一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法及应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于农业加工副产物综合利用技术领域，涉及一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法及应用。背景技术：2.韭菜籽是韭菜(allium tuberosum rottl.)干燥成熟的种子，性温、味微甜，具有温补肝肾、壮阳固精等功效。韭菜籽中包含核苷酸类、生物碱类、不饱和脂肪酸、多糖和多肽等多种有效化学成分。其中，多糖作为主要的有效成分之一，具有改善免疫功能、抗氧化、调节生殖系统、抗疲劳等药理作用。目前对于药食两用的韭菜籽研究主要集中在韭菜籽油的提取和成分分析等方面，而对韭菜籽油提取后的副产品‑‑韭籽粕的进一步开发利用及研究等方面在国内外鲜有报道。韭菜籽中含有丰富的蛋白质和膳食纤维等成分，并且我国韭菜种质资源丰富，因此对韭菜籽粕开展进一步的综合利用极为重要。3.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种。枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。4.黑曲霉(aspergillus nige)是曲霉属真菌中较为常见的一种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等。5.关于生物活性多肽的获取方法，目前主要采用的有酶解法、化学提取法、生物合成法以及微生物发酵方法等。根据制备多肽的原料不同以及多肽目的产品的不同，采用不同的方法制备生物活性多肽，所得多肽的产量以及纯度也有所不同。cn104996715b提出了一种复合发酵法制备小麦胚芽多肽的工艺，采用超声波辅助二步酶解和混菌发酵相结合的生产工艺，提高了小麦胚芽多肽的提取率及水解度，混菌包括酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉。上述专利指出了酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉复配提取小麦胚芽多肽的功能，但由于小麦胚芽与葱属植物种子经预压榨或直接浸出法榨取油脂后的物质的成分不同，无法通过该方法从韭籽粕中得到韭籽多肽。6.目前主要采用酸法和缓冲液浸提法或单一菌剂提取的方法制备韭籽多肽。复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法未见报道。因此，提供一种能高效提取韭籽多肽的方法，实现韭菜籽粕的综合利用，为工业化生产以及植物种子副产物资源有效利用提供参考。技术实现要素：7.本发明的目的在于实现韭籽粕这类菜籽油提取后副产品的综合利用，解决单一发酵菌剂提取多肽效率低下的问题。8.基于上述目的，本技术通过提供一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法及应用来解决该领域中的这种需要。9.一方面，本发明涉及一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法，其包括：每7～11g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至5～7，接种3～7ml枯草芽孢杆菌菌液和3～7ml黑曲霉菌液，混匀后28～32℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至3～5，继续发酵24～60h，离心纯化得到所述韭籽多肽。10.进一步地，本发明提供的复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法中，所述枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法包括：每10ml浓度为107个/ml的枯草芽孢杆菌孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液，配合接种到90ml的液体培养基中，30℃200r/min震荡培养36h。11.进一步地，本发明提供的复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法中，包括：每8～10g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至5.5～6.5，接种4～6ml枯草芽孢杆菌菌液和4～6ml黑曲霉菌液，混匀后30℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至3.5～4.5，继续发酵36～50h，离心纯化得到所述韭籽多肽。12.优选地，本发明提供的复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法中，包括：每9.6g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至6，接种5.5ml枯草芽孢杆菌菌液和4.5ml黑曲霉菌液，混匀后30℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至4，继续发酵48h，离心纯化得到所述韭籽多肽。13.本发明对离心发酵产物纯化韭籽多肽的方法不做特别限定，示例性地，所述离心纯化得到所述韭籽多肽包括：将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。14.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：15.本发明提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法，其实现了对韭籽粕中韭籽多肽的高效提取，且相较于单一发酵菌剂，该方法提取韭籽多肽的效果更佳。附图说明16.图1为不同提取方法所得韭籽多肽含量图。17.图2为不同提取方法所得韭籽多肽提取率变化图。具体实施方式18.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。19.未经特别说明时，下述实施例所用韭籽粕为韭菜籽经直接浸出提取油脂并除去溶剂后得到的物料，其油脂含量小于1％。下述实施例所用枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌10160，所用黑曲霉为黑曲霉4097，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。其他试剂均为分析纯，购置于国药集团。20.实施例121.本实施例提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法的应用试验。22.枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法包括：每10ml浓度为107个/ml的枯草芽孢杆菌孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液，配合接种到90ml的液体培养基中，30℃200r/min震荡培养36h。23.取7g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至5，接种3ml枯草芽孢杆菌菌液和3ml黑曲霉菌液，混匀后28℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至3，继续发酵24h。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。24.实施例225.本实施例提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法的应用试验。26.枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法同实施例1。27.取8g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至5.5，接种4ml枯草芽孢杆菌菌液和4ml黑曲霉菌液，混匀后30℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至3.5，继续发酵36h。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。28.实施例329.本实施例提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法的应用试验。30.枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法同实施例1。31.取10g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至6.5，接种6ml枯草芽孢杆菌菌液和6ml黑曲霉菌液，混匀后30℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至4.5，继续发酵50h。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。32.实施例433.本实施例提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法的应用试验。34.枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法同实施例1。35.取11g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至7，接种7ml枯草芽孢杆菌菌液和7ml黑曲霉菌液，混匀后32℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至5，继续发酵60h。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。36.实施例537.本实施例提供了一种复合菌种发酵制备韭籽多肽的方法的应用试验。38.枯草芽孢杆菌菌液或黑曲霉菌液的制备方法同实施例1。39.取9.6g韭籽粕加入100ml蒸馏水，ph调至6，接种5.5ml枯草芽孢杆菌菌液和4.5ml黑曲霉菌液，混匀后30℃200r/min震荡发酵24h后，将ph调至4，继续发酵48h。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。40.实施例641.本实施例提供了参考孙婕等([1]孙婕,尹国友,qi wang,等.黑曲霉液态发酵韭籽粕提取韭籽多肽工艺[j].食品工业科技,2017,38(5):7.)所述方法利用黑曲霉单一菌剂制备得到韭籽多肽的对比试验。[0042]黑曲霉菌液的制备方法同实施例1。[0043]按照9.4％(m/v)的比例称量预处理后的韭籽粕于锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，ph调至3.0。121℃条件下灭菌30min，灭菌结束后冷却至30℃以下，然后按照8％(v/v)比例加入黑曲霉菌液，混匀后30℃，200r/min振荡培养3d结束发酵。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。[0044]实施例7[0045]本实施例综合参考孙婕等(孙婕,尹国友,qiwang,等.黑曲霉液态发酵韭籽粕提取韭籽多肽工艺[j].食品工业科技,2017,38(5):7.)所述方法和尹乐斌等(尹乐斌,李乐乐,何平,等.枯草芽孢杆菌发酵豆渣制备多肽及其活性研究[j].中国酿造,2022,41(1):5.)所述方法提供了利用枯草芽孢杆菌单一菌剂制备得到韭籽多肽的对比试验。[0046]枯草芽孢杆菌菌液的制备方法同实施例1。[0047]按照9.6％(m/v)的比例称量预处理后的韭籽粕于锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，ph调至7.2。121℃条件下灭菌30min，灭菌结束后冷却至30℃以下，然后按照3％(v/v)比例加入枯草芽孢杆菌菌液，混匀后37℃，200r/min振荡培养60h结束发酵。将发酵产物4000r/min离心10min，得到韭籽多肽粗提液，向韭籽多肽粗提液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，静置8h。然后在6000rmin条件下离心15min，装入透析袋，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，得到所述韭籽多肽。[0048]实施例8[0049]本实施例提供了实施例1～7所得韭籽多肽的得率和纯度的对比试验。[0050](1)标准曲线的制备[0051]分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 20μg/ml的标准甘氨酸溶液于试管中，用蒸馏水补足到1ml。分别加入0.2mol/lph5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液1ml；再加入0.2％茚三酮显色液1ml，充分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，冷却，放置5min后，加入60％乙醇3ml，充分摇匀，甘氨酸浓度为0的溶液为对照，在570nm下测定od值。以甘氨酸的浓度(μg/ml)为横坐标，od值为纵坐标绘制标准曲线。通过茚三酮显色反应实验，确定甘氨酸浓度和吸光值之间的线性关系，即：y＝0.0674x-0.0317，r2＝0.995。[0052](2)样本多肽的测定[0053]准确称取2g干燥的样品，加40ml蒸馏水，磁力搅拌30min，取8ml上清液于4000r/min离心10min，取4ml离心后上清液加入4ml 10％的三氯乙酸溶液，混匀静置10min，继续以4000r/min离心10min，将离心后上清液全部转移到25ml容量瓶中，用5％的三氯乙酸定容。根据茚三酮法测定发酵液中多肽含量。多肽含量(mg/g)按照以下公式计算：[0054][0055](3)提取率测定结果[0056]取实施例1～7所得韭籽多肽产物，经上述方法重复3次试验得到样本多肽，测定其多肽含量和提取率。提取率(％)按照以下公式计算：[0057][0058]如图1所示，应用实施例5所述方法所得韭籽多肽产物中多肽含量最高，为726.59mg/g，应用本发明所述方法(实施例1～5)所得韭籽多肽产物中多肽含量显著高于各单一菌剂(实施6～7)所得韭籽多肽产物中多肽含量。如图2所示，应用实施例5所述方法所得韭籽多肽提取率最高，为90.75％，应用本发明所述方法(实施例1～5)的韭籽多肽提取率显著高于各单一菌剂(实施6～7)的韭籽多肽提取率。[0059]如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!