与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-R及其制备方法与应用与流程

有机化合物处理,合成应用技术与sars-cov-2刺突蛋白特异性结合的多肽kvp-r及其制备方法与应用技术领域1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种与sars-cov-2刺突蛋白(尤其是sars-cov-2表面刺突s1蛋白)特异性结合的多肽，命名为kvp-r，以及该多肽的制备方法与应用。背景技术：2.近年在全球蔓延并暴发大流行的新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)，病原是一种新型冠状病毒sars-cov-2。当前对于新型冠状病毒肺炎的治疗药物主要是广谱的抗病毒药物和对症的药物，尚缺少有效的靶向药，因而急需开发针对新型冠状病毒肺炎的治疗药物。技术实现要素：3.本发明的目的，第一方面，提供一种与sars-cov-2刺突蛋白特异性结合的多肽，命名为多肽kvp-r，为含有以下氨基酸排列的多肽：gdlfddsnldpfrdristrr。4.其末端用含巯基的肽片段修饰；优选的，所述含巯基的肽片段的氨基酸排列为ccpppp。5.所述多肽的氨基酸排列的通式为：6.gdlfddsnldpfrdristrr、或7.ccppppgdlfddsnldpfrdristrr。8.第二方面，本发明提供了制备上述多肽的方法，使用标准固相多肽合成方法合成得到。9.第三方面，本发明提供了上述多肽在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用，优选的，所述新型冠状病毒为sars-cov-2。10.第四方面，本发明提供了上述多肽在制备用于阻断sars-cov-2表面刺突s1蛋白与血管紧张素酶2(ace2)结合的阻断剂中的应用。11.所述血管紧张素酶2(ace2)存在于纤毛支气管上皮细胞或ii型肺细胞表面。12.该应用中，利用所述多肽特异性地阻断sars-cov-2表面刺突s1蛋白与血管紧张素酶2(ace2)结合。具体为：13.利用所述多肽特异性地与sars-cov-2表面刺突s1蛋白结合，以阻断sars-cov-2表面刺突s1蛋白与血管紧张素酶2(ace2)结合。或14.利用所述多肽特异性地与sars-cov-2表面刺突s1蛋白亚基的rbd结构域结合，以阻断sars-cov-2表面刺突s1蛋白与血管紧张素酶2(ace2)结合。15.基于以上几方面内容，经实验证明，本发明提供的与sars-cov-2表面刺突s1蛋白特异性结合的多肽通过与s1蛋白的结合，可以阻断sars-cov-2病毒与其宿主细胞表面的关键靶标蛋白血管紧张素酶(ace2)蛋白的结合，从而有潜力为新型冠状病毒肺炎的治疗提供可行的靶向药物。附图说明16.图1为多肽kvp-r14对s1蛋白的结合能力检测曲线；17.图2为多肽kvp-r14对rbd蛋白的结合能力检测曲线；18.图3为与多肽kvp-r14共孵育后s1蛋白结合人肺癌细胞系a549细胞能力的western blot检测胶图；19.图4为与多肽kvp-r14共孵育后rbd蛋白结合a549细胞能力的western blot检测胶图；20.图5为与多肽kvp-r14共孵育后s1蛋白结合293t-ace2+细胞能力的western blot检测胶图；21.图6为与多肽kvp-r14共孵育后rbd蛋白结合293t-ace2+细胞能力的western blot检测胶图；22.图7为与多肽kvp-r14或多肽kvp-r14n共孵育后sars-cov-2假病毒对293t-ace2+细胞的感染率统计结果柱状图；23.图8为与不同浓度的多肽kvp-r14n共孵育后sars-cov-2假病毒对293t-ace2+细胞的感染率统计结果柱状图；24.图9为多肽kvp-r14对293t-ace2+细胞活性影响的统计结果柱状图；25.图10为多肽kvp-r14n对293t-ace2+细胞活性影响的统计结果柱状图。具体实施方式26.研究已经证实，sars-cov-2通过其表面刺突蛋白s1亚基的rbd结构域与纤毛支气管上皮细胞和ii型肺细胞表面的血管紧张素酶2(ace2)结合，致细胞感染，从而使人罹患新型冠状病毒肺炎，且目前没有用于治疗该疾病的特效药。本发明通过人工合成的方式制备得到一类与sars-cov-2表面刺突蛋白s1亚基或其rbd结构域特异性结合的多肽，命名为多肽kvp-r，其可为氨基酸排列通式为gdlfddsnldpfrdristrr(记为kvp-r14n)的多肽；或者在kvp-r14n的末端用肽片段ccpppp修饰，可为氨基酸排列通式为ccppppgdlfddsnldpfrdristrr(记为kvp-r14)的多肽，在kvp-r14中引入巯基，目的是通过巯基使多肽与含金元素的物质(例如金纳米颗粒)结合，以利于在应用中例如对多肽进行检测与识别。实验验证了该多肽可阻断s1蛋白与ace2蛋白的结合，从而阻止sars-cov-2感染上皮细胞和肺细胞，可用作靶向治疗新型冠状病毒肺炎的药物。27.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。28.除非特别指明，以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液均为1×pbs溶液(ph＝7.4)。29.实施例1：多肽及其制备30.该实施例通过标准固相多肽合成方法制备得到本发明提供的靶向sars-cov-2表面刺突蛋白s1的两条多肽，代号分别为kvp-r14n和kvp-r14，统称为kvp-r，两者的氨基酸排列如下表1所示。31.表1：多肽的氨基酸排列32.编号代号排列1#kvp-r14ngdlfddsnldpfrdristrr2#kvp-r14ccppppgdlfddsnldpfrdristrr33.经高效液相色谱法和质谱的鉴定，确证得到的产品为表1中的目标多肽，两条多肽均为白色粉末，纯度均≥98％。其中代号为kvp-r14的多肽为在代号为kvp-r14n的多肽的末端引入ccpppp修饰，这种修饰使得在多肽kvp-r14中引入了巯基，该巯基使多肽kvp-r14可以与金(例如金纳米颗粒)结合(例如实施例2利用该结合实现对多肽结合能力的检测)。34.为了验证表1中所示的多肽(kvp-r14n和kvp-r14)的生物学效应，在以下所有实施例中均用完全培养基(商购)将多肽kvp-r14n和kvp-r14配制成浓度为10mm的母液；以及为了检测多肽kvp-r的结合能力，用双蒸水(ddh2o)将多肽配制成浓度为0.5mg/ml的多肽溶液。35.实施例2：多肽kvp-r的结合能力36.该实施例利用石英晶体微天平法(qcm)检测实施例1合成制备的多肽kvp-r14(该检测中需利用在该多肽中引入的巯基)与sars-cov-2的s1蛋白或其rbd段(均购自北京义翘神州科技股份有限公司)的结合能力，其中使用的四通道耗散型石英微天平购自biolin scientific。37.实验2.1：多肽kvp-r与s1蛋白的结合能力38.(1)使用清洗液(浓硫酸和双氧水体积比3:1)清洗四通道耗散型石英微天平的金涂层石英芯片3次，每次三分钟，并用ddh2o冲洗；39.(2)按照四通道耗散型石英微天平操作说明，将浓度为0.5mg/ml的kvp-r14多肽溶液与金涂层石英芯片室温孵育30min使多肽kvp-r14分子通过巯基结合在金涂层石英芯片上；40.(3)用ddh2o冲洗芯片，并用氮气吹干。将芯片嵌入反应室，以pbs配制的浓度为13nm的s1蛋白为流动相，经过管路流经金涂层石英芯片，qcm检测s1蛋白与多肽kvp-r14的结合。41.结果如图1所示，可见s1蛋白流动相流经管路时，金涂层石英芯片振荡频率降低，表明s1蛋白结合到了多肽kvp-r14上。42.实验2.2：多肽kvp-r与rbd段蛋白的结合能力43.实验2.2的具体操作与上述实验2.1的操作相同，不同之处仅在于使用以pbs配制的浓度为20nm的rbd蛋白溶液替换s1蛋白溶液作为流动相。44.多肽kvp-r14与rbd段的结合能力的qcm检测结果如图2所示，可见rbd蛋白流动相流经管路时，金涂层石英芯片振荡频率降低，表明rbd蛋白结合到了多肽kvp-r14上。45.综上实验结果，证明多肽kvp-r(kvp-r14和kvp-r14n)能与sars-cov-2的s1蛋白或其rbd段结合。46.实施例3：多肽kvp-r阻止s1蛋白、rbd蛋白与靶细胞的结合47.该实施例中以人肺癌细胞系a549细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)和过表达ace2蛋白的293t细胞(293t-ace2+)(购自北京义翘神州科技股份有限公司)为靶细胞验证模拟实施例1合成制备的多肽kvp-r阻止sars-cov-2的s1蛋白或rbd蛋白与靶细胞的结合效应。48.实验3.1：多肽kvp-r对s1蛋白与人肺癌细胞系a549细胞结合能力的影响49.(1)将a549细胞以2×105cells/well的密度接种于6孔板中，37℃培养箱中过夜培养，使细胞贴壁；50.(2)将s1蛋白用pbs稀释至1μm的s1蛋白溶液，再将其在室温下与0.1μm、1μm、10μm、100μm(分别由10mm的kvp-r14多肽母液经完全培养基稀释制备)的多肽kvp-r14共孵育1h，同步设置不与多肽kvp-r14共孵育的s1蛋白溶液作为对照组；51.(3)将上述s1蛋白与多肽kvp-r14的混合液加入到细胞培养体系中，使其中的s1蛋白终浓度均为10nm；52.(4)共培养1h后，用pbs洗两遍，用ripa裂解液裂解细胞抽提总蛋白，用western blot方法检测总蛋白中s1蛋白的含量。53.结果如图3所示，可见对照组有较强的s1蛋白阳性信号，表明s1蛋白与a549细胞发生了结合；而当s1蛋白先与多肽kvp-r14孵育1h，再加入到细胞培养体系中，s1蛋白信号的强度明显降低，表明在1nm至1000nm的多肽浓度范围内，多肽kvp-r14抑制了s1蛋白对a549细胞的结合。54.实验3.2：多肽kvp-r对rbd蛋白与人肺癌细胞系a549细胞结合能力的影响55.实验3.2的具体操作同上述实验3.1，不同之处仅在于用rbd蛋白溶液替换s1蛋白溶液与不同浓度的kvp-r14多肽溶液共孵育。56.western blot方法检测总蛋白中rbd蛋白的含量的结果如图4所示，可见对照组有较强的rbd蛋白阳性信号，表明rbd蛋白与a549细胞发生了结合；而与多肽kvp-r14孵育之后的rbd蛋白在a549细胞上的结合量显著少于对照组，表明多肽kvp-r14抑制了rbd蛋白对a549细胞的结合。57.实验3.3：多肽kvp-r对s1蛋白与细胞系293t-ace2+细胞结合能力的影响58.实验3.3的具体操作同上述实验3.1，不同之处仅在于用293t-ace2+细胞替换a549细胞作为靶细胞。59.western blot方法检测总蛋白中s1蛋白的含量的结果如图5所示，可见对照组有较强的s1蛋白阳性信号，表明s1蛋白与293t-ace2+细胞发生了结合；而当s1蛋白先与多肽kvp-r14孵育1h，再加入到细胞培养体系中，s1蛋白信号的强度明显降低，表明多肽kvp-r14抑制了s1蛋白对293t-ace2+细胞的结合。60.实验3.4：多肽kvp-r对rbd蛋白与人肺癌细胞系293t-ace2+细胞结合能力的影响61.实验3.4的具体操作同上述实验3.2，不同之处仅在于用293t-ace2+细胞替换a549细胞作为靶细胞。62.western blot方法检测总蛋白中rbd蛋白的含量的结果如图6所示，可见对照组有较强的rbd蛋白阳性信号，表明rbd蛋白与293t-ace2+细胞发生了结合；而与多肽kvp-r14孵育之后的rbd蛋白在293t-ace2+细胞上的结合量显著少于对照组，表明多肽kvp-r14抑制了rbd蛋白对293t-ace2+细胞的结合。63.综上实验结果，证明多肽kvp-r(kvp-r14和kvp-r14n)能sars-cov-2的s1蛋白或rbd蛋白与靶细胞(人肺癌细胞系a549细胞和人肺癌细胞系293t-ace2+细胞)结合。64.实施例4：多肽kvp-r对sars-cov-2假病毒的中和能力65.该实施例利用假病毒中和法检测实施例1制备的多肽(kvp-r14和kvp-r14n)对sars-cov-2侵染细胞的阻断效应，其中所使用的sars-cov-2假病毒(psv)购自吉满生物科技(上海)有限公司，其带有荧光素酶和绿色荧光蛋白(gfp)标签，具体包括以下操作。66.(1)将293t-ace2+细胞接种于96孔板中，每孔2×104个细胞，过夜培养使其贴壁；67.(2)将带有荧光素酶和绿色荧光蛋白(gfp)标签的假病毒(＞106copies/ml)分别与10μm的多肽kvp-r14和kvp-r14n(分别由10mm的kvp-r14和kvp-r14n多肽母液经完全培养基稀释制备)混合孵育1h，以及分别与剂量梯度为100μm、10μm、1μm、100nm、10nm、1nm(分别由10mm的kvp-r14n多肽母液经完全培养基稀释制备)的多肽kvp-r14n混合孵育1h；68.(3)将混合孵育后的假病毒多肽混合液加入到步骤(1)的细胞培养体系中感染293t-ace2+细胞，37℃下感染1h后换用正常培养基继续培养47h。培养结束后，pbs洗一次细胞，采用荧光素酶检测试剂盒(普洛麦格公司，货号e1500)检测化学发光，并据此计算不同组别中假病毒的感染率。69.结果如图7所示，其中psv表示未与多肽孵育的sars-cov-2假病毒的感染率，kvp-r14和kvp-r14n分别表示使用10μm的多肽与sars-cov-2假病毒混合孵育后sars-cov-2假病毒对293t-ace2+细胞的感染率，明显可见，同等剂量下，多肽kvp-r14和多肽kvp-r14n均具有较强的和基本相同的假病毒中和能力。图8示出了使用1nm～100μm的剂量范围的多肽kvp-r14n与sars-cov-2假病毒共孵育后假病毒sars-cov-2对293t-ace2+细胞的感染率，可见在不同的剂量浓度下，多肽kvp-r14n均显示出对假病毒较强的中和能力，且中和能力在50％左右。70.综上实验结果，证明多肽kvp-r(kvp-r14和kvp-r14n)对sars-cov-2假病毒具有较强的中和能力，中和能力在50％左右。71.实施例5：多肽的细胞毒作用72.该实施例利用293t-ace2+细胞检测实施例1制备的多肽kvp-r14和kvp-r14n的细胞毒作用，具体包括以下操作。73.(1)取对数期生长的293t-ace2+细胞，调整细胞密度为105cells/ml，接种于96孔板中，每孔100μl；74.(2)取多肽kvp-r14和kvp-r14n分别加入细胞培养体系中，使培养基中的多肽终浓度分别为1nm、10nm、100nm、1μm、10μm、100μm，37℃培养48h；75.(3)培养结束后弃上清后用pbs洗一次，每孔加入cell counting kit-8(cck-8)工作液(cck-8工作液是由cck8原液和完全培养基按体积比为1:10混合得到，cck8原液购自dojindo molecular technologies公司)120μl。混匀后37℃孵育3h后检测450nm及630nm(参比波长)处的吸光值，计算细胞活率。76.结果如图9和图10所示，其中图9为多肽kvp-r14在所检测的剂量范围内对293t-ace2+细胞活率的影响，图10为多肽kvp-r14n在所检测的剂量范围内对293t-ace2+细胞活率的影响。可见多肽kvp-r(kvp-r14和kvp-r14n)在所检测的剂量范围内对293t-ace2+细胞活率的影响均不大，结合图7和图8所示的结果，在所检测的剂量范围内的多肽对假病毒sars-cov-2具有较佳的中和能力，因此在所检测的1nm～100μm剂量范围内，多肽对293t-ace2+细胞无细胞毒作用，且具有良好的psv假病毒中和能力。77.综上实施例结果可见，本发明提供的多肽kvp-r可以与sars-cov-2病毒的s1蛋白及其rbd段结合，并由此可以阻断sars-cov-2病毒的s1蛋白及其rbd段与其靶标(例如纤毛支气管上皮细胞和ii型肺细胞表面的血管紧张素酶2(ace2))的结合，并因此可以阻止sars-cov-2病毒感染上皮细胞和肺细胞，并表现出对sars-cov-2假病毒较强的中和能力。78.罹患新型冠状病毒肺炎的感染机理是sars-cov-2病毒通过其表面刺突蛋白s1亚基的rbd结构域与纤毛支气管上皮细胞和ii型肺细胞的血管紧张素酶2(ace2)结合，导致细胞被感染。因此本发明提供的多肽kvp-r不仅仅可以用于制备阻断sars-cov-2病毒的s1蛋白及其rbd段与ace2结合的阻断剂，还可以用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物，实现靶向治疗新型冠状病毒肺炎的目的。79.本发明提供的多肽具有分子量较低、生物活性高、在体内不易产生蓄积等特点，不仅本身可以作为药物，还可用于与其他药物分子(如抗炎药物、抗感染药物等)复合使用，且复合时与其他药物的相互作用较少；同时还具有易于合成和分子修饰、生产成本较低等优势，因此可以大规模生产和应用。80.本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原材料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。81.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。









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