一种原位PAHs降解功能菌LJB-135及其菌剂和应用

有机化合物处理,合成应用技术一种原位pahs降解功能菌ljb-135及其菌剂和应用技术领域：：1.本发明涉及微生物技术领域：：，具体涉及一种原位pahs降解功能菌ljb-135及其菌剂和应用。背景技术：：：2.多环芳烃是一类环境污染物，普遍存在于土壤和水体当中，能够对生态环境和人类健康构成重大危害。常见的pahs包括16类物质，其中，菲常被作为pah模式化合物用于pahs生物降解研究。主要原因是由于其独特的化学结构，以及其具有持久性、致癌、致畸、致突变性及生物累积性等特性。3.微生物可以降解环境中的pahs从而达到修复的目的。为了探索pahs在环境中的归宿，一些基于培养的鉴定方法能够识别和分离能够单独降解它们的微生物。至今，已经分离出许多能降解pahs的功能微生物，大多都是来自于paenibacillus、burkholderia、stenotrophomonas、mycobacterium、sphingomonas等属的菌株。这种依赖纯培养方法为确定降解菌种类、功能基因及代谢特征提供了线索。然而，在实际环境中，只有少数污染物功能降解菌可以被分离出来；并且，分离得到的功能微生物能否在自然生境中发挥作用仍然是值得怀疑的。由于自然环境中存在的大多数微生物是不可被培养的，此外，该方法大大低估了原核微生物多样性，不能解释在自然环境中微生物群落内个体之间复杂的相互作用，同时也不能反映污染环境中功能微生物对污染物降解的真实情况。因此，很难利用实验室培养发来揭示原位土著微生物的生态功能。相反，利用不可培养法可以不需要通过实验室培养来评估功能微生物的代谢反应，并直接将它们的特性与自然生境中的功能联系起来。4.稳定同位素探针(sip)技术能够将稳定同位素标记技术和分子生物学手段如高通量测序、trflp等相结合，通过向环境样品中加入稳定性同位素标记的目标化合物(13c或15n)，运用分子生物学手段对被稳定性同位素标记的生物标志物(如dna、rna等)进行分析，可以确定环境样品中的具有降解功能的微生物。该技术可以跳过分离培养这一要求，直接将微生物群落和功能相联系。目前，应用sip技术已经成功鉴定出多种pahs降解功能菌，但是很少有研究人员通过分离培养方式成功地将其分离出来，因此我们无法对该类菌株进行应用。因此，本研究以菲为目标化合物，利用sip探查出pahs降解微生物，根据鉴定出的功能菌的亲缘关系等消息，设置培养基，筛选出具有原位降解pahs功能的微生物，以期为菲及其它多环芳烃的生物处理提供数据支持。技术实现要素：5.本发明的第一个目的是提供一株具有多环芳烃降解功能的marinobactersp.ljb-135。该菌株于2022年4月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmccno：62388。6.本研究报道菌株为marinobactersp.ljb-135，是在2021年在东营石油污染场地中分离并鉴定的新型海杆菌属的菌株，但关于该菌株对pahs降解研究国内外还未见报道。11(99.9％)。ljb-135能够利用菲作为唯一碳源并且很快地降解菲；菲初始质量浓度为100mg·l-1培养3天后，降解率为56.1％；将该菌制备成菌剂后其降解率可达到73.1％。因此，该菌株在石油污染土壤生物修复方面具有较好的应用潜力。22.marinobactersp.ljb-135，其于2022年4月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmccno：62388。附图说明23.图1为菌株ljb-135的系统发育信息。24.图2为菌株ljb-135的生长形态图。25.图3为菌株ljb-135及其菌剂的菲降解特性。具体实施方式26.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域：：常规试剂、方法和设备。27.实施例1：marinobactersp.ljb-135的分离和鉴定28.1、样品采集29.实验所用的污染土壤来自山东东营胜利油田，取样后存放于4℃，待用。30.2、sip微宇宙培养系统构建31.实验中，先将5g污染土壤和20ml无菌水加入150ml血清瓶中，随后用注射器分别向瓶中加入未标记的菲(12c-phe)或13c-菲(13c-phe)(99％,cambridgeisotopelaboratories,inc.,tewksbury,ma,usa)，使菲的最终浓度为10mg/l，再用橡皮塞和铝盖封口。实验的所有处理组包括：不添加菲的对照组，经过过滤灭菌土壤的无菌对照组，以及加入12c-phe或13c-phe土壤样品。所有实验设置三个平行组。培养后第3天对样品进行取样，进行化学分析和dna提取。32.3、dna提取和超速离心、测序33.使用mobio的强力土壤dna提取试剂盒(dnaisolationkit)提取不同处理样品中总基因组dna(tillettandneilan,2000)，每个样品设置三个平行组。待提取dna后，利用nd-1,000uv-vis紫外可见分光光度计(nanodroptechnologies，wilmington，de，usa)测定浓度后，对dna进行超速离心。离心条件为，20℃下超速离心48h，转速为178000g。离心完后，用beckman分层装置将dna溶液分14层。随后对每层dna进行测定和纯化和测序。34.获得测序数据后，运用mothur进行序列拼接以获得目标序列，最后通过qiime进行流程化分析，将相似度大于97％的序列归为同一个otu(operationaltaxonomicunit)，并进行物种分类信息的划分。比较12c-菲和13c-菲样品离心后每层中各otu的相对丰度，结合各分离层浮力密度进行分析。样品培养一段时间后，添加13c-菲土壤样品中某些功能微生物群落对应的dna会富集在重层，导致了这些群落在重层中的相对丰度明显比12c-菲处理组的高。本研究挑选出了丰度最高的100个otus并进行后续分析。最后，通过对比分析12c-菲和13c-菲处理组中不同离层各otu的丰度变化，选出了1个能够代表功能微生物种类的otu(otu_5；》1％)，它所代表的菌株属于海杆菌属marinobacterlipolyticus。根据blast(nationalcenterforbiotechnologyinformation,bethesda,md,usa)和mega确定降解功能微生物的系统发育信息。35.sip鉴定的功能菌为otu_5所代表的微生物，根据序列比对结果显示，该功能菌与marinobacterlipolyticus的16srrna相似性高达99.7％。36.4、菲降解微生物的富集、分离及生长条件优化37.根据sip的结果，为分离到在污染土壤中原位降解菲的高效菌株，本研究对采集的土壤样品中菲降解菌进行定向富集、分离和筛选，主要步骤如下：38.4.1菲降解菌的富集39.根据前人有关marinobacterlipolyticu的培养研究，我们对传统的无机盐培养基进行了修正。不仅添加了多种矿物质元素和微生物元素，还添加了一类抗生素以抑制其他微生物的生长。修正后的无机盐培养基的组成如下表1所示，其配制方法是将各成分加入到水中，搅拌混匀，灭菌制得。40.表1无机盐培养基配方41.(a)[0042][0043](b)[0044][0045](c)[0046][0047]我们将采集的5g土壤加入到以上无机盐培养基中，以浓度为100mg/l的未标记菲(12c-phe)作为底物，放置于35℃培养箱中避光震荡培养。利用以菲为碳源的修正无机盐培养基对菲降解菌进行驯化，7d为一个驯化周期。取体积分数10％的接种量转接至具有相同培养体系的新鲜无机盐培养基中，并重复上述富集过程，直至重复三次。[0048]4.2菲降解菌的分离[0049]用稀释平板法对上述获得的第四代富集样品进行涂布分离，样品用添加质量分数1.5％琼脂的上述无机盐培养基分离。将涂布好的平板放置于35℃条件下培养4d，培养基表面长出明显的单菌落，根据菌落的形态大小、透明度、颜色等特征挑取出多种不同的单菌落，并在无机盐培养基平板上进行划线纯化。若经过划线纯化的平板上仍能生长出不同类型的单菌落，挑出单菌落并再次进行划线纯化，直至在同一平板上不能观察到不同特征的单菌落为止。实验中得到10株以菲为碳源的纯菌株，进行菌株降解能力实验，最终从10株降解菌株中筛选得到1株对菲有较好降解性能，且与原位菲降解相关的新型菌株ljb-135。菌株ljb-135来自于marinobacterlipolyticus，且与otu_5的16srrna基因相似性为99.7％，大于16srrnaotu标准聚类阈值(97％)。据此，该菌株被认为是具有原位菲降解的功能微生物。挑取纯化后的单菌落到无机盐培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为质量分数15％)，放置于-80℃长期保存。[0050]4.3菲降解菌的鉴定[0051](1)根据菌株ljb-135的形态特性对菌株ljb-135进行初步鉴定。活化分离所得菌株，用划线分离的方式分别接种至无机盐培养基平板上，将其放置于最适温度(35℃)条件下培养48h，观察形成单菌落的形态大小、颜色等特性。同时，选用鞭毛染色、革兰氏染色、芽孢染色等几种染色法对培养后的细菌进行染色实验，在光学显微镜下观察染色好的细胞，观察并辨别细胞的革兰氏染色呈阳性或阴性以及是否拥有鞭毛、芽孢。[0052]ljb-135经活化后，在无机盐培养基制成的平板上划线，于35℃有氧条件下培养48h后，能形成直径为1.0-2.5mm乳白色、表面光滑、微微向上凸起的、边缘整齐、不透明、无鞭毛、无芽孢、革兰氏染色呈阴性、菌株个体为杆状的菌落(图2)。该菌为专性好氧菌，其细胞尺寸约为(0.3-0.6)×(2.0-3.4)μm。[0053](2)在对细菌进行测序和构建系统发育树之前，需先提取细菌的基因组dna。实验使用细菌基因组dna快速提取试剂盒提取dna。为了对未知细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16srrna基因片段以及构建系统发育树，该基因是编码原核生物rrna的一段dna，具有高度的保守性和特异性，通常被用于细菌的检测和鉴定。[0054]聚合酶链式反应(pcr)主要是用来扩增不同的基因片段，扩增16srrna基因片段所用的引物为27f和1492r(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3',1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')。pcr反应体系包括10×buffer2.5μl，mg2+(25mmol/l)1.5μl，taq酶0.25μl，dntp(25mmol/l)0.3μl，前端引物(10mmol/l)0.5μl，后端引物(10mmol/l)0.5μl，模板dna0.1μl，去离子水19.35μl。pcr扩增条件为：95℃条件下变性，55℃条件下退火，72℃条件下延伸，该过程循环30次，之后72℃条件下延伸10min，pcr反应结束后将产物放置4℃条件下保存。用1％的琼脂糖并加入适量核酸染色剂gelred配制凝胶块，在凝胶块中加入适量pcr产物和包含各种长度片段的dna标记物(dnamaker)后，放置于装有tbe(tris硼酸)缓冲液的电泳仪内，在一定电压下工作20min后取出，放置于凝胶成像系统中进行观察以检验pcr扩增反应是否成功。然后将pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序所需要的引物与扩增所用引物相同。为了得到更准确的序列结果，将16srrna基因片段导入到质粒载体内，然后进行ta克隆实验并再次测序。[0055]将获得序列进行拼接，随后上传到eztaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)(kimetal.,2012)上，此网站会将提交的dna片段与已被公认种的典型菌株的16srrna基因序列进行比对，得到序列间的相似性和同源性信息。分析序列比对结果，选取相似度较高的典型菌株作为本实验分离所得菌株的模式菌，同时还可以得到模式菌的16srrna基因序列，进一步进行系统发育分析，以证明实验分离的功能菌与模式菌具有差异，从而来鉴定分离所得的菌株。利用mega5.05程序构建系统发育树，通常采用邻接法、最大简约法或最小进化法构建系统发育树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。[0056]通过pcr扩增和基因测序得到了菌株ljb-135的16srrna基因序列(其序列如seqidno.1所示)。利用16srrna基因序列和与其相似度较高的部分16srrna基因序列制作系统发育树，从而获得它们16srrna基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图1。通过系统发育树可直观的观察到菌株ljb-135与marinobacterlipolyticussyp-11在同一个分支上，说明该菌株与marinobacterlipolyticus菌株具有较高的同源性。由于ljb-135和syp-11菌株的16srrna序列的相似度为99.9％，我们认为本实验所分离的功能菌株ljb-135为marinobacterlipolyticus这个种，将其命名为marinobactersp.ljb-135，该菌株于2022年4月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmccno：62388。[0057]实施例2：marinobactersp.ljb-135的生长条件[0058]1、生长温度的测定：配置无机盐培养基(配方见表1)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的新鲜ljb-25菌液接入到培养基内(实验组)，用不接种菌种的培养基为对照组，将培养基放入不同温度的培养箱中避光震荡培养7d，每个样品均有三个重复，观察细菌每天的生长情况，当遇到肉眼无法区分的结果时，利用可见-紫外分光光度计测定培养液在波长λ＝600nm处的吸光值(od值)，最后得出这些菌株可生长温度范围和最适生长温度。测试的温度包括15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。[0059]2、生长ph的测定：配置无机盐培养基(配方见表1)，用以下几种缓冲体系调节培养基的ph，ph4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸和0.1mol/l柠檬酸钠；ph6.0–8.0，0.1mol/lnaoh和0.1mol/lkh2po4；ph9.0–10.0，0.1mol/lna2co3和0.1mol/lnahco3。灭菌后将活化好的新鲜ljb-25菌液接入到培养液内，每个ph设置三个平行，用不接种菌种的培养基为对照组，在最适温度条件下中避光震荡培养7d，每个样品均有三个重复，观察细菌每天的生长情况，当遇到肉眼无法区分的结果时，利用可见-紫外分光光度计测定培养液在波长λ＝600nm处的吸光值(od值)，最后得出这些菌株可生长ph范围和最适生长ph。测试的ph包括3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。[0060]3、盐浓度耐受：配置无机盐培养基(配方见表1)，调节培养基的盐浓度并经过灭菌处理。将活化好的新鲜ljb-25菌液接入到培养基内，每个盐浓度设置三个平行，用不接种菌种的培养基为对照组，在最适温度条件下避光震荡培养7d，每个样品均有三个重复，观察细菌每天的生长情况，当遇到肉眼无法区分的结果时，利用可见-紫外分光光度计测定培养液在波长λ＝600nm处的吸光值(od值)，最后得出这些菌株所能耐受的盐浓度范围。测试的盐度包括0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％(质量分数)。[0061]结果显示，菌株ljb-25最适生长的温度为35℃，最适生长的ph为7.5，最适生长的盐度为质量分数7％nacl。[0062]实施例3：菲降解实验[0063]1、ljb-135菌剂的制备[0064](1)收集菌株ljb-135的菌体细胞，在5ml1×pbs缓冲液中重悬之后调节其od600＝1，得到菌悬液，备用。[0065](2)将玉米秸秆生物炭和ljb-135菌悬液按照1:20(w/v)的比例混合，28℃、180r/min摇床震荡培养8h，然后用无菌水离心清洗两次(4000r/min，5min)，取沉淀，得吸附菌体，往吸附菌体中加入无菌水定容至20ml，得到吸附菌体溶液。[0066](3)分别称取10g聚二烯醇和0.5g海藻酸钠加入60ml蒸馏水，70℃加热搅拌使其溶解后，121℃灭菌15min，冷却后，得到包埋剂溶液。[0067](4)称取5gca(no3)2加入100ml去离子水中，搅拌使其溶解，调节ph为7.0，得到交联剂溶液。[0068](5)在包埋剂溶液中加入20ml吸附菌体溶液，用无菌水定容至100ml后混匀，最终聚二烯醇和海藻酸钠的浓度为10％和5％，包埋微生物量为10％。使用50ml口径为2mm的注射器取50ml混合液，从30cm高处滴加到100ml的交联剂溶液中，固定1小时，即得到ljb-135菌剂。[0069]2、以菲为碳源时降解菌和菌剂的降解特性[0070]将dna-sip探查结果与室内培养分离实验结果相对照，可确认分离出的菌株是否能在污染土壤中原位降解菲。在最佳生长条件下(最佳温度、ph及耐盐度)，探究该原位菲降解菌的菲降解情况。[0071]根据以上实验结果，确定菌株ljb-135的最佳生长条件为温度35℃，ph7.5，添加质量分数为7％的nacl。菌株ljb-135和ljb-135菌剂在100mg/l菲浓度中降解实验均在这个条件下进行。将处于对数生长期的菌株ljb-135或ljb-135菌剂按体积分数为10％的接种量(根据传统平板计数法得到原菌液含有的细胞数为1×108cfu·ml-1)分别接种于含有初始菲浓度为100mg/l的无机盐培养基(配方见表1，并添加质量分数7％nacl，ph7.5)中，温度35℃振荡培养3d，并做平行实验3次。以不添加纯菌marinobactersp.ljb-135和ljb-135菌剂的处理为对照处理。[0072]取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μl浓度为200mg/l的回收率指示剂(如表2所示，包括萘-d8，二氢苊-d10，菲-d10，屈-d12)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2ml，加入少量正己烷(约5ml)，旋转蒸发至2ml，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm3％去活化中性氧化铝，3cm3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15ml正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15ml，氮吹使其浓缩至约0.5ml，最后转移至1.5ml细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μl内标物六甲基苯，其浓度为200mg/l。(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中pahs含量。使用的色谱柱为安捷伦db5-ms毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定pahs含量。采用安捷伦db5-ms(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)毛细管色谱柱进行分离分析。进样口温度为290℃，不分流模式进样1μl，溶剂延迟10min。以高纯氦气为载气，流速设定为1.83ml/min。设置升温程序为：60℃保留5min，以4℃/min速度升温到290℃/min保留时间为30min。质谱采用ei源为离子源，温度设置为230℃。检测器在m/z为50～500范围内进行全扫描。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，pahs定量用6点校正曲线和内标法进行。[0073]表2测定pahs所用的回收率指示剂及内标[0074]table2thecomponentsofdeuteratedpahs,standardsandinternalstandard.[0075][0076][0077]结果显示，菌株ljb-135能够在高浓度菲条件下生长，且能够较快地降解菲，在菲初始浓度为100mg/l的无机盐培养液中培养3天后，降解率为56.1％；将该菌制备成菌剂后其降解率可达到73.1％(图3)。以上结果说明菌株ljb-135是一种能够原位降解菲能力很强的菌株，在多环芳烃污染场地原位生物修复方面具有较好的应用潜力。[0078]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域：：的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12









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