一种蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法。背景技术：2.蜱传脑炎(tick-borne encephalitis，tbe)又称森林脑炎，是由蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，tbev)引起的以神经系统病变为主的自然疫源性疾病，可在人与动物中引起致死性脑炎并伴有长期的后遗症，严重威胁人类健康。随着全球气候变化，蜱的数量和活动范围不断扩大，蜱传疾病流行和传播成为重要的公共卫生问题。作为重要的蜱传病原体之一，针对蜱传脑炎病毒的疫苗研究从未停止，研制安全性更高、免疫效果更好的新型基因工程疫苗是本领域研究的热点和主要方向。3.蜱传脑炎病毒为黄病毒科黄病毒属的单股正链rna病毒，长约11kb，包含一个开放阅读框。单个开放阅读框编码三个结构蛋白(c、prm和e)和七个非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。黄病毒是平均直径为40-60nm的包膜病毒，成熟病毒粒子表面由90个e和m蛋白的二聚体组成。双层脂质包膜包裹着核衣壳(由c蛋白构成)，衣壳内包裹着单股正链rna基因组。黄病毒c蛋白既可与病毒基因组一起形成核衣壳，还可与脂质体相互作用，参与胞膜重塑，但不诱导机体产生中和抗体；c蛋白的跨膜结构域可作为prm蛋白的附加锚点和信号序列。prm蛋白被宿主弗林蛋白酶切割，产生pr片段和m蛋白。m蛋白通过两个跨膜结构域固定在脂质包膜上，在成熟颗粒中与e蛋白的跨膜结构域相互作用。e蛋白为包膜蛋白，包含中和抗体表位，在免疫预防中发挥重要作用。技术实现要素：4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法。5.第一方面，本发明提供一种蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗，所述蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗的免疫原性成分为蜱传脑炎病毒prm蛋白；所述蜱传脑炎病毒prm-e蛋白包括如seq id no.1所示的氨基酸序列。6.进一步地，所述蜱传脑炎病毒prm-e蛋白由seq id no.2所示的核苷酸序列编码得到。7.本发明采用蜱传脑炎病毒prm-e蛋白作为病毒样颗粒疫苗的免疫原性成分，在不含病毒遗传物质的情况下，具有较高的安全性，同时还能够具备较高的免疫原性，可以引起机体内有效的免疫应答。8.昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达外源蛋白时，需要信号肽的辅助。本发明在研究过程中发现，使用杆状病毒信号肽时，无法成功构建重组质粒，因此只能选择黄病毒本身的信号肽，即黄病毒c蛋白的跨膜结构域。有研究表明tbev同属的jev信号肽更有利于黄病毒蛋白的表达与分泌，本研究分别使用jev和tbev信号肽构建重组蛋白，发现使用tbev信号肽时，重组杆状病毒感染悬浮细胞后得到的m-e蛋白量更多。因此使用tbev c蛋白的跨膜结构域作为信号肽，也就本发明提供的seq id no.1前16位氨基酸序列。9.进一步地，还包括佐剂；所述佐剂包括montanide isa 201vg佐剂、poly(i:c)、montanide gel 02pr、montanide ims 1313vg nst、polysaccharide、alum、freund或prodavx中的一种或多种。10.进一步地，所述佐剂为poly(i:c)和montanide isa201vg复合佐剂，所述免疫原性成分和所述佐剂的体积比为(5～9)：(11～15)。11.进一步地，在所述poly(i:c)和montanide isa 201vg复合佐剂中，poly(i:c)和montanide isa 201vg佐剂的体积比为(1～3)：(9～13)。12.第二方面，本发明提供所述蜱传脑炎病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括：13.将如seq id no.2所示的核苷酸序列构建至表达载体上后，通过表达系统进行表达，后经纯化得到蜱传脑炎病毒样颗粒疫苗。14.进一步地，所述表达载体为pfbd载体；15.所述表达系统为昆虫细胞-杆状病毒表达系统、哺乳动物表达系统、原核表达系统或酵母表达系统中的一种或多种。16.进一步地，所述纯化包括：17.将所述昆虫细胞-杆状病毒表达系统的表达产物在0～4℃的条件下处理25～35分钟；18.在0～4℃、14000～16000g/min的条件下离心10～20min；19.取上清液通过酒石酸钾-甘油进行密度梯度离心。20.第三方面，本发明提供一种核酸，所述核酸包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。21.本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。22.本发明具备如下有益效果：23.本发明采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统对蜱传脑炎病毒特定的结构蛋白prm-e蛋白进行表达和纯化得到一种蜱传脑炎病毒样颗粒。本发明提供的蜱传脑炎病毒样颗粒具有较高的免疫原性，可以诱导小鼠产生特异性免疫应答，显著提高小鼠脾脏b细胞、t细胞、记忆性t细胞的数量和活化水平，同时还能提高th1和th2型细胞因子的水平，在蜱传脑炎的防治领域具有重要意义。附图说明24.图1为本发明实施例1提供的重组质粒pfbd-prm-e-prm-e示意图。25.图2为本发明实施例1提供的tbev prm-e基因的pcr扩增结果；其中，a：tbev prm-e(ph)基因pcr扩增结果；b：tbev prm-e(p10)基因pcr扩增结果。26.图3为本发明实施例1提供的重组质粒pfbd-prm-e-prm-e的鉴定；其中，a：pfbd-prm-e双酶切鉴定结果；b：pfbd-prm-e-prm-e双酶切鉴定结果。27.图4为本发明实施例1提供的重组杆粒rbacmid-prm-e-prm-e的pcr结果；其中，m：marker；1：rbacmid-prm-e-prm-e ph端鉴定结果；2：rbacmid-prm-e-prm-e p10端鉴定结果28.图5为本发明实施例1提供的感染重组杆状病毒后sf9细胞的形态变化示意图；其中，a：重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e感染的sf9细胞；b：正常的sf9细胞。29.图6为本发明实施例1提供的重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e的鉴定结果示意图；其中，a-a：正常的sf9细胞的间接免疫荧光鉴定结果；a-b：重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e感染的sf9细胞的间接免疫荧光鉴定结果；b:western blot鉴定结果(1：rbv-prm-e-prm-e的细胞悬液；2：rbv-prm-e-prm-e培养上清；3：rbv-prm-e-prm-e细胞沉淀悬液)。30.图7为本发明实施例2提供的tbev vlps鉴定结果示意图；其中，a：western blot鉴定结果(1：正常的sf9细胞；2：纯化前；3：纯化后)；b-a：电镜观察结果；b-b：免疫电镜观察结果。31.图8为本发明实施例3提供的小鼠血清tbev igg抗体的检测结果示意图。32.图9为本发明实施例3提供的首免后腹股沟淋巴结中免疫细胞的流式细胞术分析结果示意图；其中，a-a：小鼠淋巴结cd11c+cd80+双阳性细胞比例；a-b：小鼠淋巴结cd11c+mhcⅰ+双阳性细胞比例；a-c：小鼠淋巴结cd11c+mhcⅱ+双阳性细胞比例；b-a：小鼠淋巴结cd19+cd40+双阳性细胞比例；b-b：小鼠淋巴结cd19+cd69+双阳性细胞比例。33.图10为本发明实施例3提供的脾细胞ifn-γ与il-4的elispot检测结果；其中，a：脾细胞ifn-γ的elispot检测结果；b：脾细胞il-4的elispot检测结果。34.图11为本发明实施例3提供的脾细胞增殖试验结果。35.图12为本发明实施例3提供的细胞因子检测结果；其中，a：th1型细胞因子；b：th2型细胞因子。36.图13为本发明实施例3提供的三次免疫后小鼠脾细胞的流式细胞术分析结果示意图；其中，a：小鼠脾脏cd19+cd69+双阳性细胞比例；b：小鼠脾脏cd4+cd69+双阳性细胞比例；c-a：小鼠脾脏cd4+/cd44+cd62l+双阳性细胞比例；c-b：小鼠脾脏cd8+/cd44+cd62l+双阳性细胞比例。具体实施方式37.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e的构建与鉴定1、引物设计与合成38.参考tbev远东亚型毒株wh2012(genbank：kj755186)prm-e基因，设计特异性引物(引物序列如表1所示)。昆虫细胞-杆状病毒表达载体pfastbac dual具有ph和p10两个启动子，可以构建含有两个目的基因片段的载体，因此设计两对扩增引物(tbev-prm-e-phf+tbev-prm-e-phr、tbev-prm-e-p10f+tbev-prm-e-p10r)和两对鉴定引物(phf+m13r、m13+p10r)。39.表1引物序列信息[0040][0041][0042]注：加下划线为限制性核酸内切酶识别位点。[0043]2、重组质粒pfbd-prm-e-prm-e的构建与鉴定[0044](1)目的基因tbev prm-e(ph)的扩增[0045]以含有目的基因tbev prm-e的质粒为模板，用tbev-prm-e-phf和tbev-prm-e-phr引物(表1)扩增tbev prm-e(ph)基因，反应条件如表2所示。经1％琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段。[0046]扩增结果表明，产物与目的片段大小一致(图2中的a)，表明tbev prm-e(ph)基因成功扩增。[0047]表2 pcr反应条件[0048][0049](2)重组质粒pfbd-prm-e的鉴定[0050]回收的tbev prm-e(ph)基因和pfastbac dual载体经notⅰ和hindiii双酶切后，连接并转化stellar感受态细胞，涂布于氨苄抗性的固体lb平板上，37℃倒置培养12h后，挑取单克隆菌株至氨苄抗性的液体lb中震荡培养12h，提取质粒用notⅰ和hindiii进行双酶切鉴定(图3中的a)，鉴定正确的质粒进行序列测定分析，结果显示其序列与合成的tbev prm-e基因序列同源性为100％，含tbevprm-e基因的重组质粒构建成功，将该质粒命名为pfbd-prm-e。[0051](3)目的基因tbev prm-e(p10)的扩增[0052]以重组质粒pfbd-prm-e为模板，以tbev-prm-e-p10f和tbev-prm-e-p10r为引物扩增tbev prm-e(p10)。经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增产物与目的基因片段大小相符(图2中的b)，成功扩增了tbev prm-e(p10)基因。[0053](4)重组质粒pfbd-prm-e-prm-e的鉴定[0054]回收的tbev prm-e(p10)基因和重组质粒pfbd-prm-e经smaⅰ和nheⅰ双酶切后，连接并转化stellar感受态细胞，挑取单克隆菌株，提取质粒后用smaⅰ和nheⅰ进行双酶切鉴定(图3中的b)，酶切产物与与tbev prm-e基因大小一致，成功构建了含tbev prm-e双拷贝基因的重组质粒，将其命名为pfbd-prm-e-prm-e。[0055]3、重组杆粒rbacmid-prm-e-prm-e的制备与鉴定[0056]将重组质粒pfbd-prm-e-prm-e转化到dh10bac感受态细胞中，并涂布于含有四环素(10μg/ml)、硫酸卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、iptg和x-gal的三抗性固体lb平板上，37℃倒置培养40h。挑取白斑，37℃200rpm震荡培养16h，提取杆粒进行pcr鉴定。以杆粒为模板，以phf和m13r为上、下游引物可鉴定ph启动子处mcs；以m13f和p10r为上、下游引物可鉴定p10启动子处mcs。[0057]结果显示，扩增产物与目的片段大小相符(图4)，说明重组杆粒rbacmid-prm-e-prm-e制备成功。[0058]表3 pcr反应条件[0059][0060][0061]4、重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e的拯救[0062]将sf9细胞接种至六孔板中，27℃培养12h，待细胞长至80％以上，更换为双无grace’s培养基，分别使用双无grace’s培养基稀释阳性重组杆粒rbacmid-e-linker-pa3(4μg)与cellfectinⅱreagent(8μl)，轻轻混匀，静置20min后均匀加入6孔板中，27℃静置培养5h，换液为grace’s完全培养基。27℃静置培养5天，每天在显微镜下观察细胞状态，与正常贴壁sf9细胞相比，重组杆粒rbacmid-prm-e-prm-e转染后的贴壁sf9细胞出现膨大变圆、大量脱落等明显的细胞病变现象(如图5所示)。待60％细胞出现病变时，收取上清为第一代重组杆状病毒，命名为rbv-prm-e-prm-e，继续盲传3代。[0063]5、重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e的鉴定[0064](1)间接免疫荧光鉴定[0065]取生长状态良好的sf9细胞均匀铺入六孔板，待细胞长至70％，接种重组杆状病毒，每孔10μl，27℃培养48h后弃掉培养基。用70％乙醇溶液固定30min，1：100稀释抗tbev e-diii鼠血清(1％bsa稀释)作为一抗，37℃孵育1h，1：200稀释fitc-标记的山羊抗鼠igg作为二抗，避光37℃孵育1h，每步操作结束均使用pbs清洗3次。在荧光显微镜下观察细胞。结果显示，与正常细胞对照相比，感染重组杆状病毒的贴壁sf9细胞在荧光显微镜下呈明显的绿色荧光(图6中a-a和a-b)，表明重组杆状病毒感染细胞后可成功表达tbev prm-e蛋白。[0066](2)western blot鉴定[0067]取重组杆状病毒感染悬浮培养的sf9细胞，27℃，120rpm培养96h后，低速离心收集感染的细胞悬液、培养上清和细胞沉淀，制备上样样品，以1：300稀释的抗tbev e-diii鼠血清为一抗，1：20000稀释的hrp标记的山羊抗鼠igg为二抗，进行western blot鉴定。结果显示：在74和54kd处均出现特异性目的蛋白条带(图6中的b)，且培养上清中几乎检测不到特异性蛋白。[0068]根据软件editseq预测：tbev prm-e蛋白大小约为74kd，tbevm-e蛋白大小约为54kd，成熟的tbev颗粒表面主要由m蛋白和e蛋白构成。综上，表明重组杆状病毒感染细胞后成功表达tbev prm-e蛋白，表达形式以胞内表达为主。[0069]实施例2tbev vlps的制备及鉴定[0070]1、tbev vlps的纯化[0071]取重组杆状病毒rbv-prm-e-prm-e按1％的比例感染悬浮sf9细胞，27℃120rpm培养4d，收获细胞培养物，3000g/min离心15min去除细胞碎片，收获沉淀用pbs洗一遍，沉淀加原液1/5比例的细胞裂解液(使用前加1％pmsf)，用振荡器重悬沉淀，冰浴20min后，震荡15s，冰浴10min，4℃15000g/min离心15min，取上清。使用超速离心机，通过酒石酸钾-甘油密度梯度离心纯化tbev病毒样颗粒，用bca法测病毒样颗粒的浓度，分装，置于-80℃保存备用。[0072]2、western blot鉴定[0073]取制备的不同纯度的tbev vlps制备蛋白样品，以1:300稀释的抗tbev e-diii鼠血清为一抗，1:20000稀释的hrp标记的山羊抗鼠igg为二抗，进行western blot鉴定。结果显示，在54kd处出现特异性蛋白条带(图7中的a)，表明成功纯化出tbev vlps。[0074]3、透射电镜检测[0075]将纯化的tbev vlps蛋白液稀释2倍，取20μl滴加在铜网上，染色后吸取多余的液体，在透射电镜下观察，鉴定tbev vlps的形态和大小。结果发现，蛋白液中有大量球形、表面有囊膜、40-60nm左右的病毒样粒子(图7中的b-a)，与黄病毒形态结构相似。[0076]4、免疫电镜检测[0077]两倍稀释tbev vlps，取封口膜，放入样品30μl，将铜网正面朝下放在液滴上，将封口膜贴在轻幅摇床上，室温孵育15-20min。用吸水纸吸净液体，待铜网晾干后，30μl pbs洗3次，5min/次。使用30μl 3％脱脂奶粉室温封闭1h。用pbs将抗tbev e-diii鼠血清50倍稀释作为一抗，室温孵育1h。30μl pbs洗3次，5min/次。用pbs将抗鼠igg抗体20倍稀释作为二抗，室温孵育1h。30μl pbs洗3次，5min/次。将铜网染色后，在电镜下观察(图7中的b-b)，发现金颗粒附着在病毒样粒子表面，说明本发明成功获得了纯化的tbev vlps。[0078]实施例3tbev vlps免疫效果评价[0079]1、小鼠免疫[0080]为评价tbev vlps免疫效果，将27只16-18g健康的雌性balb/c小鼠随机分为3组，实验组小鼠以纯化的tbev vlps作为抗原辅以poly(i:c)&montanide isa 201vg复合佐剂。按抗原：poly(i:c)：montanide isa 201vg＝35：10：55的比例，先将抗原与poly(i:c)混合后，与montanide isa 201vg(31℃预热)一起乳化，在涡旋振荡器上震荡10min，待乳化完全后，21℃静置1h后备用。每只小鼠肌肉注射100μl免疫原，分组方案如下：[0081]表4 balb/c小鼠免疫及分组方案[0082][0083]2、鼠血清tbev igg抗体的检测[0084]以pbs组小鼠血清作为阴性对照，用tbev抗体间接elisa检测方法，检测tbev vlps免疫后第3(首免后2周)、4(二免后1周)、7(三免后1周)、10、12、18周小鼠血清igg抗体水平。步骤如下：[0085]以终浓度1μg/ml的原核表达纯化的重组蛋白tbev e-diii作为包被抗原，4℃包被过夜。以5％脱脂奶粉作为封闭液；从1：100开始2倍倍比稀释待检小鼠血清作为一抗；以1：40000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠igg抗体作为二抗。tmb显色3min后用0.5m h2so4终止显色。于酶标仪450nm波长处读取各孔od值，将待检血清od450/阴性血清od450≥2.1时的最高血清稀释度作为elisa抗体效价。[0086]结果如图8所示：二免后1周小鼠血清中可检测到tbev特异性igg抗体(均值为1:10)；三免后小鼠血清igg抗体水平显著提高，最高可达1:105.5(均值为1:104.6)；小鼠血清tbev igg抗体水平在第18周开始缓慢下降，在三免后3个月仍能保持在1:104.3。[0087]3、小鼠腹股沟淋巴结中免疫细胞的流式细胞术分析[0088]首次免疫后第1周，随机选取tbev vlps、adjuvant和pbs组小鼠各3只，分别取小鼠腹股沟淋巴结制备淋巴细胞悬液，细胞染色，在流式细胞仪上检测荧光信号。[0089](1)小鼠淋巴结dc细胞的活化[0090]小鼠腹股沟淋巴结细胞经cd80+、mhcⅰ+、mhcⅱ+和cd11c+荧光抗体染色后，检测cd11c+cd80+、cd11c+mhcⅰ+和cd11c+mhcⅱ+双阳性细胞比例。[0091]结果显示：免疫组小鼠cd11c+cd80+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，图9中的a-a)；免疫组小鼠cd11c+mhcⅰ+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，图9中的a-b)；免疫组小鼠cd11c+mhcⅱ+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，图9中的a-c)。综上可以说明，小鼠首次免疫tbev vlps后促进了dc细胞的活化。[0092](2)小鼠淋巴结b细胞的募集和活化[0093]小鼠腹股沟淋巴结细胞，经cd19+、cd40+和cd69+荧光抗体染色后，检测cd19+cd40+和cd19+cd69+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠cd19+cd40+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组(p＜0.05)(图9中的b-a)；免疫组小鼠cd19+cd69+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组(p＜0.01)和adjuvant对照组(p＜0.05)(图9中的b-b)。综上可以说明，小鼠首次免疫tbev vlps后淋巴结中b细胞的募集和/或活化增强。[0094]4、脾细胞活化分析[0095]分离小鼠脾细胞，根据实验需要调整脾细胞浓度至2.5×106个/ml，备用。[0096](1)elispot检测[0097]根据鼠ifn-γ和il-4elispot检测试剂盒说明书进行检测，步骤如下：每孔加入5×105个脾细胞，同时加入终浓度为10μg/ml的tbeve-diii作为刺激物，用锡箔纸包好elispot板，37℃、5％co2细胞培养箱中培养38h，用1:1000稀释的生物素标记的检测抗体(bvd6-24g2-biotin)作为一抗；1:1000稀释的streptavidin-hrp作为二抗，室温孵育后加入tmb显色液，避光显色至出现清晰斑点，自来水冲洗elispot板终止显色。避光自然风干elispot板，利用aid酶联斑点图像自动分析仪进行全自动斑点图像采集和计数，保存每孔斑点形成细胞(spot-forming cells，sfcs)数及斑点图像。[0098]取刺激物存在时免疫组和对照组的细胞斑点数作图，结果显示，经tbev特异性抗原刺激后，免疫组小鼠脾细胞中分泌ifn-γ细胞斑点数显著高于adjuvant对照组(p＜0.05，图10中的a)，分泌il-4的细胞斑点数显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.0001，图10中的b)。ifn-γ和il-4分别为th1型细胞免疫和th2型体液免疫的代表性细胞因子，tbev vlps免疫小鼠后可诱导机体分泌th1型和th2型细胞因子，且主要以th2型细胞因子为主。[0099](2)脾淋巴细胞增殖试验[0100]取分离的脾淋巴细胞，以2.5×105个/孔接种于96孔细胞培养板中，用重组蛋白tbev e-diii对脾淋巴细胞进行刺激(终浓度为10μg/ml)，在37℃，5％co2细胞培养箱培养44h，用cck-8方法检测脾淋巴细胞在体外的增殖能力。每孔加入10μl的cck-8溶液，继续在细胞培养箱培养4h，在酶标仪上检测od450数值。[0101]结果显示，免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，图11)。综上，tbev vlps三免后，在特异性抗原作用下小鼠脾淋巴细胞可出现显著性增殖。[0102](3)细胞因子检测[0103]取分离的脾淋巴细胞，以5×105个/孔接种于u型96孔板中，用重组蛋白tbev e-diii对脾淋巴细胞进行刺激(终浓度为10μg/ml)。在37℃，5％co2的细胞培养箱培养48h。4℃避光2500rpm离心10min，取50μl上清置于干冰中保存，送到上海优宁维公司，利用msd检测技术，检测在tbev特异性刺激物作用下脾细胞中th1和th2型细胞因子：ifn-γ、il-12p70、tnf-α、il-2、kc/gro、il-4、il-5、il-6、il-10、il-1β的分泌情况。[0104]结果显示，脾细胞经tbev特异性刺激物刺激后，免疫组小鼠脾细胞培养液中th2型细胞因子il-5和il-6显著高于adjuvant对照组(p＜0.05，图12)。[0105](4)脾淋巴细胞检测[0106]收集上一步骤离心后的脾淋巴细胞，加入荧光抗体预混液，使用流式细胞仪检测淋巴细胞荧光信号。[0107]i)小鼠脾脏b细胞的募集和活化[0108]小鼠脾细胞经cd19+、cd40+和cd69+荧光抗体染色，检测cd19+cd69+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠cd19+cd69+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组(p＜0.05，图13中的a)。综上可以说明，tbev vlps三免后，tbev vlps三免后，脾脏b细胞在特异性抗原刺激下发生募集和活化。[0109]ii)小鼠脾脏t细胞的募集和/或活化[0110]小鼠脾细胞经cd4+和cd69+荧光抗体染色，检测cd4+cd69+和cd8+cd69+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠cd4+cd69+双阳性细胞比例显著高于adjuvant对照组(p＜0.05，图13中的b)；综上，tbev vlps三免后，在特异性抗原刺激下脾脏cd4+t淋巴细胞募集和活化增强。[0111]3)小鼠脾脏记忆性t细胞的产生[0112]小鼠脾细胞经cd4+、cd8+、cd44+和cd62l+荧光抗体染色，检测cd4+和cd8+阳性细胞中cd44+cd62l+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠cd4+/cd44+cd62l+双阳性细胞比例显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，如图13中的c-a)；免疫组小鼠cd8+/cd44+cd62l+细胞比例显著高于pbs对照组和adjuvant对照组(p＜0.01，图13中的c-b)。综上，tbev vlps三免后小鼠脾脏内产生了cd4+和cd8+中心记忆性t细胞。[0113]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。









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