一株高效降解蚯蚓蛋白的跨山曲霉及其应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一株高效降解蚯蚓蛋白的跨山曲霉及其应用，属于微生物技术领域。背景技术：2.蚯蚓又名地龙，无脊椎环节动物，是一种潜在的优质蛋白源。蚯蚓蛋白质含量很高，约占干重的50％～65％，将其水解所获得的混合液中主要由18种氨基酸和少量短肽组成，其中氨基酸占85％，短肽和小分子蛋白质占14％～15％。因此，对蚯蚓多层次的开发利用越来越受到人们的重视和关注。3.耕地质量下降、农产品生产效率低、农产品安全问题已成为制约我国农业可持续发展的限制因素，传统化学肥料的乱用及滥用不断使新的土壤问题出现，长期不合理施肥已导致目前我国农业生态环境承担着比较大的压力。由此可见，多功能、新型肥料代替传统化学肥料已刻不容缓。在这一背景下，新型肥料逐渐问世，如：新型鱼蛋白肥料，聚谷氨酸肥料、矿源黄腐酸钾等。其中，新型蛋白类肥料能够有效地缓解因施肥带来的环保方面的压力，同时，对于提高作物产量和品质有明显的改善作用。目前，对于新型蛋白类肥料的研究主要集中在新型鱼蛋白肥料方面，如cn 101081747 a公开了一种鱼蛋白肥料的制备方法，在酸性条件下用胰蛋白酶降解粉碎的鲜鱼皮，降解完成后过滤、浓缩制成鱼蛋白肥料。4.蚯蚓作为一种优质的蛋白源，未见有蚯蚓蛋白肥料的报道。同时，目前在制备蛋白肥料的过程中，对于蛋白的降解主要集中于酸解、碱解和酶解，对于利用微生物降解动物蛋白的报道少之又少。技术实现要素：5.针对上述问题，本发明提供了一株高效降解蚯蚓蛋白的跨山曲霉及其应用。本发明首先从城镇污水污泥中筛选到一株跨山曲霉(aspergillus transmontanensis)菌株1-1-1，该菌株不仅能够高效降解蚯蚓蛋白，同时以该菌株为功能菌降解蚯蚓制备的蚯蚓降解液对植物促生效果显著，该蚯蚓降解液可进一步开发成水溶性肥料，为我国新型蛋白肥料研发提供了新的途径。6.本发明自山东省济南市城镇污水污泥中筛选到对蚯蚓蛋白具有高效降解作用的跨山曲霉(aspergillus transmontanensis)1-1-1，该菌株已于2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23217。将菌株1-1-1接种在改良pda平板上，28℃恒温进行培养，分别在24h、48h观察菌落特征。结果发现，该菌株在改良pda培养基上菌丝分散生长，前期菌丝白色，后期为微黄绿色毛绒状，孢子产量高。7.本发明还提供了上述跨山曲霉1-1-1及其孢子悬液在降解蚯蚓蛋白，制备蚯蚓蛋白降解液方面的应用。8.本发明还提供了上述跨山曲霉1-1-1及其孢子悬液在制备蚯蚓蛋白功能肥(尤其是水溶性肥)方面的应用。9.上述孢子悬液是在改良pdb培养基中接种跨山曲霉1-1-1种子液发酵58-60h，然后过滤，除去菌丝体后获得，所述改良pdb培养基，配方为：马铃薯200g，蛋白胨8～10g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，水1000ml，ph7.1±0.1。10.本发明还提供了一种采用跨山曲霉1-1-1孢子悬液制备蚯蚓蛋白降解液的方法，其特征是，将新鲜的蚯蚓在粉碎机充分粉碎，按照质量比1:1～2的比例将蚯蚓与水充分混合制成发酵基质；将孢子悬液按1.5～2％的质量比加入发酵基质中，发酵降解3-8d，发酵完成后出罐，过滤，沉降，上清液体即为蚯蚓蛋白降解液，游离氨基酸的总和≥20％。11.本发明还提供了上述的蚯蚓蛋白降解液在促进作物生长方面的应用，所述的促生包括生长指标显著增加和光合指标显著增强，所述生长指标包括株高、叶片数、叶面积和叶柄重；所述光合指标包括净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用率及胞间二氧化碳浓度。12.本发明的技术效果是：13.1、高效降解蚯蚓蛋白14.跨山曲霉1-1-1具有高效降解蚯蚓蛋白特性，将充分粉碎的蚯蚓经该菌株孢子悬液处理48h后，游离氨基酸的总和为21.03％，是未处理蚯蚓中游离氨基酸总和10.78倍；说明该菌株能够高效降解蚯蚓蛋白为游离氨基酸。15.2、促生性16.经该蚯蚓蛋白降解液处理后的小白菜，在株高、叶片数、叶面积和叶柄重四种生长指标显著增加，净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用率和胞间二氧化碳浓度五种光合指标显著增强；说明该蚯蚓蛋白降解液具有优良的促生效果。17.3、该菌株采用通常的改良pdb培养基即可发酵生产，便于推广使用，从而为我国新型蛋白肥料，尤其是水溶性肥料的研发提供了新的途径。附图说明18.图1为跨山曲霉1-1-1水解蚯蚓蛋白产生的水解圈(处理24h)；19.图2为跨山曲霉1-1-1的菌落形态；20.图3为蚯蚓蛋白降解液对小白菜生长影响；21.图4为蚯蚓蛋白降解液对小白菜生长指标影响，其中a-d图分别为株高、叶片数、叶面积和叶柄重四种生长指标注：结果显示为平均值±标准差(n≥3)，**p《0.01；22.图5为蚯蚓蛋白降解液对小白菜光合指标影响，其中a-e图分别为净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用率和胞间二氧化碳浓度五种光合指标；注：结果显示为平均值±标准差(n≥3)。**p《0.01。具体实施方式23.下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。24.实施例1：菌株的分离与鉴定25.1.菌株1-1-1分离26.本发明的跨山曲霉菌株1-1-1是从山东省济南市城镇污水污泥中利用稀释平板法分离获得的。具体方法如下：27.(1)样品采集28.采样地点为：山东省济南市污水处理厂；29.取样方法为：随机取样法，即随机在污泥存放处采集深度10～15cm污泥适量，放入保鲜袋，标明采集地点、时间和采集人立即分离或放入4℃冰箱保存。30.(2)土壤悬液制备31.准确称取1g土样于盛有99ml无菌水的三角瓶中，三角瓶内含玻璃珠，置于28℃摇床中120rpm均匀震荡20～30min，然后置于55～60℃水浴锅中孵育20～30min，即为土壤悬液。32.(3)稀释涂布33.利用10倍稀释法将菌样依次稀释成10-1～10-8稀释度的菌样；分别从10-6、10-7和10-8稀释度的菌样中吸取100μl涂布于分离培养基上，每个梯度涂布三个平行。34.分离培养基即孟加拉红琼脂培养基，配方：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，无水硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，琼脂20g，水1000ml。上述各成分(孟加拉红和氯霉素除外)加入蒸馏水中溶解后，再将孟加拉红溶液加入培养基中，ph7.2±0.2，分装后，121℃灭菌25min。倾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基。35.(4)培养纯化36.在28℃培养48h后挑取培养基上的不同形态的真菌菌落于纯化培养基平板上，定时观察菌落生长情况；不断纯化菌株，确认单菌落后编号保存。37.纯化培养基，即改良pda培养基，配方：马铃薯200g，蛋白胨8～10g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，琼脂15～20g，水1000ml，ph7.1±0.1。分装，121℃灭菌25min。38.通过上述方法，依照不同菌落形态，初步分离到9株菌株，编号为1-1-1～1-1-9。39.2.菌株1-1-1筛选40.(1)筛选方法41.利用水解圈法对9株真菌的降解蚯蚓蛋白活性进行筛选。具体方法为：将分离得到的9株菌接种于含改良pda培养基的平板上，28℃恒温培养36h；将蚯蚓蛋白粉(纯度90％)加入pda培养基中制成筛选培养基；用打孔器打取上述活化菌株的菌饼(5mm)，接种于含有筛选培养基的平板中央，28℃恒温培养1d，观察各平板有无水解圈。42.筛选培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)15g，蚯蚓蛋白粉40g，琼脂15g，水1000ml，ph7.1±0.1，分装，121℃灭菌25min。43.(2)结果分析44.结果显示，在分离得到的9株真菌中，只有菌株1-1-1具有降解蚯蚓蛋白能力(参照表1)；其在筛选培养基上具有明显的水解圈(图1)。45.表1不同菌株水解蚯蚓蛋白情况汇总表[0046][0047]标准：有水解圈为“+”级，无水解圈为“－”级。[0048]3.菌株1-1-1形态学及分子生物学鉴定[0049]将菌株1-1-1接种在改良pda平板上，28℃恒温进行培养，分别在24h、48h观察菌落特征。结果发现，该菌株在改良pda培养基上菌丝分散生长，前期菌丝白色，后期为微黄绿色毛绒状，孢子产量高(图2)。[0050]将菌株1-1-1活化后，挑取菌盘接种到含玻璃纸的改良pda培养基中，28℃恒温培养48h，收集上层菌丝体，用滤纸压干后，液氮研磨成粉末，用ctab法提取真菌基因组dna，将提取基因组送至测序公司进行测序。所述菌株的rdna基因序列测定结果(its1区)如下(seq no.1)：[0051]ctacctgatccgaggtcaacctggaaaaaatggttgttttgcgttcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtgacaaagccccatacgctcgaggatcggacgcggtgccgccgctgcctttggggcccgtcccccccggagaggggacgacgacccaacacacaagccgtgcttgatgggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcacggaattctgcaattcacactagttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccattgttgaaagttttaactgattgcgatacaatcaactcagacttcactagatcagacagagttcgtggtgtctccggcgggcgcgggcccggggctgacgcccccggcggccatgacggcgggcccgccgaagcaactaaggtacagtaaacacgggtgggaggttgggctcgctag[0052]菌株1-1-1经形态学及分子生物学鉴定为跨山曲霉(aspergillus transmontanensis)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年8月20日，保藏编号为cgmcc no.23217。[0053]实施例2：跨山曲霉1-1-1孢子悬液制备[0054](1)将跨山曲霉菌株1-1-1活化后接种于改良pda平板表面，28℃恒温培养20～24h；改良pda培养基，配方：马铃薯200g，蛋白胨8～10g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，琼脂15～20g，水1000ml，ph7.1±0.1。分装，121℃灭菌25min；[0055](2)打孔器在活化菌株边缘处打5mm菌饼，接种于种子液培养基中，28℃、120r/min摇瓶培养58-60h，得到跨山曲霉1-1-1的种子液；[0056]所述种子液培养基即改良pdb培养基，配方为：马铃薯200g，蛋白胨8～10g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，水1000ml，ph7.1±0.1。分装，121℃灭菌25min；[0057](3)将步骤(2)制备的种子液接种到发酵培养基中，接种质量比为1:100，发酵条件同步骤(2)，得到跨山曲霉1-1-1的发酵液；发酵培养基同种子液培养基；[0058](4)将跨山曲霉1-1-1的发酵液在无菌条件下进行过滤，除去菌丝体，即得到跨山曲霉1-1-1的孢子悬液；孢子悬液浓度为1×109cfu·ml-1。[0059]实施例3：跨山曲霉1-1-1高效降解蚯蚓蛋白功能验证[0060](1)方法[0061]将新鲜蚯蚓于组织捣碎机充分捣碎，按照1:1质量比与水充分混合制成蚯蚓浆；取200ml蚯蚓浆于500ml的无菌三角瓶中，按照5％接种量接入跨山曲霉1-1-1的孢子悬液(1×109cfu·ml-1)；对照为按照5％接种量接入发酵培养基。每一处理重复三瓶。[0062]处理完成后，于28℃、120r/min条件下发酵48h，根据ny/t 1975-2010中规定的方法之一氨基酸自动分析仪法检测各处理游离氨基酸含量和游离氨基酸总量，结果如表2-3所示。[0063](2)结果分析[0064]结果分析发现，未经跨山曲霉1-1-1孢子悬液处理的样品，游离氨基酸的总和为1.95％(表2)；经跨山曲霉1-1-1孢子悬液处理的样品，游离氨基酸的总和为21.03％(表3)。进一步分析发现，经跨山曲霉1-1-1孢子悬液处理后，17种游离氨基酸含量都明显增加，以亮氨酸和谷氨酸增加最多。说明，跨山曲霉1-1-1能够高效降解蚯蚓中所含蚯蚓蛋白为17种游离氨基酸，为新型肥料、饲料的研制及高效利用提供了新的途径。[0065]表2对照游离氨基酸含量[0066][0067]表3跨山曲霉1-1-1孢子悬液处理后游离氨基酸含量[0068][0069][0070]实施例4：跨山曲霉1-1-1处理蚯蚓获取蚯蚓蛋白降解液工艺流程[0071]在验证跨山曲霉1-1-1具有高效降解蚯蚓蛋白功能后，我们以新鲜蚯蚓为原料，跨山曲霉1-1-1为功能菌株，对蚯蚓蛋白降解液生产工艺进行了研究与优化，具体生产工艺如下：[0072](1)原料前处理[0073]将新购蚯蚓多次清洗，去除杂质，并充分粉碎；[0074](2)进罐[0075]将(1)中充分粉碎蚯蚓泵入10吨发酵罐，边搅拌边加水，按质量比蚯蚓:水＝1:2，加入80％(8吨)；[0076](3)接种发酵[0077]按照质量比1.5～2％接种量接入跨山曲霉1-1-1孢子悬液(实施例2制备)，维持罐温28～32℃，100r/min充分搅拌发酵，不断通入无菌空气(通气量为0.2:1m.m/v)，发酵5d。[0078](4)蚯蚓蛋白降解液获取[0079]发酵完成后出罐，过滤，沉降，上清液体即为蚯蚓蛋白降解液。[0080]实施例5：蚯蚓蛋白降解液促生功能研究[0081]为了验证蚯蚓蛋白降解液促生性，选取小白菜为实验材料进行相关促生性实验。[0082]实验组：取移栽后长势一致小白菜，缓苗5d后，将实施例4生产的蚯蚓蛋白降解液稀释500倍进行灌根实验，接种量50ml/棵；对照组：每棵灌根50ml水；每周浇水两次。接种25d后，比较对照组与实验组小白菜长势，对相关指标进行检测。[0083]结果发现，蚯蚓蛋白降解液对小白菜生长具有明显的促进作用(图3)。对其相关生长指标检测发现，蚯蚓蛋白降解液能够显著提高小白菜的株高、叶片数、叶面积和叶柄重(图4)，分别提高1.20倍、1.26倍、1.16倍和1.60倍。通过对光合作用相关指标检测发现，接种蚯蚓蛋白降解液后小白菜在净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用率及胞间二氧化碳浓度均显著升高(p《0.05)，如图5所示。以上结果说明，蚯蚓蛋白降解液具有优良促生效果，可以作为原料进行新型蚯蚓蛋白水溶肥的开发，为我国新型肥料的研制开辟了新的途径。









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