香叶醇表达的载体，其实例包括但不限于含有香叶醇表达前体和表达途径的质粒载体。12.所述能够表达香叶醇的载体可以由一种载体组成，或者所述能够表达香叶醇的载体可以由多种载体组成以共同实现表达香叶醇的目的。13.在一个实施方式中，所述能够表达香叶醇的载体可以由含香叶醇表达前体的质粒和香叶醇表达途径的质粒组成。14.所述含香叶醇表达前体的质粒可以是指含有甲羟戊酸途径(mva途径)关键基因的质粒。所述香叶醇表达途径的质粒可以是指含有香叶醇合成关键基因的质粒。甲羟戊酸途径(mva途径)关键基因是本领域技术人员公知的，例如，包括idi，pmd，pmk，mk，hmgr，hmgs和atob基因。香叶醇合成关键基因是本领域技术人员公知的，例如，包括gpps和ges合成基因。15.在一个实施方式中，所述含香叶醇表达前体的质粒的序列如seq id no:1所示。16.在一个实施方式中，所述香叶醇表达途径的质粒的序列如seq id no:2所示。17.在一个实施方式中，本发明的构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法包括将如seq id no:1所示的含香叶醇表达前体的质粒和如seq id no:2所示的香叶醇表达途径的质粒共转化入出发菌需钠弧菌(特别是cgmcc1.8729)中得到重组菌。18.本发明中，将能够表达香叶醇的载体转化入出发菌需钠弧菌的方法为本领域技术人员熟知的，包括但不限于，化学转化法，电击法，等等。19.另一方面，本发明提供了通过上述方法构建的重组需钠弧菌。20.又一方面，本发明提供了上述重组需钠弧菌用于生产香叶醇的应用。21.再一方面，本发明提供了一种生产香叶醇的方法，包括使用上述重组需钠弧菌生产香叶醇的步骤。22.本发明的生产香叶醇的方法中，优选地，使用lbv2培养基作为发酵培养基，所述用lbv2培养基为包含如下组分的无菌水溶液：21.8g/l nacl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，0.31g/l kcl，4.7g/l mgcl·6h2o。23.本发明开发出一种表达香叶醇的工程菌，能够通过常规的需钠弧菌和lbv2培养基即可进行发酵培养，培养过程中通过iptg诱导，获得高产量的香叶醇表达，约9.97mg/l，比使用大肠杆菌作为底盘细胞产生的香叶醇产量(1.22mg/l)明显提高。附图说明24.图1a为含香叶醇表达前体的质粒的质粒图谱。25.图1b为香叶醇表达途径的质粒的质粒图谱。具体实施方式26.在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。27.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。28.下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。29.所用酶试剂采购自thermofisher公司和new england biolabs(neb)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。所用出发菌株为需钠弧菌，编号为cgmcc 1.8729(购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。30.培养基配方：31.1)大肠杆菌培养基32.lb培养基：5g/l酵母提取物(购自英国oxid公司，产品目录号lp0021)，10g/l蛋白胨(购自英国oxid公司，产品目录号lp0042),10g/l nacl，其余为水。调ph值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。33.lbv2培养基：21.8g/l nacl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，0.31g/lkcl，4.7g/l mgcl·6h2o，其余为水。高压蒸汽灭菌。34.实施例135.具体操作如下：36.1.质粒提取：分别提取含香叶醇表达前体的质粒psc101-talesp2-gpps-ges(编号：bba_k2753019，http://2018.igem.org/team:greatbay_china/design)和香叶醇表达途径的质粒p15a-mva(martin,v.j.j.,pitera,d.j.,withers,s.t.,newman,j.d.,&keasling,j.d.(2003).engineering a mevalonate pathway in escherichia coli for production of terpenoids,21(7),796–802.)。psc101-talesp2-gpps-ges质粒图谱见图1a，psc101-talesp2-gpps-ges序列如seq id no:1所示。p15a-mva质粒图谱见图1b，p15a-mva序列如seq id no:2所示。37.通过cacl2化学转化方法将上述两种质粒分别共转化入需钠弧菌底盘细胞(实验组)和大肠杆菌底盘细胞dh5α(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号cb10102)(对照组)。38.2.培养上面得到的转化入了两种质粒的需钠弧菌和大肠杆菌，进行发酵：发酵体系为50ml，设立3组平行实验，分别命名为需钠弧菌-1、需钠弧菌-2、需钠弧菌-3，以及大肠杆菌-1、大肠杆菌-2、大肠杆菌-3。首先取0.5ml过夜摇菌菌液加入至50ml对应抗性的lb/lbv2液体培养基中,放置37℃，200rpm条件下培养至od600约为0.1，之后更改条件为30℃，200rpm，继续摇菌至od600为0.4-0.6，加入终浓度200μm的iptg做诱导，同时加入15％的肉豆蔻酸异丙酯，30℃,200rpm条件下发酵约3天。其中，需钠弧菌使用液体培养基为lbv2，大肠杆菌使用液体培养基为lb。39.发酵结束后，发酵液离心，静置1h，取上清，过0.22μm有机相滤膜，取上层油状液体作为样品等待gc检测。40.使用日本岛津2010pro气相色谱(gc)检测上述提取得到的香叶醇。41.gc分析香叶醇含量：使用岛津公司的gc-2010pro型气相色谱仪。42.色谱仪的配置为：hp-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器fid，spl分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用aoc-20s型自动进样器，丙酮为洗涤液。43.gc分析程序的设置为：色谱柱：sh-rtx-5，规格30.0m×0.25mm,进样体积1μl,分流比20,气化室温度250℃,色谱柱温度：100℃,fid检测器温度250℃,升温程序合计时间8.8min。44.具体检测并计算结果见表1和表2。45.表1[0046][0047]表2[0048][0049]本发明的重组需钠弧菌，能够通过常规的需钠弧菌和lbv2培养基即可进行发酵培养，培养过程中通过iptg诱导，获得高产量的香叶醇表达，约9.97mg/l，比使用大肠杆菌作为底盘细胞产生的香叶醇产量(1.22mg/l)明显提高，具有较强的香叶醇工业化潜力。









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