一种荧光探针、检测方法及应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于荧光探针检测技术领域，尤其涉及一种荧光探针、检测方法及应用。背景技术：2.目前，随着人们生活方式的改变以及环境污染的加剧，癌症的发病率正在逐年增加。近年来，癌症的精准医疗正成为全球热点研究方向，并有望成为治疗癌症的有效方案。癌症的精准医疗，需要在dna分子水平上对个体进行精确的基因诊断。同时癌症的早期诊断可以对后续治疗进行预警并提供依据，其主要依据为基因点突变的发生。因此，基因点突变检测对dna分子水平基因诊断与癌症的早期诊断具有重要意义。3.然而，血液中突变dna的丰度通常较低。研究人员已经开发了许多检测低丰度点突变的方法。目前基因检测方面主要有高分辨溶解曲线法、测序法等检测方法。传统的高分辨溶解曲线法检测方法的原则是，有一个热力学差异的野生和突变链造成一个突变基因，然后聚合酶链反应(pcr)技术用于区分两种类型的链，如droplet digital pcr和cold-pcr。然而，pcr扩增子的长度通常在100～200bp范围内，且单个突变碱基引起的热力学差异很小，因此，这些方法的灵敏度不高。近年来，研究人员开发了基于下一代测序(ngs)的方法，如sanger测序、焦磷酸测序和单分子实时(smrt)测序，极大地将测序检测限降低到约0.02％。然而，这些方法所需的设备非常昂贵，因此增加了检测的成本。4.鉴于传统检测和测序方法的局限性，越来越多的研究人员转向pcr后检测方法，如基于链置换的新型荧光探针法。这一新型荧光探针的工作原理基于toehold介导的链置换反应，因其灵敏度高，检测时间短及操作简便而得到广泛应用。但需要根据不同突变去更换探针导致研发周期长，成本上升。5.由于基因突变具有普遍性和随机性，而大多数荧光探针法是针对特定突变进行设计的，因此对于同一个基因不同位点的突变和同一位点不同类型的突变，通常需要不同的荧光探针进行检测，耗费巨大，这也不利于检出某一区域内的未知突变。6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：7.(1)传统的高分辨熔解曲线法检测方法灵敏度不高；基于下一代测序(ngs)的方法所需的设备非常昂贵、耗时长，增加了检测的成本。8.(2)传统toehold反应存在区分模块和信号模块无法分割，探针优化过程繁琐，需要根据不同突变去更换探针导致研发周期长，成本上升等问题。9.(3)大多数荧光探针法通常需要根据不同的基因突变去设计不同的荧光探针进行检测，耗费巨大，这也不利于检出某一区域内的未知突变。技术实现要素：10.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种荧光探针检测方法及应用，尤其涉及一种“turn-on型“荧光探针检测方法及其在未知基因突变检测中的应用。11.本发明是这样实现的，一种荧光探针检测方法包括：12.构建调控dna链置换反应的新型元件—dna楔形元件；基于楔形元件的调控特性，对基因突变检测方法进行改进，设计一种“信号抑制型”的基因突变检测新方法；wtdna触发的荧光信号被完全互补配对的楔形元件猝灭，与楔形元件碱基错配的mtdna始终触发荧光信号，即与楔形元件有一个碱基错配的mtdna所触发的荧光信号则不受影响。13.进一步，所述楔形元件的构建方法包括：14.采用包含辅助序列的链置换序列通用结构设计，在链置换过程中添加一个新的独立调节元件；所述辅助序列用于为楔形元件提供一个空间平台。所述楔形元件由结构域i和结构域t组成，所述结构域i被设计成与入侵链的辅助序列结构域或辅助域互补，所述结构域t被设计成与模板链的辅助域互补；楔形元件与入侵链和模板链杂交后，形成楔形三联体。15.进一步，所述荧光探针检测方法还包括：16.通过改变i-t和t-i之间两个结构域的位置连接顺序实现双向调节。17.当结构域i和结构域t分别与入侵链和底物链结合后，形成一个楔形的夹角，当夹角有利于入侵链入侵底物链时，反应速率加快；当夹角不利于入侵链入侵底物链时，反应速率减慢。18.进一步，所述荧光探针检测方法包括以下步骤：19.步骤一，序列设计：设计并合成野生型pten基因wtdna、突变型pten基因mtdna、模板链、目标链以及nw(反向楔形元件)；20.步骤二，向ep管中加入10×thermopol缓冲液，再加入目标链、模板链和去离子水，在金属浴中按照已设定的程序加热和退火混合物；21.步骤三，将退火后的混合物加入酶标条中，加入nw、入侵链和去离子水，用离心机将溶液全部离心到底部，置于酶标仪中检测荧光强度。22.进一步，所述步骤一中的wtdna的核苷酸序列为seq id no：1，所述mtdna的核苷酸序列为seq id no：2，所述模板链的核苷酸序列为seq id no：3，所述目标链的核苷酸序列为seq id no：4，所述nw的核苷酸序列为seq id no：5。23.进一步，所述步骤二中的10×thermopol缓冲液的加入量为4.8μl，所述目标链的终浓度为250nm，所述模板链的终浓度为250nm，用去离子水使总体积达到46μl；所述已设定的程序为：85℃1min，55℃1min，37℃5min。24.进一步，所述步骤三中的退火后的混合物为46μl，所述nw的终浓度为500nm，所述入侵链的终浓度为250nm，用去离子水将总体积补足到50μl，最终的摩尔比为：模板链：入侵链：目标链：楔形元件＝1.05：1：1：1。25.所述离心条件为：3500rpm，室温，1.5min，置于酶标仪中检测37℃温度下的荧光强度；所述荧光记录的激发/发射波长为485nm/525nm，荧光强度每45s测量一次，总检测时间为3600s或5400s。26.本发明的另一目的在于提供一种荧光探针。27.本发明的另一目的在于提供一种荧光探针检测试剂盒，所述荧光探针检测试剂盒包括应用所述的荧光探针检测方法中核苷酸序列为seq id no：1～核苷酸序列为seq id no：5。28.本发明的另一目的在于提供一种所述的荧光探针检测方法在未知基因突变检测中的应用。29.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：30.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：31.本发明的“信号抑制型”探针从原理上对传统方法进行优化改进，使检测体系中荧光的产生对突变位点的位置和类型无选择性，因而可对未知突变进行检测，并且本方法对突变位点的检测信号是“turn-on(信号抑制型)”型信号，从源头上消除了背景荧光的干扰。32.基于楔形元件的调控特性，本发明对基因突变检测方法进行改进，设计了一种“信号抑制型”的基因突变检测新方法，在此方法中，wtdna触发的荧光信号被完全互补配对的楔形元件猝灭，而与楔形元件有一个碱基错配的mtdna所触发的荧光信号则不受影响。本发明提供的极其简单的dna元件对基因突变的区分检测限可达到1％～5％，检测时间低至30分钟，且优化检测效果的过程无需更换荧光探针，降低了实验成本。本发明的“信号抑制型”探针从原理上对传统方法进行优化改进，使检测体系中荧光的产生对突变位点的位置和类型无选择性，因而可对未知突变进行检测。33.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：34.本发明提供了一种优化成本低、可对未知突变进行检测的荧光探针系统，可以降低检测成本，实现较高通量的突变检测，减轻社会与患者的经济负担。35.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：36.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：37.随着人们生活方式的改变以及环境污染的加剧，癌症的发病率正在逐年增加。近年来，癌症的精准医疗正成为全球热点研究方向，并有望成为治疗癌症的有效方案。上文背景技术已经介绍基因点突变检测对dna分子水平基因诊断与癌症的早期诊断具有重要意义。全球各大医院肿瘤科均开展了基因突变检测项目。本发明原理巧妙，方法简单，完全可以转化为基因突变检测试剂盒应用于临床上，商业价值极大。38.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：39.荧光探针法是目前市场上应用较广泛的基因突变检测方法，但普通荧光检测系统大多基于已知突变设计荧光探针，即使一些探针系统可以检测未知突变，但都是“turn off”型探针，即：检测wtdna是发出荧光，检测mtdna时荧光降低，因此对低丰度突变基因的检测就会有较高的荧光背景干扰。本发明从原理上对传统方法进行变革性地优化改进，不仅使检测体系中荧光的产生对突变位点的位置和类型无选择性，使其可对未知突变进行检测，并且本方法对突变位点的检测信号是“turn-on”型信号，即：检测wtdna是不发出荧光，检测到mtdna时荧光增强，从而从源头上消除了背景荧光的干扰。因此，本发明很好地弥补了未知基因突变检测领域的技术空白，在国内外业内首次发明了“turn-on”型未知突变检测工具。附图说明40.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。41.图1是本发明实施例提供的“turn-on”型荧光探针检测方法流程图；42.图2是本发明实施例提供的楔形元件调控dna链置换反应的示意图；43.图3是本发明实施例提供的“turn-on”型荧光探针的作用原理示意图；44.图4是本发明实施例提供的nw链各结构域的示意图；45.图5是本发明实施例提供的检测荧光结果图；46.图6是本发明实施例提供的本方法对pten基因突变的检测限测定示意图；47.图7是本发明实施例提供的nw10&10(415)对其可结合范围内各位点突变(pten基因)的检测结果示意图；48.图8是本发明实施例提供的nw10&10(415)检测同一位点的不同突变类型(pten基因)示意图；49.图9是本发明实施例提供的nwb10&10(613)检测brca1基因突变示意图。50.图10是本发明实施例提供的对实际临床样本进行检测效果示意图。具体实施方式51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。52.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种“turn-on”型荧光探针检测方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。53.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。54.下面以turn-on”型荧光探针检测方法为例，对本发明的技术方案作进一步描述。55.如图1所示，本发明实施例提供的“turn-on”型荧光探针检测方法包括以下步骤：56.s101，序列设计：设计并合成野生型pten基因wtdna、突变型pten基因mtdna、模板链、目标链以及nw；57.s102，向ep管中加入10×thermopol缓冲液，再加入目标链、模板链和去离子水，在金属浴中按照已设定的程序加热和退火混合物；58.s103，将退火后的混合物加入酶标条中，加入nw、入侵链和去离子水，用离心机将溶液全部离心到底部，置于酶标仪中检测荧光强度。59.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。60.针对传统toehold反应的区分模块和信号模块无法分割，探针优化过程繁琐，需要更换不同的荧光探针等问题，本发明提供了一种调控dna链置换反应的新型元件‑‑dna楔形元件，并且详细的研究了它的动力学特征。楔形元件可以很好地提升对链置换反应的调控能力，本发明基于其“双向”动力学特性，开发了新的基因突变检测体系‑‑荧光抑制型探针系统，仅需要改变楔形元件即可轻松优化探针系统。其中，wtdna(野生型dna)触发的荧光信号被完全互补配对的楔形元件抑制，而与楔形元件有一个碱基错配的mtdna(突变型dna)则不受影响，可继续触发荧光。因此，该方法为基因突变的检测提供了新的策略。61.楔形元件的基本设计思想是在链置换过程中添加一个新的独立调节元件。为了给调控元件留出空间，本发明采用了包含辅助序列的链置换序列通用结构设计。但完全不同于remote toehold，本发明的体系中，辅助序列始终保持不变也没有任何调节功能，只是为楔形元件提供了一个空间平台。如图2所示，楔形元件由两个结构域组成(命名为结构域i和结构域t)。结构域i被设计成与入侵链的辅助序列结构域(辅助域)互补，而结构域t被设计成与模板链的辅助域互补。楔形元件与入侵链和模板链杂交后，形成楔形三联体。当i和t分别与入侵链和底物链结合后，将会形成一个楔形的夹角，当夹角有利于入侵链入侵底物链时，反应速率加快(此楔形元件为正向楔形元件pw)；当夹角不利于入侵链入侵底物链时，反应速率减慢(此楔形元件为反向楔形元件nw)。为了实现这种双向调节，本发明只需改变i-t和t-i之间两个结构域的位置连接顺序。总的来说，基于这样的结构设计和反应机制，本发明期望构建的楔形元件可以精细地双向调节toehold介导的链置换反应速率。62.基于以上楔形元件的调控特性，本发明对基因突变检测方法进行改进，设计了一种“信号抑制型”的基因突变检测新方法，在此方法中，wtdna触发的荧光信号被完全互补配对的楔形元件猝灭，而与楔形元件有一个碱基错配的mtdna所触发的荧光信号则不受影响。这种极其简单的dna元件对基因突变的区分检测限可达到1％～5％，检测时间低至30分钟，且优化检测效果的过程无需更换荧光探针，降低了实验成本。本发明的“信号抑制型”探针从原理上对传统方法进行优化改进，使检测体系中荧光的产生对突变位点的位置和类型无选择性，因而可对未知突变进行检测。63.实施例：基于楔形元件的荧光抑制型探针系统对pten基因突变体检测64.1.实验材料65.dna短链、thermopol reaction buffer、酶标条、96孔板封膜。66.2.序列设计67.如表1所示，设计并合成突变型pten基因(mtdna)、野生型pten基因(wtdna)、模板链、目标链、nw。68.表1序列设计[0069][0070]3.构建方法[0071](1)向ep管中先加入4.8μl 10×thermopol缓冲液，再加入目标链(终浓度250nm)和模板链(终浓度250nm)，用去离子水使总体积达到46μl。然后在金属浴中按照已设定的程序(85℃1min，55℃1min，37℃5min)加热和退火混合物。此步骤目的：目标链和模板链首先结合，形成图3a所示的结构。[0072](2)将46μl退火后的混合物加入酶标条中，然后加入nw(终浓度为500nm)和入侵链(终浓度为250nm)，用去离子水将总体积补足到50μl(最终的摩尔比为模板链：入侵链：目标链：楔形元件＝1.05：1：1：1)。用离心机将溶液全部离心到底部(3500rpm，室温，1.5min)，置于酶标仪中检测37℃温度下的荧光强度。荧光记录的激发/发射波长为485nm/525nm，荧光强度每45s测量一次。总检测时间为3600s或5400s。[0073]此步骤目的：入侵链分为两种，一种突变型pten基因(mtdna)，一种野生型pten基因(wtdna)。[0074]存在wtdna时，由于nw链分别与wtdna和模板链中间区域互补配对，形成如图3c所示的生物结构，该结构导致链置换反应无法进行，进而不会产生荧光信号。[0075]存在mtdna时，由于nw链无法与mtdna中间区域互补配对，形成如图3d的生物结构，该结构并不影响链置换反应的进行，进而产生荧光信号。[0076]以wtdna结构为例，各结构域如图4所示。[0077](3)结果如图5所示，突变型mtdna有明显的荧光增强信号；野生型wtdna几乎没有荧光增强信号。[0078](4)基于楔形元件的基因突变检测方法检测限[0079]如图6所示，检测限可达1％。[0080](5)基于楔形元件的基因突变检测方法对未知基因突变的检测[0081]本发明针对特定的nw链nw10&10(415)，将入侵链与其结合范围内的10个碱基都进行突变(实际上除原来的pten基因原始突变外，还剩下9个位点)，本发明将这10个位点命名为mt p1～p10(原始突变位点为mt p5)[0082]结果如图7所示，突变型mtdna有明显的荧光增强信号；野生型wtdna几乎没有荧光增强信号。[0083]类似地，不同的突变类型也可以被检测出来，即g》a的突变，换为g》c或g》t也可以区分出来。实验结果如图8所示，虽然对于g》c和g》t突变，体系荧光信号有所减弱，但与wtdna相比，仍有非常显著的差异。并且当突变体含量为50％时，也均可被检出，这表明本方法对同一位点不同类型突变的基因分型检测是可行的。[0084](6)基于楔形元件的基因突变检测方法对未知基因突变的检测[0085]针对pten基因的合成链，本发明证明了基于楔形元件的基因突变检测方法的有效性。如果同样可以有效区分其它基因的wtdna和mtdna，将说明本方法具有通用性(见图9)。[0086]本发明选取brca1基因的44nt合成链(seq id no：10atctgtagagagtagcagtatttcattggtacctggtactgatt)及其突变体(brca1 l771l(2430t》c))(seq id no：11[0087]atctgtagagagtagcagtatttcactggtacctggtactgatt)，其中18nt为迁移域(atctgtagagagtagcag)，11nt为辅助域(辅助序列spacer区，tatttcattgg或tatttcactgg表示)，15nt为入侵域(toehold区，tacctggtactgatt)。根据辅助域序列，设计了20条nw链用于wtdna与mtdna的区分，其中nwb10&10(613)(序列为aggaagcataccaatgaaat)的区分效果最好。[0088]二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。[0089]实施例：基于楔形元件的荧光抑制型探针系统对患者体内基因突变体检测[0090]1.实验材料[0091]子宫内膜癌患者的组织基因组片段、dna短链、thermopol reaction buffer、qpcr仪、pcr管。[0092]2.序列设计[0093]如表2所示，设计并合成pcr正向引物(fp)、pcr反向引物(rp)、模板链、目标链、nw。[0094]表2序列设计[0095][0096]3.构建方法[0097](1)向pcr管中依次加入25μl 2×taq pcr mix混合液，2.5μl 20×dna荧光染液，正向引物(终浓度为200nm)，反向引物(终浓度为200nm)，患者基因组dna片段(终浓度为0.02nm),用去离子水使总体积达到50μl。然后在qpcr仪中按照已设定的程序(95℃1min；95℃15s，55℃30s，72℃15s 27个循环；72℃5min)加热和退火混合物。此步骤目的：对从患者体内提取的基因组dna片段进行pcr扩增。[0098](2)利用天根公司dna纯化试剂盒对步骤(1)所得pcr产物进行纯化，得到纯化产物。此步骤目的：去除步骤(1)产物体系中的引物、taq酶等杂质。[0099](3)向pcr管中加入5μl 10×lambda exonuclease reaction buffer，1μl lambda exonuclease，44μl步骤(2)中的纯化产物。然后在金属浴中按照已设定的程序(37℃30min，85℃30min)加热和退火混合物，得到酶切产物。此步骤目的：将pcr扩增的双链dna通过lambda外切酶酶切成我们所需的单链dna。[0100](4)向pcr管中先加入4.8μl 10×thermopol缓冲液，再加入目标链(终浓度250nm)和模板链(终浓度250nm)，用去离子水使总体积达到46μl。然后在金属浴中按照已设定的程序(85℃1min，55℃1min，37℃5min)加热和退火混合物。此步骤目的：目标链和模板链首先结合，形成图3a所示的结构。[0101](5)然后继续向步骤(4)中pcr管中加入nw(终浓度为500nm)和酶切产物(终浓度为250nm)，用去离子水将总体积补足到50μl(最终的摩尔比为模板链：入侵链：目标链：楔形元件＝1.05：1：1：1)。[0102]此步骤目的：酶切产物分为两种，一种突变型pten基因(mtdna)，一种野生型pten基因(wtdna)。[0103]存在wtdna时，由于nw链分别与wtdna和模板链中间区域互补配对，形成如图3c所示的生物结构，该结构导致链置换反应无法进行，进而不会产生荧光信号。[0104]存在mtdna时，由于nw链无法与mtdna中间区域互补配对，形成如图3d的生物结构，该结构并不影响链置换反应的进行，进而产生荧光信号。[0105]三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。[0106]本发明对来源于患者样本的pten基因突变也进行检测限测定，其目的在于。如图10所示，本发明方法可以对实际临床样本进行检测，并且检测限达到5％。因此，利用这种非常简单的楔形元件设计即可在短时间内达到1％～5％检测限的区分效果。结果表明本方法相较于其它繁琐的检测方法，具有简化实验过程和降低优化成本的优势。[0107]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。









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