具有靶向清除IL1RAP表达作用的CAR-NK细胞及其制备与应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞及其制备与应用技术领域1.本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞及其制备与应用。背景技术：2.慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,cml)是一种通过bcr-abl1融合转录本表达一个p210bcr-abl1癌蛋白，导致髓系细胞异常扩增的慢性疾病；酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，tki)显著提高了cml患者的生存率，深度反应者可能考虑停止治疗；然而，通过远距离或反向pcr和细胞分裂研究检测bcr-abl1断点融合基因，发现在tki治疗后，静止的原始cml干细胞室通过保持不敏感而持续存在，呈现复发的来源；并且有超过50％的患者复发并重新启动tki治疗，随后出现不明毒性；从放疗和化疗到tkis的靶向治疗和ifn-α相关的异源干细胞移植，即使不能治愈，却能带来持久的疾病缓解，尽管会导致治疗相关的死亡率，然而也达到大多数患者预期寿命正常的程度；因此，在尽可能避免allo-sct的同时也需要探索新的方法消除持久的tkis耐药的静息态cml前体细胞；除了众所周知的移植物抗白血病效应的allo-sct，其他诸多的特征也说明cml是一种免疫敏感的疾病；这些特征包括cml细胞下调mhc-ii表达后的免疫监视逃避、引起cml特异性t细胞反应的bcr-abl融合区肽、自体树突状细胞疫苗接种的潜力、自然杀伤(nk)细胞的作用、t-helper或细胞毒性t淋巴细胞的抗bcr-abl作用，以及在深层分子反应cml患者中恢复与程序性细胞死亡1抑制相关的免疫控制；3.生物免疫治疗除细胞因子治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体治疗等众多方法之外，免疫细胞过继免疫疗法的效果和应用的前景尤其美好；免疫细胞过继疗法主要有淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphocyte-activated killer cells，lak)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，til)、细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)和自然杀伤细胞(natural killer，nk)等，它们在杀伤肿瘤细胞过程中起到非常重要的作用；嵌合抗原受体(car)是一种融合蛋白，由胞外抗原识别区、跨膜区和胞内信号转导区组成；顾名思义，细胞外抗原识别区可以识别肿瘤细胞上的特异性抗原，通常是单链可变片段(single chain variable fragment，scfv)；细胞内信号转导域，如cd28、4-1bb(cd137)、ox40和cd3ζ，通常被设计用来提高t细胞的活化和杀伤作用；car修饰的t细胞可以直接识别肿瘤相关抗原(taa)并杀死肿瘤细胞；car-t细胞治疗在血液肿瘤如急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)和淋巴瘤中取得了巨大的成功；值得注意的是，据报道，cd19car-t治疗在患有所有疾病的儿童和成人中显示完全缓解(cr)率为90％；虽然car修饰t细胞的快速发展在治疗恶性肿瘤，特别是血液恶性肿瘤方面取得了巨大的成就，但在临床应用中仍存在一些问题：4.(1)car-t细胞治疗在实体肿瘤的治疗中不是很有效；5.(2)此外，大多数car-t细胞治疗需要自体过继细胞移植，因为异体t细胞可能导致移植物抗宿主病(gvhd)，除非解决hla屏障；6.(3)此外，car-t细胞治疗还可能产生危及患者生命的副作用，如细胞因子释放综合征(crs)；7.car修饰的nk细胞已被证明可以克服car-t细胞的上述缺点，发挥显著的抗肿瘤作用；目前，临床前和临床研究表明car-nk细胞治疗可能具有显著的抗肿瘤作用，且比car-t细胞治疗更安全；然而，car-nk细胞治疗仍面临着原代nk细胞在体外扩增和活化、nk细胞产物难以储存和运输、转导效率低等挑战；因此，优化car-nk细胞治疗仍需进一步研究；构建更好的car-nk细胞对提高治疗效果具有重要意义，联合治疗为基于nk细胞的免疫治疗提供了新的方向。技术实现要素：8.针对上述存在的问题，本发明旨在提供具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞及其制备与应用，本car-nk细胞能够靶向性清除表达il1rap的cml-lsc，对cml白血病的微小残留病变进行清除，具有治疗效果明显、治疗过程安全和抗肿瘤作用显著的特点。9.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：10.具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞，所述car-nk细胞为il1rap-car细胞，所述il1rap-car细胞的核酸序列如seq id no:1所示，蛋白序列如seq id no:2示。11.具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞的制备方法，包括步骤12.s1.构建稳定表达il1rap-car的重组质粒载体并包装gmp慢病毒13.s101.利用靶向人il-1rap分子的单克隆抗体按照“信号肽-重链可变区-(g4s)3-轻链可变区-igg1”的顺序设计scfv核酸链；14.s102.扩增scfv核酸链，并对扩增合成的scfv靶序列进行同源重组，构建完整包含scfv靶序列的重组质粒载体；15.s103.构建的重组质粒载体在感受态细胞stal-3稳定转化，并以甘油菌种的状态保存；16.s104.对同源重组后的质粒感受态细胞进行摇菌扩增，大提质粒符合gmp要求的病毒包装质粒；17.s2.对制备完成的慢病毒进行nk-92细胞和人外周血单个核细胞来源的nk细胞感染，制备表达il1rap-car的car-nk细胞并建立car-nk细胞的慢病毒感染体系。18.优选的，步骤s101所述的scfv核酸链的设计过程包括：19.(1)按照“信号肽-重链可变区-(g4s)3-轻链可变区-igg1”的顺序将il1rap序列的各个部分连接起来，得到scfv蛋白的完整序列；20.(2)在得到scfv蛋白的完整序列后，计算scfv分子的分子量、等电点、亲水亲脂性、半衰期、稳定性的理化性质；21.(3)构建scfv蛋白的蛋白三维结构，检验scfv序列设计的可行性和完整性，得到完整且符合要求的scfv分子。22.优选的，步骤s102所述的scfv核酸链核酸分子的扩增过程包括：23.(1)根据scfv分子的密码子偏好性、mrna二级结构、影响表达的分式作用元件和限制性酶切位点优化及gc含量，对scfv进行密码子优化，将aa序列转换为dna序列，并进行dna合成；24.(2)制备线性化载体：通过xbai、noti限制性内切酶进行酶切反应获得线性化载体；25.(3)插入目的片段的获得：将线性化载体末端20bp序列作为同源序列，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对引物扩增得到带有同源序列的插入片段；26.(4)重组反应：将线性化载体和插入片段按比例混合，在exnase催化下，50℃反应5min即可完成重组反应，实现两线性化dna的体外环化。27.优选的，步骤s103所述的il1rap-scfv-car重组质粒载体在感受态细胞stal-3的转化保存过程包括：28.(1)取stbl-3感受态细胞50μl置于冰上，将连接产物加入到感受态细胞悬液中，轻轻用手拨打几次，冰上静置30min；迅速将感受态细胞转入到42℃水浴，热激45s，之后快速转到冰上冷却5min；29.(2)加入500μl恢复到室温的液体lb培养基，37℃，220rpm摇菌1h进行扩增；取50-100μl菌液按划线法涂布到含有20μg/ml氨苄霉素的固体lb平板上，37℃培养过夜；30.(3)观察平板上菌落生长情况，挑取单个菌落，接种到10ml含20μg/ml氨苄霉素的液体lb培养基中，摇菌过夜；31.(4)利用质粒小提中量试剂盒提取质粒，并进行dna测序鉴定质粒是否构建成功；32.(5)对于鉴定正确的质粒，向其菌液加入20％的无菌甘油，混合均匀后-80℃冻存，留作甘油菌种。33.优选的，步骤s104所述的il1rap-scfv-car重组载体的gmp的病毒包装质粒制备过程包括：34.(1)挑取少量鉴定正确质粒的甘油菌，到100ml含20μg/ml的氨苄霉素的液体lb培养基中，37℃摇菌，培养过夜；35.(2)3000rpm室温离心10min，收集细菌沉淀，按照试剂盒说明书加入10mlp1溶液，充分吹打混匀细菌沉淀，再加入10ml裂解液p2；36.(3)室温静置5min后，加入10ml中和液p4，立即温和的上下翻转6～8次，充分混匀后可见白色絮状沉淀生成；37.(4)8000rpm离心10min，使白色絮状沉淀离至管底，收集上清到干净的离心管中；加入3ml红色去内毒素溶液er，颠倒混匀后溶液呈现出均匀透明的黄色；38.(5)加入0.3倍体积的异丙醇使dna沉淀析出，颠倒混匀后，将溶液转移到dna吸附硅胶柱上；8000rpm离心2min，弃去滤液，质粒被吸附到硅胶柱上；分别用蛋白洗脱液和盐洗脱液洗柱两次，最后用无菌超纯水洗脱，得到质粒的水溶液；39.(6)用nanodrop 2000检测质粒溶液的浓度和纯度，选择合适浓度外送包装病毒。40.优选的，步骤s2所述的car-nk细胞的制备过程包括：41.day1：种细胞，选择合适的细胞密度进行种板；42.day2：病毒转导，选用moi10进行病毒转导，并将lentiboost-p以1:100的标准浓度添加到总体积；43.day3：更换培养基，移除含有病毒颗粒的培养基上清，更换成合适体积的正常培养基；44.day4：维持培养，如果细胞汇合度较高，可在第四天稀释分板培养，后续按照常规流程进行培养基更换和细胞传代。45.优选的，步骤day2所述的mois的优化过程包括步骤46.①4℃复苏慢病毒；47.②在细胞中直接加入计算好的lentiboost-p体积量，轻轻混匀；48.③按下表计算所需慢病毒颗粒用量，并加入细胞培养基中，轻轻混匀；49.④spinoculate：室温800g离心培养板90min；50.⑤正常培养条件过夜培养细胞。51.优选的，所述的car-n细胞的慢病毒感染体系地构建过程包括：52.①去除细胞中的培养基；53.②加入含有一定浓度筛选抗生素的培养基；54.③每3天补充含il-2和5mmol/l的尼克酰胺的新鲜培养基，并采集细胞数量监测nk细胞活性，继续培养14天。55.具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞的应用，所述的ar-nk细胞能够应用于过继性细胞免疫疗法中。56.本发明的有益效果是：本发明公开了具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞及其制备与应用，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：57.本发明制备了一种能够靶向性清除表达il1rap的cml-lsc作用的car-nk细胞，通过实验证明本细胞具有靶向性清除il1rap(白介素-1受体辅助蛋白)的cml-lsc(慢性粒细胞白血病)的作用，能够应用于过继性细胞免疫疗法中，对cml白血病的微小残留病变进行清除，致使患者达到停药乃至临床治愈，且无副作用、无需担心hla屏障问题，具有治疗效果明显、治疗过程安全和抗肿瘤作用显著的优点。附图说明58.图1为本发明il1rap-car-nk细胞研发制备工艺图。59.图2为本发明外周血来源单个核细胞nk培养体系建立及杀伤活性验证。60.图3为本发明il1rap-scfv蛋白完整3d结构图和重组载体质粒图谱。61.图4为本发明il1rap-car重组载体质粒完整性验证。62.图5为本发明il1rap-car-nk对表达il1rap靶点的杀伤作用验证。63.其中：在图2中，图(a)为外周血来源单个核细胞nk培养体系建立过程中各时间节点的nk细胞生长集落图，图(b)为外周血来源单个核细胞nk细胞扩增培养体系建立过程中细胞数量的增长曲线图，图(c)为外周血来源单个核细胞nk细胞扩增培养体系建立过程中细胞扩增速率的曲线图；图(d、e、f、g、h)分别为外周血来源单个核细胞培养nk细胞对jurkat、u937、thp1、nb4、k562不同靶效比下的杀伤活性柱状图；64.在图3中，图(a)为il1rap-scfv蛋白4种不同的完整3d结构图，图(e)为il1rap-car重组质粒载体图谱；65.在图4中，图(a)为重组载体的验证过程中的双酶切实验图，以此验证il1rap-car重组质粒的完整性；图(b)为重组载体的验证过程中的双向测序图谱，以此验证il1rap-car重组质粒在同源重组过程中有无突变位点；66.在图5中，图(a)为检测了ku812、kg-1、nalm-20、jurkat、raji、mφ、k562几种常见血液病细胞系的il1rap蛋白的基础表达情况；图(b、c、d)分别检测了jurkat、raji、k562三种血液病细胞在il1rap-car-nk92细胞1:1、2:1、3:1不同效靶比下的杀伤效果，以此验证il1rap蛋白表达对il1rap-car-nk92细胞杀伤性的影响；图(e)为il1rap-car-nk92细胞在3:1的效靶比下杀伤颗粒cd107的表达情况，以此反馈其在il1rap靶点细胞存在下的活化情况；图(f、g)为nk92细胞、il1rap-car-nk92细胞分泌杀伤因子inf-γ、tnf-α的情况，il1rap-car-nk92明显优于nk92细胞；图(i、h)为nk92细胞、il1rap-car-nk92细胞分别与k562细胞共培养3h、6h后颗粒酶gzmb和cd107a的分泌表达情况，随着作用时间的延长，杀伤效果明显升高，结果具有显著性差异。具体实施方式67.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。68.实施例1：参照附图1-5所示的具有靶向清除il1rap表达作用的car-nk细胞的制备方法，包括69.步骤一：研究材料及仪器的准备70.1.1实验材料准备：71.(1)ficoll-hypaque淋巴细胞分离液(达科为-a)；72.(2)人ifn-γ、il-10、il-4细胞因子elisa检测试剂盒(达科为)；73.(3)dna合成(金斯瑞)；74.(4)无内毒素质粒小提试剂盒(tiangen)；75.(5)无内毒素质粒大提试剂盒(tiangen)；76.(6)cfse(5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯)(ebioscience)；77.(7)1l细胞培养袋(天津灏洋)；78.(8)ldh细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)；79.(9)离心管、酶标板(corning)；80.(10)pcdh-ef1-mcs-pgk-puro(淼灵生物)；81.(11)pcdh-ef1-mcs-t2a-puro(淼灵生物)；82.(12)lentiboost慢病毒转导增强剂(德国sirion biotech)；83.(13)noti、xbai限制性内切酶(takara)；84.(14)yeast extract酵母粉(oxoid)；85.(15)tryptone胰蛋白胨(oxoid)；86.(16)r2aagarr2a琼脂(oxoid)；87.(17)一次性细菌培养皿(生工生物)；88.1.2实验仪器准备：89.(1)流式细胞仪(bd)；90.(2)光学显微镜(leica)；91.(3)生物安全柜(thermo)；92.(4)超低温冰箱(thermo)；93.(5)恒温细胞培养箱(thermo)；94.(6)凝胶成像仪(bio-rad)；95.(7)pcr仪(thermo)；96.(8)凝胶电泳仪(bio-rad)；97.(9)多功能酶标仪(thermo)；98.(10)大容量低温高速离心机(thermo)；99.1.3实验标本准备100.1.3.1nk细胞准备：101.(1)nk细胞的培养采用纯因子的培养方案，源细胞采用健康献血者新鲜外周血白膜层细胞，按一定初始剂量体外培养而成；102.(2)自上海细胞库购得nk-92、khyg-1等nk细胞系，都是悬浮生长细胞系，培养在含有10％热灭活fbs的rpmi-1640培养基中。103.1.3.2肿瘤细胞104.(1)人红白血病细胞k562、淋巴瘤细胞raji等均为本实验室冻存细胞，都是悬浮生长细胞系，培养在含有10％热灭活fbs的rpmi-1640培养基中。105.步骤二：car-nk细胞的制备106.s1.构建稳定表达il1rap-car的重组质粒载体并包装gmp慢病毒107.s101.scfv分子设计(scfv molecular design)108.(1)在imgt网站mab-db数据库中查找靶向人il-1rap分子的单克隆抗体，并同时检索临床试验(nct02842320)中实验序列，按照“信号肽-重链可变区-(g4s)3-轻链可变区-igg1”的顺序将各个部分连接起来，即得到scfv蛋白的完整序列；109.(2)在得到scfv蛋白的完整序列后，利用expasy网站protparam模块计算scfv分子的分子量、等电点、亲水亲脂性、半衰期、稳定性等理化性质，检测结果如表1所示：110.表1：scfv理化性质分析表[0111][0112](3)通过swiss-model进行蛋白三维结构构建，检验scfv序列设计的可行性和完整性，即得到完整且符合要求的scfv分子，所述il1rap-scfv蛋白完整3d结构图和重组载体质粒图谱如图3所示；[0113]s102.扩增scfv核酸序列，构建同源重组载体[0114](1)在得到scfv蛋白的完整序列后，根据scfv分子的密码子偏好性、mrna二级结构、影响表达的分式作用元件和限制性酶切位点优化及gc含量等，对scfv进行密码子优化，将aa序列转换为dna序列，并进行dna合成；[0115](2)制备线性化载体：通过xbai、noti限制性内切酶酶切或反向pcr获得线性化载体；[0116](3)插入片段获得：将线性化载体末端20bp序列作为同源序列，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对引物扩增得到带有同源序列的插入片段；[0117](4)重组反应：将线性化载体和插入片段按比例混合，在exnase催化下，50℃反应5min即可完成重组反应，实现两线性化dna的体外环化；[0118]s103.il1rap-scfv-car重组载体的转化保存[0119](1)取stbl-3感受态细胞50μl置于冰上，将连接产物加入到感受态细胞悬液中，轻轻用手拨打几次，冰上静置30min；迅速将感受态细胞转入到42℃水浴，热激45s，之后快速转到冰上冷却5min；[0120](2)加入500μl恢复到室温的液体lb培养基，37℃，220rpm摇菌1h进行扩增；取50-100μl菌液按划线法涂布到含有20μg/ml氨苄霉素的固体lb平板上，37℃培养过夜；[0121](3)观察平板上菌落生长情况，挑取单个菌落，接种到10ml含20μg/ml氨苄霉素的液体lb培养基中，摇菌过夜；[0122](4)利用质粒小提中量试剂盒提取质粒，并进行dna测序鉴定质粒是否构建成功；[0123](5)对于鉴定正确的质粒，向其菌液加入20％的无菌甘油，混合均匀后-80℃冻存，留作甘油菌种；[0124]s104.il1rap-scfv-car重组载体的gmp的病毒包装质粒制备[0125](1)挑取少量鉴定正确质粒的甘油菌，到100ml含20μg/ml的氨苄霉素的液体lb培养基中，37℃摇菌，培养过夜；[0126](2)3000rpm室温离心10min，收集细菌沉淀，按照试剂盒说明书加入10mlp1溶液，充分吹打混匀细菌沉淀，再加入10ml裂解液p2；[0127](3)室温静置5min后，加入10ml中和液p4，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀后可见白色絮状沉淀生成；[0128](4)8000rpm离心10min，使白色絮状沉淀离至管底，收集上清到干净的离心管中；加入3ml红色去内毒素溶液er，颠倒混匀后溶液呈现出均匀透明的黄色；[0129](5)加入0.3倍体积的异丙醇使dna沉淀析出，颠倒混匀后，将溶液转移到dna吸附硅胶柱上；8000rpm离心2min，弃去滤液，质粒被吸附到硅胶柱上；分别用蛋白洗脱液和盐洗脱液洗柱两次，最后用无菌超纯水洗脱，即得到质粒的水溶液；[0130](6)用nanodrop 2000检测质粒溶液的浓度和纯度，选择合适浓度外送包装病毒。[0131]s2.制备car-nk细胞并建立car-n细胞的慢病毒感染体系(如图1所示)[0132]day1：种细胞，选择合适的细胞密度进行种板(注意:如果细胞维持在某种选择压力下，种板时需要去除用于筛选的抗生素，直至维持到第3天)；[0133]day2：病毒转导，选用moi＝10进行病毒转导，并将lentiboost-p以1：100的标准浓度添加到总体积(培养基+病毒)；具体步骤①4℃复苏慢病毒；②在细胞中直接加入计算好的lentiboost-p体积量，轻轻混匀；③按下表计算所需慢病毒颗粒用量，并加入细胞培养基中，轻轻混匀；④spinoculate(可选)：室温800g离心培养板90min(注意:spinoculation步骤被文献支持发现可对大多数细胞增加转导效率；必须使用细胞培养板进行离心，以减少剪切力)；⑤正常培养条件过夜培养细胞；[0134]day3：更换培养基，移除含有病毒颗粒的培养基上清，更换成合适体积的正常培养基；[0135]day4：维持培养，如果细胞汇合度较高，可在第四天稀释分板培养，后续按照常规流程进行培养基更换和细胞传代；[0136]day5：筛选稳定细胞系(可选)：①去除细胞中的培养基；②加入含有一定浓度筛选抗生素的培养基；③每3天补充含il-2和5mmol/l的尼克酰胺的新鲜培养基，并采集细胞数量监测nk细胞活性，继续培养14天。使用细胞计数仪统计总活细胞数，用总活细胞数乘以流式细胞术测定的cd3-cd56+细胞百分比，计算nk细胞绝对计数。通过将培养结束时产生的nk细胞数除以培养开始时的nk细胞数来评估增殖倍数；得到il1rap-car重组载体如图4所示。[0137]通过上述制备方法得到的具有靶向清除表达il1rap的cml-lsc作用的car-nk细胞，所述car-nk细胞为il1rap-car细胞，所述il1rap-car细胞的核酸序列如seq id no:1所示，蛋白序列如seq id no:2示。[0138]实施例2：靶向il1rap的cml-lsc的car-nk细胞的稳定杀伤作用探究[0139]1.流式细胞术检测car-nk细胞生物活性能力检测(gzmb、cd107a facs检测)[0140]激活的nk细胞可以将储存在细胞内部的gzmb释放到细胞间隙中，是nk细胞杀伤肿瘤细胞的重要手段之一；同样，经过肿瘤细胞或者其他靶细胞的刺激，nk细胞也会释放胞浆内的细胞毒性颗粒；此时，溶酶体相关膜蛋白-1(cd107a)就会被转运到细胞膜表面，可直接反映nk细胞的活化水平以及细胞毒性水平；我们通过测定效应细胞分泌gzmb水平的变化和cd107a的转运水平，进一步探究效应细胞杀伤肿瘤的机制；[0141]针对于gzmb和cd107a的测定，选择在效应细胞与肿瘤细胞以效靶比为1:1共孵育的基础上设置3h以及6h两个时间点，分别测定nk92细胞以及il1rap-car-nk92细胞在两个时间段gzmb和cd107a水平的变化，其检测结果如图2所示。[0142]2.体外生物活性实验(cytotoxicity ldhassay)[0143]cytotoxicity ldhassay是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(ldh)活性进而测定细胞损害的实验；ldh是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，ldh会释放到培养基中；由于释放出的ldh稳定，检测培养基中ldh的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。靶细胞以1×105/ml/孔，并与扩增后的nk细胞以不同的效应靶比(e:t)在u型底-96孔板中孵育4小时，3个重复；设立自然释放组为阴性对照组，添加np-40的最大释放组为阳性对照组，同样设立3个重复；利用多功能酶标仪在549nm波长下测定患者car-nk细胞的细胞杀伤毒性。[0144]3.体外肿瘤杀伤试验(ifn-γ、tnf-αassay)[0145]γ干扰素是参与抗肿瘤反应十分重要的细胞因子，具有抗病毒、免疫调节以及抗肿瘤等功能，在识别和消除肿瘤细胞中起着核心作用。肿瘤坏死因子α(tnf-α)是由多种类型细胞产生的多效性细胞因子，参与广泛的病理过程；tnf-α在体内、体外均具有杀伤肿瘤细胞和抑制细胞增殖的作用；分泌tnf-α是nk细胞发挥细胞毒性作用的方式之一；针对于ifn-γ和tnf-α的测定，我们选择在效应细胞与肿瘤细胞以效靶比为1:1的基础上共孵育3h后进行测定nk92细胞和il1rap-car-nk92细胞ifn-γ和tnf-α水平的变化，其实验结果如图5所示，通过图5可以看出，il1rap-car-nk92明显优于nk92细胞；图(i、h)为nk92细胞、il1rap-car-nk92细胞分别与k562细胞共培养3h、6h后颗粒酶gzmb和cd107a的分泌表达情况，随着作用时间的延长，杀伤效果明显升高，结果具有显著性差异。[0146]通过上述实施例的验证可以看出：本发明所述的car-nk细胞具有靶向性清除il1rap(白介素-1受体辅助蛋白)的cml-lsc(慢性粒细胞白血病)的作用，即car-nk细胞可以应用于过继性细胞免疫疗法中，对cml白血病的微小残留病变进行清除，致使患者达到停药乃至临床治愈的目的。[0147]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。









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