一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及环肽化合物的制备工艺技术领域：：，尤其涉及一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用。背景技术：：：2.唇形科（lamiaceae）是被子植物的第6大科，广泛分布于世界各个地方[1]。本科有10个亚科，220余属，3500余种。我国有99属，800余种。唇形科中的植物大多数都属于药用植物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、清热解毒等作用。[0003]地蚕（stachysgeobombycisc.y.wu）为唇形科（lamiaceae）水苏属（stachyslinn.）植物，俗称白虫草，土冬虫草，肺痨草，地溜儿，草石蚕等，主要生长于我国湖南、福建、江西、浙江，广西和广东等地。地蚕为多年生草本植物，高40-50cm，花期在4-5月，一般在秋季进行采挖。本品气微，味甜，有粘性，在水中浸泡时，容易膨胀。具有清热解毒、益肾润肺和滋阴补血的功效，可用于治疗肺结核咳嗽、吐血、贫血、肺虚气喘、小儿疳积等疾病。现代研究发现该属植物的提取物具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等作用。[0004]近年来，有文献表明从地蚕中分离得到三萜类、黄酮、甾体、苯乙醇苷类、有机酸和挥发油等单体化合物。到目前为止，国内外对地蚕的研究相对较少，由于地蚕具有良好的药用价值，此外，有文献表明生物碱、环烯醚萜类化合物具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。因此，为了探明地蚕药用活性的物质基础和进一步开发其药用价值，我们对地蚕进行了初步的化学成分分离鉴定和抑制α-葡萄糖苷酶方面的应用研究。结果从地蚕中分离得到的地蚕环肽c对α-葡萄糖苷酶具有潜在的抑制作用。技术实现要素：[0005]本发明的目的在于：本发明利用溶剂萃取和色谱法对地蚕中的环肽成分进行分离纯化，并通过各种波谱技术和化合物的理化性质对化合物的结构进行鉴定，另外，还对分离得到的单体化合物进行抑制α-葡萄糖苷酶活性筛选，从地蚕中分离得到地蚕环肽c[cyclogeobomptidec（3）]抑制α-葡萄糖苷酶活性实验结果显示，地蚕环肽c对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用，其ic50值为19.16，本发明提供了一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用。[0006]本发明是通过以下技术方案实现的：一种环肽化合物，所述环肽化合物的分子式为c45h60n8o10，具有式i所示的结构：式i。[0007]本发明还提供了一种分离鉴定所述的环肽化合物的方法，包括以下步骤：（1）将干燥的地蚕根茎粉碎，并热水浸提，得到热水浸提液；使用超滤系统对热水浸提液超滤，得到分子量大于3万的截留液和分子量小于3万的透过液；（2）取透过液通过d101大孔树脂，再分别使用50%乙醇和95%乙醇对吸附于大孔树脂的透过液进行洗脱，得到50%乙醇洗脱液、95%乙醇洗脱液；分别将50%乙醇洗脱液、95%乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到得50%乙醇洗脱液浸膏、95%乙醇洗脱液浸膏；（3）用适量甲醇溶解95%乙醇洗脱液浸膏，再使用凝胶柱色谱进行分离，洗脱溶剂为100%甲醇，得到100%甲醇洗脱液；经tlc检测合并100%甲醇洗脱液中的相同组分，得到9个组分fr.a′~fr.i′；（4）取组分fr.f′经反向c18柱分离，洗脱溶剂为50%甲醇，得到50%甲醇洗脱液；经tlc检测合并50%甲醇洗脱液中的相同组分，共得到4个组分fr.f′‑1~fr.f′‑4；（5）取组分fr.f′‑2经高效液相色谱仪进行反相分析柱色谱分离纯化，洗脱溶剂为45%甲醇，得到地蚕环肽c，通过核磁波谱、质谱和改良marfey法对地蚕环肽c的构型进行鉴定，鉴定结果表明所得地蚕环肽c为具有式i所示结构的环肽化合物。[0008]进一步地，所述步骤（1）中将干燥的地蚕根茎粉碎至300～500目。[0009]进一步地，所述步骤（1）中每公斤地蚕根茎所用热水5～15公斤，热水浸提工艺为：浸提次数为2～4次、浸提温度为60～90℃、每次浸提时间为1.8～2.2h。[0010]进一步地，所述步骤（1）中每公斤地蚕根茎所用热水8～15公斤，热水浸提工艺为：浸提次数为3～4次、浸提温度为70～90℃、每次浸提时间为2.0～2.2h。[0011]进一步地，所述步骤（3）中用适量甲醇溶解95%乙醇洗脱液浸膏，再使用凝胶柱色谱进行分离，洗脱溶剂为100%甲醇，每400ml接一瓶洗脱液，得到100%甲醇洗脱液；经tlc检测合并100%甲醇洗脱液中的相同组分，得到9个组分fr.a′~fr.i′。[0012]进一步地，所述步骤（4）中取组分fr.f′经反向c18柱分离，洗脱溶剂为50%甲醇，每200ml接一瓶洗脱液，得到50%甲醇洗脱液；经tlc检测合并50%甲醇洗脱液中的相同组分，共得到4个组分fr.f′‑1~fr.f′‑4。[0013]进一步地，所述步骤（5）中通过核磁波谱、质谱和改良marfey法对地蚕环肽c的构型进行鉴定，鉴定步骤为：1）取地蚕环肽c于反应容器中，加入6m盐酸，密封，于105～115℃条件下油浴加热22～26h，得到水解产物；2）将水解产物重新溶解于水中，得到水解物溶液；在每μl水解物溶液中加入1%fdaa的丙酮溶液1.8～2.2μl、1mnahco3溶液0.18～0.22μl，于45℃水浴加热0.8～1.2h，取出，静置至室温，再加入2mhcl溶液0.8～1.2μl终止反应，得到水解衍生化产物；3）使用agilent1260型hplc仪器对水解衍生化产物和氨基酸标准品进行对比分析，验证地蚕环肽c的组成。[0014]进一步地，所述步骤（5）中通过核磁波谱、质谱和改良marfey法对地蚕环肽c的构型进行鉴定，所选用的色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，检测器为紫外检测器。[0015]本发明还提供了一种环肽化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。[0016]本发明的有益效果是：本发明利用溶剂萃取和各种色谱法对地蚕中的环肽成分进行分离纯化，首次分离出了一种环肽化合物，纯度高达99.8%以上，得到的一种环肽化合物具备优良的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制剂中具有一定的应用价值；利用本技术分离鉴定方法制备得到的环肽化合物进行抑制α-葡萄糖苷酶活性实验，实验结果显示，地蚕环肽c对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用，其ic50值为19.16。附图说明[0017]图1为本发明制备得到的地蚕环肽c的hmbc相关图；图2为本发明制备得到的地蚕环肽c的x-单晶衍射图；图3为本发明制备得到的地蚕环肽c的氨基酸和l-氨基酸标准品对比图；图4为本发明制备得到的地蚕环肽c的酶量-反应速率曲线图。[0018]图5为本发明制备得到的地蚕环肽c的酶抑制动力学曲线图。具体实施方式[0019]本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。[0020]本发明一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用，植物来源与鉴定：地蚕的干燥根于2019年购自广西壮族自治区贵港市，并由桂林医学院生药学教研室黄德青副教授鉴定为地蚕（stachysgeobombycisc.y.wu），标本（编号：201909001）存放于桂林医学院药学院。[0021]本发明一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用，实验试剂以及实验仪器如下：薄层色谱硅胶板gf254及柱色谱硅胶（100-200目）均为青岛海洋化工厂生产；吸附型大孔树脂d101为天津海光化工有限公司生产；葡聚糖凝胶sephadexlh-20为瑞典pharmaciabiotech公司生产；凝胶toyopearlhw-40f为日本tosoh公司生产；反相硅胶rp-18为美国merk公司生产；氨基酸标准品为河南标准物质研发中心生产；nα‑ꢀ(2,4-二硝基-5-氟苯基)ꢀ‑ꢀlꢀ‑丙氨酰胺（fdaa）为上海皓鸿生物医药科技有限公司生产；d-葡萄糖标准品、d-半乳糖标准品和1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（pmp）均为上海源叶生物有限公司生产；甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇等实验用试剂纯度为分析纯，均由西陇化工股份有限公司生产；色谱纯试剂：甲醇和乙腈均为美国fisher公司生产核磁共振仪brukeram-400mhz,brukerdrx-500mhz,bruker和ananceiii-600mhz均为瑞士bruker公司生产；分析型高效液相色谱仪lc1260为美国agilent公司生产；制备型高效液相色谱仪waters2535为美国waters公司生产；质谱仪lcms-8030为日本岛津公司生产；高分辨质谱仪：exactive为美国thermo-scientific公司生产；红外光谱仪：nicoletis10为美国thermo-scientific公司生产;电子天平：bs400s为北京赛多利斯有限公司生产；旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂生产；制备色谱柱prepc18obd反相色谱柱（19×250mm,5μm）：美国waters公司生产；半制备色谱柱zopbaxsb-c18反相色谱柱（9.4×250mm,5μm）：美国agilent公司生产；分析色谱柱：poroshell120ec-c18反相色谱柱（46×150mm,4μm）：美国agilent公司生产；agilentzorbaxsb-c18反相色谱柱(5μm,4.6×250mm)：美国agilent公司生产；显色剂为10%硫酸乙醇溶液。[0022]本发明一种环肽化合物及其分离鉴定方法和应用，50%乙醇和95%乙醇的%是指体积比是乙醇和水的混合液；50%甲醇由甲醇和水按照体积比1:1制得；1%fdaa的丙酮溶液中%是指质量百分数；其他溶剂中的%也是指质量百分数；也即乙醇和甲醇中的%是指体积比，其他溶剂中的%也是指质量百分数。[0023]实施例1：（1）地蚕提取分离纯化方法。[0024]取干燥的地蚕根茎25kg，经粉碎后用纯净水加热提取3次，每次2小时，使用超滤系统将提取液进行超滤，得到分子量大于3万的截留液和分子量小于3万的透过液。将透过液通过d101大孔树脂后，分别使用50%乙醇和95%乙醇对吸附于大孔树脂的样品进行洗脱，将洗脱液分别进行减压浓缩得到浸膏672.0g和22.0g。[0025]将95%乙醇洗脱浓缩得到的浸膏22.0g用适量甲醇溶解后使用凝胶柱色谱进行分离，用100%甲醇作为洗脱溶剂，每400ml接一瓶洗脱液，经tlc检测合并相同组分，得到9个组分，即fr.a′~fr.i′，其中fr.a′~fr.i′具体是指先后从凝胶柱中洗脱出来的组分，fr.a′为最先洗脱出来的组分，fr.i′为最后洗脱出来的组分，组分fr.f′为第6个洗脱出的组分；取组分fr.f′经反向c18柱分离，50%甲醇作为洗脱溶剂，每200ml接一瓶洗脱液，经tlc检测合并相同组分，共得到4个组分，即fr.f′‑1~fr.f′‑4，其中fr.f′‑1~fr.f′‑4具体是指先后从凝胶柱中洗脱出来的组分，fr.f′‑1为最先洗脱出来的组分，fr.f′‑4最后洗脱出来的组分，组分fr.f′‑2为第二个洗脱出来的组分；取组分fr.f′‑2经高效液相色谱仪进行反相分析柱色谱分离纯化（洗脱条件为45%甲醇），得到地蚕环肽c（23.0mg，1ml/min，tr=36min）。[0026]1.2.2环肽类化合物的水解衍生化及测定（2）通过改良marfey法对化合物的构型进行鉴定。[0027]分别取地蚕环肽c的0.5mg于试管中，分别加入6m盐酸（1ml），密封，然后于110℃油浴加热24h。将水解产物分别重新溶解在100μl水中，备用。取新鲜的环肽类化合物水解产物50μl，加入1%fdaa的丙酮溶液100μl，加入1mnahco3溶液20μl，45℃水浴加热1h，等温度降到室温后，加入2mhcl溶液10μl终止反应。所用的氨基酸标准品除了gly以外，其他的氨基酸均为l-氨基酸，氨基酸的衍生化反应参考环肽类化合物水解产物的衍生化方法。[0028]使用agilent1260型hplc仪器对水解衍生化后的产物和氨基酸标准品进行对比分析，所选用的色谱柱为agilentzorbaxsb-c18(5μm,4.6ꢀ×ꢀ250mm)，检测器为紫外检测器（波长340nm），进样量1μl，流速为1ml/min。其中地蚕环肽c都使用乙腈和1‰的甲酸水溶液进行梯度洗脱，具体洗脱条件为（乙腈，15-55%，32min）。[0029]（3）新化合物的结构解析。[0030]地蚕环肽c为白色固体，[a]24.2dꢀ‑173.3(c0.5,meoh);uv(meoh)λmax(logε):203(5.08),278(3.74)nm;ir（kbr）vmax3363,2957,1642,1516,1446,1242,1172,1156cm-1。高分辨质谱谱hresims显示准分子离子峰m/z895.4315[m+na]+，结合13cnmr谱图确定其分子式为c45h60n8o10，有20个不饱和度，紫外光谱在203nm和278nm波长处有两个最大吸收峰，红化外光谱中可以看出该化合物中含有羟基（3363cm-1）、仲胺（1642cm-1）和苯环（1516,1446cm-1）的吸收峰。地蚕环肽c具有显著的环肽类化合物显色特征和核磁波谱特征[13,14]。从13cnmr（表1-2）谱图中可以看出3个甲基，13个亚甲基，其中包括1个氨基酸α亚甲基，18个次甲基，其中包括7个氨基酸α次甲基，9个芳香次甲基，11个季碳，其中包括8个氨基酸季碳，3个芳香季碳，由这些信息可以看出，地蚕环肽c是由8个氨基酸组成的环肽类化合物。从13cnmr谱图中可以看出5个芳香次甲基δc115.8,126.5,128.8,131.0,131.7以及3个芳香季碳δc130.1,140.9,157.0说明该化合物可能含有1个苯丙氨酸残基和1个酪氨酸残基；3个甲基δc21.6,22.9,23.6和1个亚甲基δc39.1以及2个次甲基δc26.0,66.5说明该化合物可能含有1个苏氨酸残基和1个亮氨酸残基；10个亚甲基δc22.2,25.5,25.9,27.2,28.4,31.5,43.3,46.9,47.4,47.9以及3个次甲基δc59.3,59.6,61.5说明该化合物可能含有3个脯氨酸残基和1个甘氨酸残基；通地蚕环肽c的hmqc、hmbc、1h-1hcosy以及roesy再次验证后确定该化合物的组成为：1个亮氨酸，1个甘氨酸，1个苏氨酸，1个酪氨酸，1个苯丙氨酸和3个脯氨酸，各个氨基酸残基的核磁数据归属见表1-2。由hmbc谱图可以看出tyr1-hαδh4.68(1h,m)和thr2-c=oδc172.5相关，thr2-hαδh4.89(1h,m)和pro3-c=oδc171.3相关，pro3-hαδh4.61(1h,m)和pro4-c=oδc171.2相关，pro4-hαδh3.88(1h,m)和pro5-c=oδc171.7相关，pro5-hαδh4.63(1h,m)和leu6-c=oδc170.8相关，leu6-hαδh5.11(1h,m)和gly7-c=oδc170.1相关，gly7-hαδh5.08(1h,m)和phe8-c=oδc171.1相关，phe8-hαδh4.01(1h,brs)和tyr1-c=oδc173.6相关；结合以上信息可以确定地蚕环肽c的氨基酸排序为cyclo(-tyr1-thr2-pro3-pro4-pro5-leu6-gly7-phe8-)。[0031]从水解衍生化液相分析图也即氨基酸和l-氨基酸标准品对比图中可以看出地蚕环肽c水解的氨基酸中除了gly以外的其他各个氨基酸与l-氨基酸标准品的出峰时间重叠，因此构成地蚕环肽c的氨基酸除了gly以外，其他氨基酸均为l-氨基酸。x-单晶衍射也进一步佐证了其结。综上所述，地蚕环肽c的结构确定为cyclo(-l-tyr1-l-thr2-l-pro3-l-pro4-l-pro5-l-leu6-gly7-l-phe8-)，命名为cyclogeobomptidec，是一个新的环八肽。[0032]下表1给出地蚕环肽c的核磁共振波谱数据表表1地蚕环肽c的核磁共振波谱数据（pyr,600/150mhz）table1.1hnmrand13cnmrspectroscopicdataforcompound3（4）α-葡萄糖苷酶抑制活性4.1）实验材料与试剂biotekepoch全波长酶标仪为美国伯腾仪器有限公司生产；α-葡萄糖苷酶（批号：slch1437）为美国sigma公司生产；4-硝基苯基α-d-吡喃葡萄糖苷(4-pnpg)为梯希爱(上海)化成工业发展有限公司生产；阿卡波糖（批号：8061031）为北京索莱宝科技有限公司生产；磷酸缓冲溶液粉剂(1×pbs，无钙镁)为北京雷根生物技术有限公司生产；dmso（分析纯）为西陇科学股份有限公司生产4.2）实验方法4.21）α-葡萄糖苷酶活性的测定进行部分化合物和阿卡波糖（阳性对照）的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试。将化合物制成1%dmso的原液，然后用缓冲液（磷酸盐缓冲液，ph=6.8）将化合物和阿卡波糖稀释成不同浓度的溶液用于实验。在96孔板中加入50ꢀµl不同浓度的化合物（1、15、75、150、300和700μm），阿卡波糖为阳性对照，其浓度设定和化合物保持一样，加入50μl缓冲液，再加入0.2u/ml的α-葡萄糖苷酶100ꢀµl。将混合物在37℃下孵育15分钟，然后加入5mm的4-pnpg溶液50ꢀµl，并在37℃下再相互作用。在405nm处检测吸光度值。[0033]α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[acꢀ‑ꢀ(asꢀ‑ꢀab)/ac]×100%ac：代表不含样品对照组的吸光度，ab：代表不含4-pnpg对照组的吸光度，as：代表待测样品的吸光度。[0034]4.22）化合物的酶抑制动力学测定当酶的浓度为0.24、0.36、0.48、0.60u/ml时，针对酶对不同浓度（0和700μm）的化合物的抑制活性，研究了抑制作用的可逆性；使用四种不同浓度的4-pnpg(0.5、1.0、1.7、2.0mmol/l)和三种不同浓度的化合物测试反应速率，获得了化合物的双倒数曲线图，并评估了其抑制作用类型；4.23）统计分析所有实验都重复了3次，使用spss18.0软件进行统计学分析。[0035]4.24）实验结果4.25）α-葡萄糖苷酶活性测定结果下表2为化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性结果统计表，从表2中可以看出地蚕环肽c对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制活性，ic50值为：19.16μm，强于阿卡波糖。[0036]表2化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性（n=3）table2α-glucosidaseinhibitoryactivitiesofthecompoundscompoundsic50μm319.16阿卡波糖178.73注：阿卡波糖为阳性对照药4.26）化合物的酶动力学测定结果在化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性实验中发现地蚕环肽c有明显的抑制作用且抑制活性均高于临床糖尿病常用药物阿卡波糖；因此我们对新地蚕环肽c进行了更为深入的研究，将地蚕环肽c的酶动力学进行了研究与探讨。[0037]可逆或不可逆性质的研究：在酶浓度为为0.24、0.36、0.48、0.60u/ml时，测定化合物浓度为0和700μm时的酶抑制活性，考察其抑制作用的可逆性；结果如图4所示，从图4中可以看出，地蚕环肽c对酶的抑制类型属于可逆性抑制。[0038]竞争或非竞争抑制类型的研究：取0.5、1.0、1.7、2.0mm4个浓度的4-pnpg与9.5、19.0和38.0μm3个浓度的地蚕环肽c，分别测定反应速率，由lineweaverburk作图法分别绘制化合物的酶抑制动力学曲线，考察地蚕环肽c的抑制作用类型。结果如图5所示，从图5中可以看出，地蚕环肽c对酶的抑制类型属于竞争性抑制类型。[0039]综上，本发明利用溶剂萃取和各种色谱法对地蚕中的环肽成分进行分离纯化，首次分离出了一种环肽化合物，得到的环肽化合物具备优良的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制剂中具有一定的应用价值；利用本技术分离鉴定方法制备得到的环肽化合物进行抑制α-葡萄糖苷酶活性实验，实验结果显示，地蚕环肽c对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用，其ic50值为19.16。[0040]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12









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