改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法

有机化合物处理,合成应用技术改良高盐-低ph法提取灯盏细辛叶绿体基因组dna的方法技术领域1.本发明涉及植物叶绿体基因组dna提取方法，尤其涉及改良高盐-低ph法提取灯盏细辛叶绿体基因组dna的方法。背景技术：2.灯盏细辛又名灯盏花，为菊科多年生草本药用植物，是中国西南地区特有的物种，灯盏细辛的提取物和活性化合物已被广泛用于治疗脑栓塞、脑血栓、冠心病、心绞痛、急性肾衰竭和肾病综合征，具有极高的药用价值。但是由于连年的过度采挖与使用，极大地耗尽了灯盏细辛的野生资源。3.叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器，作为一个半自主性遗传系统，叶绿体具有相对独立的遗传物质，即叶绿体dna(cpdna)，在研究植物系统发育中具有十分广泛的作用。近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，植物叶绿体基因组的测序工作也取得了一定进展，为研究植物遗传多样性与遗传进化奠定了基础。当前，植物叶绿体基因组的提取方法有很多，如蔗糖密度梯度离心法，percoll密度梯度离心法，和改良高盐-低ph法等。传统的密度梯度离心法更适合于提取禾本科和豆科植物的叶绿体dna，但该方法提取成本较高，耗时长且dna得率低，难以广泛应用。而改良高盐-低ph法具有可简单、快速获取完整的叶绿体及高质量叶绿体dna的特点。4.当前有关灯盏细辛叶绿体基因组的提取方法尚未见报道，且国内外对于灯盏细辛叶绿体基因组的研究甚少。因此，提取出高质量的灯盏细辛叶绿体基因组dna，对探究灯盏细辛的遗传多样性，灯盏细辛种质资源的保护、评价及科学利用具有非常重要的意义。技术实现要素：5.本发明的目的是提供改良高盐-低ph法提取灯盏细辛叶绿体基因组dna的方法，利用该方法提取得到的dna结构完整、质量高、纯度好，未出现降解现象，能够满足后续测序工作的标准和要求。6.本发明提供的一种灯盏细辛叶绿体基因组dna的提取方法，包括如下步骤：7.(1)叶绿体分离：将经饥饿处理的灯盏细辛叶片加入缓冲液a中进行匀浆，过滤，收集滤液；对所述滤液进行第一次离心，收集上清液；对所述上清液进行第二次离心，收集绿色沉淀，得到粗叶绿体；8.(2)叶绿体纯化：在步骤(1)得到的粗叶绿体中加入缓冲液b，轻悬，离心，收集沉淀，得到叶绿体；9.(3)叶绿体裂解：在步骤(2)得到的叶绿体中加入缓冲液c，再加入蛋白酶进行温育，冷却；10.(4)叶绿体dna的提取：从步骤(3)裂解后的体系中提取叶绿体dna，得到所述叶绿体基因组dna。11.上述的制备方法，步骤(1)中，所述灯盏细辛叶片与所述缓冲液a的比例可为20g：60～100ml。具体可为20g：100ml；12.所述缓冲液a的ph值可为3.8；所述缓冲液a可由下述组分组成：1.25mol/l nacl，0.25mol/l抗坏血酸，10mmol/l焦亚硫酸钠，50mmol/l ph值为8.0的tris-hcl，7mmol/l ph值为8.0的edta，1％w/v的pvp-40(1％w/v表示质量浓度为10g/l，pvp-40表示k值为40的聚乙烯吡咯烷酮)，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/l二硫苏糖醇和余量的水。13.上述的制备方法，步骤(1)中，所述第一次离心的离心力可为200～500×g，具体可为500×g；时间可为10～20min，具体可为20min；14.所述第二次离心的离心力可为2500～3500×g，具体可为2500×g；时间可为12～20min，具体可为12min。15.上述的制备方法，步骤(2)中，所述缓冲液b的体积可为所述缓冲液a体积的1/4；16.所述缓冲液b的ph值可为8.0；所述缓冲液b可由下述组分组成：1.25mol/l nacl，50mmol/l ph值为8.0的tris-hcl，25mmol/l ph值为8.0的edta，1％w/v pvp-40，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/l二硫苏糖醇和余量的水。17.上述的制备方法，步骤(2)中，所述离心的离心力可为2500～3500×g，具体可为2500×g；时间可为12～20min，具体可为12min。18.上述的制备方法，步骤(3)中，所述缓冲液c的体积可为所述缓冲液b体积的1/25；19.所述缓冲液c的ph值可为8.0；所述缓冲液c可由下述组分组成：50mmol/l tris-hcl，25mmol/l ph值为8.0的edta，1.25mol/l nacl，2.0％十二烷基硫酸钠和余量的水。20.上述的制备方法，步骤(3)中，所述蛋白酶的体积可为缓冲液c体积的0.3％～0.4％；所述蛋白酶的浓度可为20mg/ml；21.所述蛋白酶可为蛋白酶k；22.所述温育的温度可为50～60℃，具体可为55℃；时间可为3～5h，具体可为3h。23.上述的制备方法，步骤(4)中，所述提取的步骤如下：采用溶剂ⅰ对步骤(3)裂解后的体系进行抽提，混匀后进行第一次离心，收集上清液，得上清液ⅰ；24.在所述上清液ⅰ中加入溶剂ⅱ进行第二次离心，收集上清液，得上清液ⅱ；25.在所述上清液ⅱ中加入溶剂ⅲ，混匀后沉降，进行第三次离心，收集沉淀，得到所述叶绿体基因组dna。26.上述的制备方法，步骤(4)中，所述裂解后的体系与所述溶剂ⅰ的体积可相等；所述溶剂ⅰ可由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇组成；所述第一次离心的离心力可为10000～12000×g，具体可为12000×g；时间可为10～20min，具体可为10min。27.所述上清液ⅰ与所述溶剂ⅱ的体积可相等；所述溶剂ⅱ可由体积比为24：1氯仿和异戊醇组成；28.所述第二次离心的离心力可为10000～12000×g，具体可为12000×g；时间可为10～20min，具体可为10min。29.上述的制备方法，步骤(4)中，所述上清液ⅱ与所述溶剂ⅲ的体积可相等；所述溶剂ⅲ可为异丙醇；30.所述沉降的温度可为-18～-22℃，具体可为-20℃；时间可为10～30min，具体可为10min；31.所述第三次离心的转速可为10000～12000×g，具体可为12000×g；时间可为20～30min，具体可为20min。32.本发明还提供了一种灯盏细辛叶绿体的提取方法，包括如下步骤：将经饥饿处理的灯盏细辛叶片加入缓冲液a中进行匀浆，过滤，收集滤液；对所述滤液进行第一次离心，收集上清液；对所述上清液进行第二次离心，收集绿色沉淀，得到叶绿体。33.上述叶绿体的提取方法中，所述灯盏细辛叶片与所述缓冲液a的比例为20g：60～100ml；34.所述缓冲液a的ph值为3.8；35.所述缓冲液a由下述组分组成：1.25mol/l nacl，0.25mol/l抗坏血酸，10mmol/l焦亚硫酸钠，50mmol/l ph值为8.0的tris-hcl，7mmol/l ph值为8.0的edta，1％w/v pvp-40(1％w/v表示质量浓度为10g/l，pvp-40表示k值为40的聚乙烯吡咯烷酮)，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/l二硫苏糖醇和余量的水；36.所述第一次离心的离心力可为200～500×g，具体可为500×g；时间可为10～20min，具体可为20min；37.所述第二次离心的离心力可为2500～3500×g，具体可为2500×g；时间可为12～20min，具体可为12min。38.上述叶绿体的提取方法中，所述方法在收集绿色沉淀后还包括将所述沉淀中加入缓冲液b，轻悬，离心，收集沉淀，得到叶绿体的步骤；39.所述缓冲液b的体积为所述缓冲液a体积的1/4；40.所述缓冲液b的ph值为8.0；41.所述缓冲液b由下述组分组成：1.25mol/l nacl，50mmol/l ph值为8.0的tris-hcl，25mmol/l ph值为8.0的edta，1％w/v pvp-40，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/l二硫苏糖醇和余量的水；42.所述离心的离心力可为2500～3500×g，具体可为2500×g；时间可为12～20min，具体可为12min。43.本发明具有如下有益效果：44.(1)本发明以改良高盐-低ph法为基础，建立了高效的灯盏细辛叶绿体dna分离提取方法，为深入开展灯盏细辛叶绿体基因组的测序及研究工作奠定基础。45.(2)本发明方法可简单、快速获取完整的叶绿体及叶绿体dna，所得dna结构完整、质量高、纯度好，未出现降解现象，能够满足后续测序工作的标准和要求。附图说明46.图1为实施例中经过改良高盐-低ph法分离得到的叶绿体沉淀的照片。47.图2为实施例中经过改良高盐-低ph法分离得到的叶绿体(纯化后)显微图片。48.图3为实施例中提取得到的灯盏细辛叶绿体基因组dna的电泳图谱。具体实施方式49.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。50.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。51.实施例1、改良高盐-低ph法提取灯盏细辛叶绿体基因组dna52.一、样品准备与前处理53.供试材料为灯盏细辛无菌苗，种植于中国中医科学院中药资源中心组织培养室，每个样品称约50g，用纱布包裹，于4℃冰箱黑暗处饥饿处理48-72h后，放入保鲜袋内，置于-80℃的低温冰箱中保存备用。54.(1)缓冲液a(ph 3.8)的配制55.1.25mol/l nacl，0.25mol/l抗坏血酸(vc)，10mmol/l焦亚硫酸钠，50mmol/l tris-hcl(ph 8.0)，7mmol/l edta(ph 8.0)，1％pvp-40(w/v)，0.1％bsa(w/v)，1mmol/l dtt(二硫苏糖醇)，bsa和dtt现用现加。pvp-40购自vwr international,llc，货号为0507-500g。56.(2)缓冲液b(ph 8.0)的配制57.1.25mol/l nacl，50mmol/l tris-hcl(ph 8.0)，25mmol/l edta(ph 8.0)，1％pvp-40(w/v)，0.1％bsa(w/v)，1mmol/l dtt。58.(3)缓冲液c(ph 8.0)的配制59.50mmol/l tris-hcl，25mmol/l edta(ph 8.0)，1.25mol/l nacl，2.0％sds。60.二、提取灯盏细辛叶绿体基因组dna61.采用改良高盐-低ph法提取灯盏细辛叶绿体基因组dna，具体步骤如下：62.(1)叶绿体分离63.将经饥饿处理两天的叶片取出，剪成1cm长的小条放入匀浆机中，每20g叶片加入100ml预冷的缓冲液a，将叶片充分匀浆后经8层纱布过滤，收集滤液，再用6层纱布过滤，将滤液收集在50ml离心管中，每管分装25ml。采用差速离心法分离叶绿体，4℃，500×g，离心20min，小心转移上清液到另一离心管。2500×g离心12min，去上清，保留绿色沉淀。所得的叶绿体沉淀要避免光照，以防止淀粉聚集。叶绿体沉淀的照片如图1所示。64.(2)叶绿体纯化65.加入25ml预冷的缓冲液b纯化叶绿体沉淀，用无菌软毛笔轻悬，2 500×g离心12min弃上清，重复该步骤一次。所得沉淀即为纯化的叶绿体，-80℃保存。66.吸取经纯化过后的叶绿体提取液10μl，滴在载玻片上，置于荧光倒置显微镜下进行观察叶绿体形态。实验结果如图2所示，该方法分离得到的叶绿体结构比较完整，基本无破碎和污染，背景较为清晰，所得到的叶绿体含量可观，可保证获得高质量的叶绿体基因组dna。67.(3)叶绿体裂解68.取已纯化的叶绿体，加入1ml缓冲液c，再加入30μl蛋白酶k(质量浓度为20mg/ml)，剧烈摇匀，在55℃条件下温育3h，每隔20min颠倒几次，摇匀。69.(4)叶绿体dna的提取70.水浴结束后冷却至室温，先用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，现配现用)抽提，缓慢混匀后12 000×g离心10min，取上清加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，12 000×g离心10min；取上清液加入等体积的预冷异丙醇，轻柔混匀后于-20℃沉降10min，12000×g，离心20min，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次，晾干(直至无酒精味)，加入50-68℃灭菌水溶解，即可得到叶绿体dna。71.三、叶绿体dna的检测72.(1)叶绿体dna紫外分光光度计检测73.实验方法：取灯盏细辛叶绿体dna溶液1.5μl，使用thermo nano drop 1000紫外光分光光度计测定浓度，根据od260nm与od280nm、od260nm与od230nm的比值对其进行纯度分析。74.实验结果：灯盏细辛叶绿体dna样品浓度为329ng/μl，od260nm与od280nm比值为1.99，说明该dna样品不存在蛋白质、酚类及多糖类的干扰和污染，杂质含量低，纯度较高，od260nm与od230nm的比值为2.23，说明该dna样品中多糖碳水化合物等含量低。综上，改良高盐-低ph法所提取的叶绿体符合试验要求。75.(2)叶绿体dna琼脂糖凝胶电泳检测76.为了进一步鉴定灯盏细辛叶绿体基因组dna的大小和纯度，取灯盏细辛叶绿体dna溶液，在浓度为1％的琼脂糖凝胶上进行了电泳检测。77.实验方法：使用1％的琼脂糖凝胶，加入1μl gelred核酸染料，dna上样量为1μl，biorad电泳仪180v，10min，紫外凝胶成像系统进行拍照，检测dna的完整性。78.实验结果：结果见图3，从图3可以看出，灯盏细辛叶绿体dna目标条带较清晰，无明显拖尾现象，表明提取到的灯盏细辛叶绿体dna纯度较高。









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