太子参参须提取物的制备方法及其在免疫调节方面的应用与流程

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及于中药应用技术领域，具体为太子参参须提取物的制备方法及其在免疫调节方面的应用。背景技术：2.太子参为石竹科太子参属多年草本根性植物异叶假繁缕的干燥块根。太子参味甘、微苦，性平，具有益气健脾，生津润肺之功效，常用于治疗食欲不振、病后虚弱、心悸失眠等症。目前已从太子参中分离出多糖、皂苷、环肽等多种生物活性成分。药理学研究表明，太子参多糖和皂苷具有免疫调节作用。太子参参须为太子参的侧须，约占太子参总质量的10％～15％，主要成分为多糖与皂苷，与太子参相比，其成分相同，仅含量有所不同，且参须中的皂苷含量甚至多于块根。在实际生产中，太子参主要入药部位为块状根，参须则作为废弃物丢弃，造成极大浪费。3.现有技术中，关于太子参参须的研究仅见多糖和皂苷的含量测定，其药理学研究鲜见报道。cn 112043740 a一种太子参须提取物在制备抑制鸭h9n2亚型禽流感病毒药物中的应用，首次发现太子参须提取物对鸭h9n2亚型禽流感病毒在mdck细胞上的体外增殖具有一定抑制作用，且呈相应的剂量关系，为探究太子参须在aiv疫苗佐剂的开发提供一定的基础。但其对太子参参须提取物的其他作用并没有研究，因此，本发明提出了太子参参须提取物的制备方法及其在免疫调节方面的应用。技术实现要素：4.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供太子参参须提取物的制备方法及其在免疫调节方面的应用。5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：太子参参须提取物的制备方法，包括以下步骤：6.(1)投料7.至净药材仓库，领取太子参参须，复核品名、数量并具有产品质量合格证，投入提取罐中；8.(2)煎煮9.加水煎煮2次，煎煮温度90～105℃，首次煎煮，注入8倍量的水，时间1.5h，之后经200目滤网过滤；对滤渣进行二次煎煮，注入6倍量的水，煎煮时间1.5h，之后经200目滤网过滤，合并两次的煎煮液；10.(3)单效浓缩11.将煎煮液抽送至单效浓缩罐中，控制真空度0.05～0.08mpa，温度60～80℃；浓缩至相对密度为1.10～1.15，将浓缩液输送至储存罐中；12.(4)真空减压干燥13.开启真空干燥机，开启蒸汽，控制温度为80～120℃,控制真空度为0.1～0.2mpa，干燥120分钟，控制水分≤4.0％，取出；14.(5)粉碎/分装15.将干燥后的物料进行粉碎，之后过100目的筛网，qa取样送检半成品，粉碎后的物料装入无菌塑料瓶中，分装为100g±2g/瓶，装入包装纸桶内，计算好收率；16.太子参参须提取物在免疫调节上的应用。17.进一步的，步骤(1)中，对太子参参须进行粉碎处理，之后过20～40目筛。18.进一步的，将粉碎后的太子参参须置于零下18℃的低温中3～3.5min,之后急速升温至室温，重复2～3次，温度的大幅度变化，使细胞壁破裂，细胞内的活性成分逸出。19.进一步的，步骤(2)中，煎煮时采用电场强化辅助提取，电场强化条件：电场强度25～30kv/cm，脉冲时间500～550μs,脉冲频率200～300hz。20.进一步的，太子参参须提取物在对免疫抑制动物的免疫调节上的应用。21.进一步的，太子参参须提取物在对免疫抑制小鼠的免疫调节上的应用。22.进一步的，太子参参须提取物增强免疫抑制小鼠的免疫功能。23.进一步的，太子参参须提取物在制备人用或兽用免疫调节类药品或保健品上的应用。24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本太子参参须提取物的制备方法及制备方法，具有以下好处：25.1、本发明在太子参参须提取物制备时采用对参须预处理和煎煮时采用电场强化，提升了产品得率。26.2、本发明通过给小鼠腹腔注射环磷酰胺，复制免疫抑制小鼠模型，灌胃给予不同剂量的太子参参须提取物共2周，检测相关免疫指标，研究太子参参须提取物对免疫抑制小鼠的免疫调节作用，旨在丰富太子参参须的药理学研究内容，试验结果表明，太子参参须提取物能降低免疫抑制小鼠脾指数；提高免疫抑制小鼠肝指数、巨噬细胞吞噬活性、t淋巴细胞si、血清il-4、il-6等，表明太子参参须提取物能够提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能。附图说明27.图1为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的脾脏指数的影响；28.图2为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指数的影响；29.图3为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的脾脏肝脏指数的影响；30.图4为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠碳廓清指数k的影响；31.图5为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠吞噬指数α的影响；32.图6为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠t淋巴细胞刺激指数si的影响；33.图7为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠b淋巴细胞刺激指数si的影响；34.图8为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清ifn-γ含量的影响；35.图9为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清il-2含量的影响；36.图10为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清il-4含量的影响；37.图11为太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清il-6含量的影响。38.附图中，rpfre—太子参参须提取物、cy-环磷酰胺、aps-黄芪多糖，ck-空白对照组。具体实施方式39.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。40.本实施例提供一种技术方案：41.实施例142.太子参参须提取物的制备方法，包括以下步骤：43.(1)投料44.至净药材仓库，领取太子参参须，复核品名、数量并具有产品质量合格证，投入提取罐中；投料前对太子参参须进行粉碎处理，之后过20～40目筛，将粉碎后的太子参参须置于零下18℃的低温中3min,之后急速升温至室温，重复2次，温度的大幅度变化，使细胞壁破裂，细胞内的活性成分逸出；45.(2)煎煮46.加水煎煮2次，煎煮温度95℃，首次煎煮，注入8倍量的水，时间1.5h，之后经200目滤网过滤；对滤渣进行二次煎煮，注入6倍量的水，煎煮时间1.5h，之后经200目滤网过滤，合并两次的煎煮液；47.(3)单效浓缩48.将煎煮液抽送至单效浓缩罐中，控制真空度0.05mpa，温度65℃；浓缩至相对密度为1.10，将浓缩液输送至储存罐中；49.(4)真空减压干燥50.开启真空干燥机，开启蒸汽，控制温度为90℃,控制真空度为0.1mpa，干燥120分钟，控制水分≤4.0％，取出；51.(5)粉碎/分装52.将干燥后的物料进行粉碎，之后过100目的筛网，qa取样送检半成品，粉碎后的物料装入无菌塑料瓶中，分装为100g±2g/瓶，装入包装纸桶内，计算好收率。53.实施例254.太子参参须提取物的制备方法，包括以下步骤：55.(1)投料56.至净药材仓库，领取太子参参须，复核品名、数量并具有产品质量合格证，投入提取罐中；57.(2)煎煮58.加水煎煮2次，煎煮温度100℃，首次煎煮，注入8倍量的水，时间1.5h，之后经200目滤网过滤；对滤渣进行二次煎煮，注入6倍量的水，煎煮时间1.5h，之后经200目滤网过滤，合并两次的煎煮液；59.(3)单效浓缩60.将煎煮液抽送至单效浓缩罐中，控制真空度0.08mpa，温度80℃；浓缩至相对密度为1.15，将浓缩液输送至储存罐中；61.(4)真空减压干燥62.开启真空干燥机，开启蒸汽，控制温度为100℃,控制真空度为0.2mpa，干燥120分钟，控制水分≤4.0％，取出；63.(5)粉碎/分装64.将干燥后的物料进行粉碎，之后过100目的筛网，qa取样送检半成品，粉碎后的物料装入无菌塑料瓶中，分装为100g±2g/瓶，装入包装纸桶内，计算好收率。65.实施例1和2制备的太子参参须提取物在免疫调节上的应用，太子参参须提取物在对免疫抑制动物的免疫调节上的应用。66.太子参参须提取物在对免疫抑制小鼠的免疫调节上的应用，增强免疫抑制小鼠的免疫功能。67.太子参参须提取物在制备人用免疫调节类药品或保健品上的应用，可以制备免疫调节类药品或保健品。68.试验例一69.太子参参须提取物对免疫抑制小鼠的免疫调节实验：70.1材料与方法71.1.1材料72.1.1.1太子参参须提取物73.本试验所用太子参参须提取物由实施例1制备，其主要成分为多糖和皂苷，该产品规格为200g/袋；黄芪多糖，由市场上购买，每克产品所含黄芪多糖≥450mg。74.1.1.2试验动物75.3-4周龄清洁级雄性km小鼠，体重为20±2g，购自某实验动物中心。76.1.1.3主要试剂77.胎牛血清(cellmax公司)；rpmi 1640培养基(美国hyclone公司)；hank’s平衡盐溶液hbss(上海源培生物科技有限公司)；刀豆蛋白(cona，美国sigma公司)；脂多糖(lps，美国sigma公司)；四甲基偶氮唑盐(mtt，美国merck公司)；二甲基亚砜(dmso，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；印度墨汁(上海源叶生物科技有限公司)；细胞因子ifn-γ、il-2、il-4、il-6检测试剂盒(上海邦奕生物有限公司)；注射用环磷酰胺(baxter oncology gmbh公司)。78.1.1.4主要仪器79.se202f型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；al104微量电子天平(上海梅特勒—托利多仪器有限公司)；ivc独立送回风净化笼具(苏州市苏杭科技器材有限公司)；v-1200可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；rt-9900半自动生化分析仪(雷杜生命科学股份有限公司)；x-22r台式高速冷冻离心机(美国beckman公司)；hh-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；倒置显微镜(日本nikon公司)；co2培养箱(美国thermo公司)；sw-cj-2g双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；infinite m200 pro多功能酶标仪(瑞士tecan公司)。80.1.2方法81.1.2.1试验动物分组及处理82.120只雄性的km小鼠适应性饲养5天，随机分为6组，每组20只。分为空白对照(ck)组、阳性对照(环磷酰胺)组、免疫抑制模型(黄芪多糖)组、太子参参须提取物低、中、高剂量组。第1～3天，ck组腹腔注射生理盐水，其他五组腹腔注射80mg/(kg·bw)的环磷酰胺；第4～17天，ck、环磷酰胺两组灌胃双蒸水，太子参参须提取物高、中、低剂量组分别灌胃太子参参须提取物400mg/(kg·bw)、200mg/(kg·bw)、100mg/(kg·bw)，黄芪多糖组灌胃200mg/(kg·bw)黄芪多糖，自由采食、饮水，第18天采样。83.1.2.2血样采集与处理84.小鼠摘眼球采血，3000r/min，离心10min，收集血清，-20℃保存。85.1.2.3脏器指数的测定86.将小鼠称重采用颈椎脱臼法处死，后取脾脏、肝脏、胸腺，称量，计算脾脏指数、肝指数、胸腺指数。公式：脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(g)。87.1.2.4吞噬功能的测定88.根据参考文献[1]的方法进行小鼠碳粒廓清指数的测定。各组随机挑选5只小鼠，以0.1ml/(10g·bw)的剂量尾静脉注射稀释后的印度墨汁；于注射后2min(t2)、10min(t10)眼眶采血20μl后立刻加到2ml 0.1％的na2co3溶液中，在波长为600nm的可见分光光度计下测定吸光值，t2、t10时的吸光度值分别记为od2、od10；计算碳粒廓清指数k，吞噬指数α，公式：[0089]k＝(lgod2-lgod10)/(t10-t2)，吞噬指数[0090]1.2.5小鼠脾t、b淋巴细胞增殖[0091](1)脾淋巴细胞悬液的制备[0092]根据参考文献[2]的方法制备单个脾淋巴细胞悬液，每组各取5只小鼠颈椎脱臼处死后用75％酒精浸泡5min，无菌取脾，制成单个细胞悬液，1500r/min离心5min加入含有10％胎牛血清的rpmi-1640(完全培养液)调整至7.5×106个/ml的细胞稀释液，供脾细胞增殖用；[0093](2)t、b淋巴细胞增殖[0094]将上述脾细胞悬液按照100μl/孔加入到96孔细胞培养板，对照孔加入100μl的rpmi-1640完全培养液，试验孔分别加入100μl cona(终浓度为5μg/ml)和100μl lps(终浓度为10μg/ml)，每只小鼠设4复孔。置于5％co2培养箱中培养48h，结束前4h按照50μl/孔加入mtt溶液，结束培养后离心(1000r/min，5min)弃上清，随后加入150μl/孔的dmso，低速震荡5min，在波长为570nm的酶标仪处读数，以空白对照孔调零。参照参考文献[2]的计算方法，计算刺激指数si，公式：[0095]刺激指数(si)＝试验孔od值/空白孔od值。[0096]1.2.6测定试验小鼠血清细胞因子含量[0097]采用elisa法检测试验小鼠血清中细胞因子(ifn-γ、il-2、il-4、il-6)的含量，试验步骤根据试剂盒说明书进行操作。[0098]1.3数据统计[0099]采用spss statistics 23软件进行数据的单因素方差分析，lsd法进行多重比较，最后结果以平均数±标准差表示。[0100]2结果[0101]2.1太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝指数和免疫器官指数的影响[0102]太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠脾脏指数、胸腺指数和肝指数的影响见图1～3。结果显示：与ck组相比，环磷酰胺组脾脏指数增大(p《0.01)，胸腺指数、肝脏指数降低(p《0.01)；与环磷酰胺组相比，黄芪多糖组及太子参参须提取物各剂量组脾脏指数均降低(p《0.01)，肝指数均升高(p《0.01)。[0103]2.2太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[0104]太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响见图4、5。结果显示：与ck组相比，环磷酰胺组小鼠碳粒廓清指数k、吞噬指数α均极显著下降(p《0.01)；与环磷酰胺组相比，黄芪多糖组及太子参参须提取物各剂量组小鼠的k指数均极显著升高(p《0.01)，且黄芪多糖组及太子参参须提取物中、高剂量组的吞噬指数α也极显著增加(p《0.01)。[0105]2.3太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠脾t、b淋巴细胞增殖的影响[0106]太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠脾t、b淋巴细胞增殖的影响见图6、7。结果显示：与ck组相比，环磷酰胺组小鼠的t、b淋巴细胞刺激指数均降低得极显著(p《0.01)；与环磷酰胺组相比较，太子参参须提取物高剂量组小鼠的t淋巴细胞的si极显著升高(p《0.01)，b淋巴细胞si显著升高(p《0.05)。[0107]2.4太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清中的细胞因子含量的影响[0108]太子参参须提取物对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的血清中细胞因子(ifn-γ、il-2、il-4、il-6)含量的影响见图8～11。结果显示：与ck组相比较，环磷酰胺组小鼠il-2、il-4、il-6的含量著下降得均极显著(p《0.01)，ifn-γ的含量下降显著(p《0.05)；与环磷酰胺组相比较，黄芪多糖组、太子参参须提取物中、高剂量组小鼠il-4、il-6的含量极显著升高(p《0.01)，黄芪多糖组、太子参参须提取物高剂量组小鼠il-2、ifn-γ的含量升高显著(p《0.05)。[0109]本试验通过研究太子参参须提取物(radix pseudostellariae fibrous root extraction，太子参参须提取物)对环磷酰胺(环磷酰胺clophosphamide，环磷酰胺)所致免疫抑制小鼠的免疫调节作用，采用腹腔注射环磷酰胺复制免疫抑制模型小鼠，以黄芪多糖(astragalus polysaccharides，黄芪多糖)为阳性对照，用不同剂量的太子参参须提取物灌胃免疫抑制小鼠2周，检测免疫器官指数、巨噬细胞吞噬功能、脾淋巴细胞增殖、细胞因子含量等免疫学指标。结果表明；给予太子参参须提取物的免疫抑制小鼠脾脏指数降低(p《0.01)，碳粒廓清指数k、吞噬指数α、t淋巴细胞刺激指数(si)、血清细胞因子il-4、il-6含量均升高(p《0.05，p《0.01)，且高剂量太子参参须提取物效果与黄芪多糖相当。综上所述，太子参参须提取物能增强免疫抑制小鼠的免疫功能。[0110]以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。[0111]参考文献：[0112][1]ren z,he c,fan y,et al.immune-enhancing activity of polysaccharides from环磷酰胺rtomium macrophyllum[j].international journal of biological macromolecules,2014,70(8):590-595。[0113][2]檀新珠,陈语嫣,陈赛红,等.太子参茎叶多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[j].天然产物研究与开发,2017,29(12):2134-2140。









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