包含肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的试剂盒及其用途

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本公开属于生物医药领域，更具体而言，涉及包含肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的试剂盒及其用途。背景技术：2.资料显示，恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，严重影响患者的生活质量。在临床上，手术治疗、放疗和化疗等手段虽然能在短期内缓解恶性肿瘤进程，但患者预后个体差异大，部分患者仍出现复发或转移情况。癌症免疫治疗是继上述三种治疗策略后又一重要的抗肿瘤手段。癌症免疫治疗通过激活患者自体的抗肿瘤免疫应答，实现对肿瘤细胞的有效杀伤，在临床实践中展现出显著疗效。同时，免疫治疗在患者体内能够诱导持久的免疫记忆效应，可有效抑制肿瘤的复发和转移。3.肿瘤新生抗原是肿瘤细胞由“非同义基因突变”产生的特异性氨基酸位点变异的异常蛋白，在正常细胞中不表达，是机体免疫系统可识别的特异性靶点。通过对患者的肿瘤基因组进行高通量测序，筛选出该患者特定的突变位点，从而制备出针对该位点的mrna或蛋白多肽新生抗原疫苗，实现对肿瘤患者的个性化免疫。但是，新抗原多肽药物的稳定性差，体内代谢清除速率快，体内分布缺乏靶向性，抗原呈递细胞摄取量少，这些特点限制了其应用和抗肿瘤疗效的发挥。4.树突状细胞疫苗，是一种有广泛应用潜力的细胞免疫治疗方法。在肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的刺激下，成熟的树突状细胞能够摄取并交叉呈递肿瘤抗原，激活细胞毒性t细胞(ctls)免疫应答并杀伤肿瘤细胞。树突状细胞在外周血和肿瘤组织中的比例很低，因此体外工程化构建树突状细胞疫苗，实现患者过继治疗能够增强ctls的免疫应答，提高免疫治疗效果。技术实现要素：5.本公开的一个目的是提供一种试剂盒，其包含肿瘤新生抗原纳米制剂，以及树突状细胞疫苗。6.本公开的另一个目的是提供所述试剂盒在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。7.本公开的再一个目的是提供肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的组合在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。8.根据本公开的一个方面，其提供了一种试剂盒，其包含肿瘤新生抗原纳米制剂，以及树突状细胞疫苗。9.根据本公开的另一个方面，其提供了所述试剂盒在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。10.根据本公开的再一个方面，其提供了肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的组合在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。11.有益效果12.本公开的试剂盒可以克服现有肿瘤新生抗原疫苗和树突状细胞疫苗的不足，有效用于恶性肿瘤的个性化治疗。使用肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的联合疗法，将肿瘤新生抗原制备成纳米制剂，再联合工程化制备的树突状细胞疫苗，可以有效提高机体的抗肿瘤免疫应答，在多种类型的肿瘤中效果显著。附图说明13.图1是肿瘤新生抗原脂质体、plga纳米粒的透射电镜图，图中a，b分别是脂质体、plga纳米粒的透射电镜图。14.图2是肿瘤新生抗原plga纳米制剂的粒径表征图。15.图3是肿瘤新生抗原plga纳米粒的粒径和单分散度随时间变化情况。16.图4是dc2.4细胞对肿瘤新生抗原plga纳米制剂的摄取流式图。17.图5是肿瘤新生抗原plga纳米粒诱导骨髓来源的树突状系细胞(bmdcs)熟化，表达cd80和cd86分子的流式定量结果，以pbs处理的bmdcs作为对照。18.图6是肿瘤新生抗原plga纳米粒经皮下注射给药24小时后在小鼠腹壁淋巴结内的分布情况；plga纳米粒包载荧光探针dir作为成像荧光分子。19.图7是工程化制备的树突状细胞疫苗与肿瘤新生抗原plga纳米粒经皮下注射给药后，plga纳米粒和树突状细胞疫苗在小鼠模型淋巴结内的分布情况；树突状细胞疫苗由cy5进行标记，小鼠淋巴结经冰冻切片后使用激光共聚焦显微技术检测，图中a,b分别是plga纳米粒在小鼠淋巴结中的离体分布情况、树突状细胞疫苗在小鼠淋巴结切片中的分布情况。20.图8是肿瘤新生抗原plga纳米粒联合工程化制备的树突状细胞疫苗，在小鼠模型中诱导获得性t细胞免疫应答的实验结果。21.图9是肿瘤新生抗原plga纳米粒联合工程化制备的树突状细胞疫苗，在小鼠模型中诱导肿瘤坏死因子α(tnf-α)和干扰素γ(ifn-γ)分泌情况。22.图10是肿瘤新生抗原plga纳米粒联合工程化制备的树突状细胞疫苗，在b16-ova黑色素瘤c57bl/6荷瘤小鼠模型中的药效学评价。23.图11是肿瘤新生抗原plga纳米粒联合工程化制备的树突状细胞疫苗，在4t1乳腺癌balb/c荷瘤小鼠模型中的药效学评价。24.图12是本公开的肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗联合用药示意图。具体实施方式25.为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。26.在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“a或b”：a为真(或存在)且b为伪(或不存在)、a为伪(或不存在)且b为真(或存在)、a和b均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。27.在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。28.若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。29.在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。30.在本文中，对于使用马库什群组(markush group)或选项式用语以描述本发明特征或实例的情形，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或任何个别要素亦可用于描述本发明。举例而言，若x描述成“选自于由x1、x2及x3所组成的群组”，亦表示已经完全描述出x为x1的主张与x为x1及/或x2的主张。再者，对于使用马库什群组或选项式用语以描述本发明的特征或实例的情况，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或个别要素的任何组合亦可用于描述本发明。据此，举例而言，若x描述成“选自于由x1、x2及x3所组成的群组”，且y描述成“选自于由y1、y2及y3所组成的群组”，则表示已经完全描述出x为x1或x2或x3而y为y1或y2或y3的主张。31.以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。32.根据本公开的一个实施方式，其提供了一种试剂盒，其包含肿瘤新生抗原纳米制剂，以及树突状细胞疫苗作为活性成分。33.根据本公开的一个实施方式，所述肿瘤新生抗原纳米制剂是指由肿瘤新生抗原和辅料混合制成的纳米制剂，可以包括包载肿瘤新生抗原信使核糖核酸(mrna)或肿瘤新生抗原蛋白多肽的脂质体，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米粒，聚乳酸共聚物(pla)纳米粒和聚己内酯共聚物(pcl)纳米粒。34.根据本公开的一个实施方式，其中，所述肿瘤新生抗原纳米制剂选自肿瘤新生抗原脂质体和肿瘤新生抗原plga/pla/pcl纳米粒。35.本发明中，所述肿瘤新生抗原(neoantigen)是指由肿瘤细胞突变基因编码的的新生抗原，主要由基因点突变、删除突变、基因融合等产生的与正常细胞表达的基因、多肽或蛋白不一样的异常基因、多肽和蛋白。例如实施例中使用的亲水性抗原肽ova(siinfekl)，疏水性抗原肽b-m27(lcpgnkygm),b-m30(dwenvspelnstdq),4-m27(faicfscllahalnliklvrgrkplsw),4-m32(shrscshqtsapspkalahngtprnai)。36.根据本公开的一个实施方式，其中，所述肿瘤新生抗原脂质体通过以下方法制备：将肿瘤新生抗原和辅料(例如，采用纳米技术和高剪切力条件)制成纳米制剂。其水化平均粒径的分布范围可为50～700nm。在一个实施方式中，所述肿瘤新生抗原纳米制剂是通过使用氢化大豆磷脂(hspc)、胆固醇(chol)、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe-peg)作为辅料制成的脂质体。在另一个实施方式中，所述肿瘤新生抗原纳米制剂是通过使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和聚乙烯醇(pva)作为辅料制成的纳米粒。在又一个实施方式中，所述肿瘤新生抗原纳米制剂是通过使用聚乳酸共聚物(pla)和聚乙烯醇(pva)作为辅料制成的纳米粒。在再一个实施方式中，所述肿瘤新生抗原纳米制剂是通过使用聚己内酯共聚物(pcl)和聚乙烯醇(pva)作为辅料制成的纳米粒。37.根据本公开的一个实施方式，其中，所述肿瘤新生抗原脂质体通过以下方法制备：38.(1)精密称取hspc，chol和dspe-peg，其质量比为hspc:chol:dspe-peg＝(5～6):(0.5～3):(1～3)溶解在有机相中；精密称取疏水性肿瘤新生抗原多肽，其与hspc的质量比为1:(25～5)，溶解在有机相中；将肿瘤新生抗原多肽的有机相与脂质的有机相充分混合均匀；39.(2)在35～45℃范围内减压旋转蒸发2～3小时除去有机溶剂成膜；将亲水性肿瘤新生抗原多肽或mrna溶解在水相中，其与hspc的质量比为1:(25～5)；向成膜脂质中加入溶解有亲水性肿瘤新生抗原的水相，在30℃-90℃条件下水化1小时；随后使用高压或高剪切力条件处理获得的脂质体以获得最终的肿瘤新生抗原脂质体纳米制剂。40.根据本公开的一个实施方式，其中，所述肿瘤新生抗原plga/pla/pcl纳米粒通过以下方法制备：41.(1)将水溶性肿瘤新生抗原以0.1-10mg/ml终浓度溶解在无菌水中，在高压或高剪切力条件下缓慢滴加入plga/pla/pcl的有机相溶液中，plga/pla/pcl的终浓度为0.5-5mg/ml，水相和有机相的混合比例为1:(100-10)；42.(2)将疏水性肿瘤新生抗原以0.1-10mg/ml终浓度溶解在步骤(1)获得的plga/pla/pcl的有机相中，充分搅拌并在高压或高剪切力条件下制备均匀；43.(3)将步骤(2)获得的溶液在高压或高剪切力条件下缓慢滴加入10倍体积的pva的无菌水溶液中，pva的终浓度为0.2-2mg/ml；44.(4)将步骤(3)获得的包载肿瘤新生抗原的plga/pla/pcl纳米粒使用流动的无菌去离子水透析12小时，随后使用高压或高剪切力进行均质，获得肿瘤新生抗原纳米制剂plga/pla/pcl纳米粒。45.根据本公开的一个实施方式，其中，所述的有机相为乙醇、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮中一种或几种。46.根据本公开的一个实施方式，其中，所述的高压和高剪切力条件为：在高压均质机、超声破碎仪、高剪切混合器、或高剪切搅拌器等仪器条件下进行均质。47.根据本公开的一个实施方式，其中，所述树突状细胞疫苗通过以下方法制备：取骨髓源性或脾脏源性或外周血源性的单核细胞，加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白介素-4(il-4)促进其分化，(例如，使用磁珠分选术或流式分选术分选)纯化，以获得树突状细胞疫苗。48.根据本公开的一个实施方式，其中，所述树突状细胞疫苗通过以下方法制备：在将患者自体肿瘤细胞裂解物在含血清的细胞培养基中共培养6～24小时，加入浓度为500～5000ng/ml的脂多糖lps继续培养6～10小时，随后吸取悬浮的树突状细胞，在4～10℃条件下300g离心0.5小时，在生理盐水中重分散为100万～1000万个/ml的细胞悬液，即获得工程化制备的树突状细胞疫苗。其中，所述患者自体肿瘤细胞裂解物来源于患者自体，消化分散为单细胞悬液后，使用次氯酸溶液处理0.5～4小时，次氯酸浓度为50～500μm，与树突状细胞的共培养数目比例为1:10～1:1。49.根据本公开的一个实施方式，其中，所述树突状细胞疫苗通过以下方法制备：50.(1)将肿瘤组织通过组织研磨仪制备成单细胞悬液后，细胞计数，在4℃以300-500g转速离心10-30分钟除去上清，使用浓度为50-500μm的次氯酸溶液重分散为1×107个细胞/ml并孵育0.5-2小时；51.(2)将获得的细胞悬液在4℃以500-1500g转速离心0.5-1小时除去上清，使用无血清细胞培养基洗涤并重分散，在20至-80℃条件下反复冻融3-5次后备用；52.(3)取病患自体血液，采用淋巴细胞分离液和梯度密度离心法分离出单核细胞；使用含10％血清的完全培养基将单核细胞分散为1×106-1×107个/ml并加入细胞培养板内贴壁8-24小时；随后吸弃每孔内悬浮细胞和上清培养基，向其中加入gm-csf和il-4终浓度为10-100ng/ml的完全细胞培养基培养2-3天，培养条件为37℃细胞培养箱，5％二氧化碳浓度；随后对孔内的培养基进行半体积换液并继续培养2天；第5天，对孔内的悬浮细胞进行计数，并按照肿瘤细胞数目比树突状细胞数目比例为1:10-1:1的浓度加入自体肿瘤细胞裂解物共培养；第6天，向孔内加入浓度为500-5000ng/ml的脂多糖lps和20-200ng/ml的ifn-γ继续培养4-16小时；随后吸取悬浮的树突状细胞，在4℃-10℃条件下100-500g离心3-30分钟，在生理盐水中重分散为100万-1000万/ml的细胞悬液，即获得树突状细胞疫苗。53.根据本公开的另一个实施方式，其提供了所述试剂盒在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。54.根据本公开的另一个实施方式，其中，所述恶性肿瘤包括：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、脑癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、肾癌、食道癌、成神经细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤，及由上述肿瘤造成的转移性肿瘤。55.实施例56.以下将通过实施例进一步详细描述本公开。在本公开的实施例中使用的原材料来源如下：57.氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、胆固醇(chol)、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe-peg)均购买于艾伟拓(上海)医药科技有限公司；二甲基甲酰胺溶液、二氯甲烷购买于国药集团化学试剂有限公司(上海)；肿瘤新生抗原多肽ova(gta32313-0918),b-m27(gt30732-1-0906),b-m30(gt30732-2-0906),4-m27(gt30732-3-0906),4-m32(gt30732-4-0906)均购自合肥国肽科技有限公司；聚乙烯醇(pva)购自阿拉丁科技(中国)有限公司；1640培养基和胎牛血清(fbs)购买于加拿大gibco公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素4(il-4)、脂多糖(lps)和干扰素γ(ifn-γ)均购买于美国的peprotech公司；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、磷酸盐缓冲溶液(pbs)购自大连美伦生物技术有限公司；tnf-α，anti-cd11c-fitc，anti-cd86-percp-cy5.5，anti-cd80-pe，anti-cd3-percp-cy5.5，anti-cd8-pe，anti-cd4-fitc，ifn-γ均购自英国ebioscience公司。58.bf16-ova肿瘤细胞、4t1肿瘤细胞均购自中国科学院上海细胞库。59.balb/c小鼠:4-6周龄，18-22g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养条件及实验操作均严格按照中国科学院上海药物研究所实验动物管理和使用伦理委员会的相关要求和标准。60.旋转蒸发仪(heidlph，德国)；高压均质机(microfluidizer，美国)；透射电镜(jeoljem-1230,日本)；激光粒径仪(zen3690,malven,美国)；台式离心机(eppendorf)；二氧化碳培养箱(thermo,美国)；流式细胞仪(bd,calibur,美国)；61.细胞超净工作台(bj-1cd,上海博讯实业有限公司)。62.实施例1：肿瘤新生抗原脂质体的制备和表征63.精密称取氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)，胆固醇(chol)和聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe-peg)，其质量比为hspc:chol:dspe-peg＝5:3:2溶解在二氯甲烷中；精密称取疏水性肿瘤新生抗原多肽b-m27和b-m30(b-m27和b-m30的质量比为1:1)，其与hspc的质量比为1:25，溶解在二氯甲烷中；将肿瘤新生抗原多肽的有机相与脂质的有机相充分混合均匀。在40℃范围内减压旋转蒸发3小时除去有机溶剂成膜；将亲水性肿瘤新生抗原多肽ova或mrna溶解在水相中，其与hspc的质量比为1:25；向成膜脂质中加入溶解有亲水性肿瘤新生抗原的水相，在50℃条件下水化1小时；随后使用高压均质机处理获得的脂质体以获得最终的肿瘤新生抗原脂质体纳米制剂。64.除了使用4-m27和4-m32(其质量比也为1:1)代替疏水性肿瘤新生抗原多肽b-m27和b-m30以外，采用上述相同方法制备另外一种肿瘤新生抗原脂质体纳米制剂。65.图1a是使用透射电镜对获得的包含b-m27和b-m30的肿瘤新生抗原脂质体进行观测得到的透射电镜照片。66.实施例2：肿瘤新生抗原plga纳米粒的制备和表征67.将水溶性肿瘤新生抗原(ova)以10mg/ml终浓度溶解在无菌水中，取1ml在超声条件下缓慢滴加入10ml的聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，plga的终浓度为5mg/ml。将疏水性肿瘤新生抗原b-m27和b-m30(b-m27和b-m30的质量比为1:1)以1mg/ml终浓度进一步溶解在上述制备的plga的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，充分搅拌并混合均匀。取1ml含肿瘤新生抗原的plga溶液，在超声条件下缓慢滴加入10ml的聚乙烯醇pva的无菌水溶液中，pva的终浓度为2mg/ml。将获得的包载肿瘤新生抗原的plga纳米粒使用流动的无菌去离子水透析12小时，随后使用高压均质机进行均质，获得肿瘤新生抗原纳米制剂plga纳米粒(np-ag(b-m27/b-m30))。68.除了使用4-m27和4-m32(其质量比也为1:1)代替疏水性肿瘤新生抗原多肽b-m27和b-m30以外，采用上述相同方法制备另外一种肿瘤新生抗原纳米制剂plga纳米粒，即，np-ag(4-m27/4-m32)。69.除了不加入疏水性肿瘤新生抗原b-m27和b-m30以外，采用上述相同方法制备另外一种肿瘤新生抗原纳米制剂plga纳米粒，即，np-ag(ova)。70.图1b是使用透射电镜对获得的plga纳米粒进行观测得到的np-ag(b-m27/b-m30)的透射电镜照片，plga为球形纳米颗粒。使用激光粒度仪测量np-ag(b-m27/b-m30)，粒径约240nm，其结果参见图2。71.实施例3：包含肿瘤新生抗原纳米制剂(np-ag)和树突状细胞疫苗(dcv)的试剂盒的制备72.将制备好的np-ag(ova)或np-ag(b-m27/b-m30)与dcv等体积混匀即可得到该试剂盒，即dcv-np-ag。73.除了使用4-m27和4-m32代替疏水性肿瘤新生抗原多肽b-m27和b-m30以外，采用上述相同方法制备另外的试剂盒。74.实施例4：dc2.4细胞对肿瘤新生抗原plga纳米制剂的摄取研究75.以fitc标记的ova(siinfekl)作为模型肽，将模型肽(ovafitc)包载在plga纳米粒中，分别用np-ag(ovafitc)和pbs与dc2.4细胞共孵育24h后，用流式细胞术(fcm)检测分析dc2.4细胞对plga纳米粒的摄取。结果如图4所示。76.实施例5：树突状细胞疫苗的工程化制备77.分离出小鼠胫骨和肱骨单核细胞；使用含10％血清的完全培养基将单核细胞分散为2×106个/ml并以1ml/孔加入12孔细胞培养板内贴壁12小时；随后吸弃每孔内悬浮细胞和上清培养基，向其中加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子gm-csf和il-4终浓度为10-100ng/ml的完全细胞培养基培养2-3天，培养条件为37℃细胞培养箱，5％二氧化碳浓度；随后对孔内的培养基进行半体积换液并继续培养2天；第5天，对孔内的悬浮细胞进行计数，并按照肿瘤细胞数目比树突状细胞数目比例为1:1的浓度加入自体肿瘤细胞裂解物共培养；第6天，向孔内加入浓度为1000ng/ml的脂多糖lps和100ng/ml的ifn-γ继续培养8小时。随后吸取悬浮的树突状细胞，在4℃条件下300g离心0.5小时，在生理盐水中重分散为100万-1000万/ml的细胞悬液，即获得工程化制备的树突状细胞疫苗。78.实施例6：肿瘤新生抗原plga纳米粒诱导骨髓来源树突状细胞(bmdcs)熟化的定量研究79.分离出小鼠胫骨和肱骨单核细胞；使用含10％血清的完全培养基将单核细胞分散为2×106并以1ml/孔加入12孔细胞培养板内贴壁12小时；随后吸弃每孔内悬浮细胞和上清培养基，向其中加入gm-csf和il-4终浓度为10-20ng/ml的完全细胞培养基培养2-3天，培养条件为37℃细胞培养箱，5％二氧化碳浓度；随后对孔内的培养基进行半体积换液并继续培养2天；第5天，对孔内的悬浮细胞进行计数并按100万每孔重新铺板，加入磷酸盐缓冲溶液(pbs)，肿瘤新生抗原纳米制剂(np-ag(ova))与bmdc细胞共孵育24小时，用流式细胞仪检测bmdc的熟化程度。结果如图5所示，与pbs相比，np-ag(ova)对bmdc的熟化提高了15％-20％。80.实施例7：肿瘤新生抗原plga纳米粒以及工程化制备的树突状细胞疫苗在小鼠淋巴结内的分布评价81.以dir作为荧光分子，将荧光探针dir包载在plga(ova)纳米粒中，经皮下注射24h后，使用小动物活体光学成像系统(ivis)对小鼠进行成像分析。结果如图6所示。82.应用细胞代谢及click化学技术，将树突状细胞疫苗(dcv)标记上荧光探针cy5(dcv-cy5)，经皮下注射后，使用小动物活体光学成像系统(ivis)监测dcv在小鼠体内的分布，并用共聚焦荧光显微镜(clsm)检测dcv在离体淋巴结内的浸润情况，结果如图7所示。83.实施例8：肿瘤新生抗原plga纳米粒和工程化制备的树突状细胞疫苗联合诱导小鼠体内获得性t细胞免疫应答的研究84.在第1天和第5天用pbs及dcv-np-ag(ova)(树突状细胞疫苗-肿瘤新生抗原纳米制剂)对balb/c小鼠进行免疫，在第8-10天时取小鼠的血液、淋巴结或者脾脏，然后用anti-cd3-percp-cy5.5,anti-cd8-pe,anti-cd4-fitc进行染色，用流式细胞仪检测小鼠体内获得性t细胞免疫应答。同时分析dcv-np-ag(ova)诱导小鼠体内tnfα和ifn-γ分泌的情况。其结果如图8，9所示。85.实施例9：肿瘤新生抗原plga纳米粒和工程化制备的树突状细胞疫苗联合抗黑色素瘤和乳腺癌生长的研究86.在第1天和5天，分别用pbs，肿瘤新生抗原(ag,b-m27和b-m30)，np-ag(b-m27/b-m30)，dcv，dcv-np-ag(b-m27/b-m30)对c57bl/6小鼠进行免疫(每组5-10只小鼠)，第10天在小鼠右侧接种b16-ova肿瘤细胞(1.0×106-2.0×106个细胞/只)。待肿瘤体积约100-200mm3时，每隔两天对小鼠肿瘤进行监测。87.其中涉及b-m27和b-m30疏水性肿瘤新生抗原多肽的试剂的结果如图10所示。实验结果显示dcv-np-ag(b-m27/b-m30)能够显著的预防小鼠黑色素瘤的形成。而dcv和np-ag(b-m27/b-m30)单独使用时对预防小鼠黑色素瘤的形成的作用都不显著。这表明肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗联合用药时取得了协同效应。88.在balb/c小鼠脂肪垫接种4t1肿瘤细胞(1.0×106-2.0×106个细胞/只)，待肿瘤体积长到约100-200mm3时，分别用pbs，np-ag(4-m27/4-m32)，dcv，dcv-np-ag(4-m27/4-m32)对小鼠进行免疫(每组5-10只小鼠)并每隔两天对肿瘤生长进行监测。其中涉及4-m27和4-m32疏水性肿瘤新生抗原多肽的试剂的结果如图11所示。研究表明，相对于其他组，dcv-np-ag(4-m27/4-m32)能够明显抑制小鼠乳腺癌的生长。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!