小蓟总黄酮、制备方法及其在制备预防或治疗高尿酸血症药物中的应用

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小蓟总黄酮、制备方法及其在制备预防或治疗高尿酸血症药物中的应用。背景技术：2.高尿酸血症(hyperuricemia，hua)是指机体嘌呤代谢紊乱，尿酸(uric acid，ua)分泌过多或肾脏排泄功能障碍，使尿酸在血液中积聚的状态，诊断标准为非同日两次空腹血尿酸水平男性尿酸水平≥420umol/l，女性≥360umol/l即可确诊，血尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度可在关节局部形成单钠尿酸盐(monosodium urate，msu)结晶并沉积，导致痛风。高尿酸血症具有全身危害性，是冠心病、高血压、糖尿病和慢性肾脏病等的独立危险因素，且其患病率逐年增高。根据美国国家健康与营养调查(nhanes)，高尿酸血症的患病率从1988-1994年的19.0％上升到2007-2008年的21.5％，并在最近的十年保持稳定；在2009-2010年度，我国成年人中高尿酸血症的患病率为8.4％，而2019年上升到17.4％。高尿酸血症的发病与性别、年龄、遗传、环境因素有关，吸烟、饮酒、肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常均是高尿酸血症的重要危险因素。3.在高尿酸血症的治疗中，西医疗法主要通过服用降尿酸药物(如别嘌醇、苯溴马隆)，但长期服用降尿酸药物存在严重不良反应，如肝肾损害，且停药后尿酸水平极易反弹，长期疗效不理想。因此，有必要开发一种无副作用或副作用较小的高尿酸血症治疗药物。技术实现要素：4.针对现有高尿酸血症治疗药物存在的肝肾损害的问题，本发明旨在提供一种小蓟总黄酮、制备方法及其在制备预防或治疗高尿酸血症药物中的应用，本发明提供的小蓟总黄酮对高尿酸血症具有良好的治疗效果好，还具有改善肾功能的效果。5.基于上述目的，本技术采用的技术方案如下：6.第一方面，本发明提供一种小蓟总黄酮的制备方法，包括如下步骤：7.s1：将小蓟进行脱脂处理备用；8.s2：将脱脂后的小蓟经醇提制得小蓟醇提物；9.s3：将小蓟醇提物分散于水中形成分散液，将分散液经大孔树脂吸附、洗脱、纯化、干燥制得小蓟总黄酮。10.优选地，步骤s1将小蓟进行脱脂处理的步骤如下：11.将小蓟干燥后粉碎成小蓟粉末，向小蓟粉末中加入乙醚回流提取，对小蓟粉末进行脱脂处理，脱脂处理后的小蓟粉末挥干乙醚备用。12.优选地，步骤s2将脱脂后的小蓟经醇提制得小蓟醇提物的步骤如下：13.向脱脂处理后的小蓟粉末中加入其8-12倍重量、质量浓度为60％-80％的乙醇，浸泡0.5-1h后再回流提取1-2h，收集醇提液，将醇提液浓缩去除乙醇，制得小蓟醇提物。14.优选地，步骤s3的方法如下：15.将小蓟醇提物分散于水中制得分散液，将分散液上大孔树脂，先用1-2倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去水洗液；继用3-4倍柱体积、质量浓度为10％-30％的乙醇洗脱，弃去乙醇洗脱液；再用5-6倍柱体积、质量浓度为70％-80％的乙醇洗脱，收集该乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，得到小蓟总黄酮。16.第二方面，本发明提供一种由上述方法制得的小蓟总黄酮。17.第三方面，本发明提供小蓟总黄酮在制备预防或治疗高尿酸血症药物中的应用。18.经试验发现，小蓟总黄酮能够改善由氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠以及uox基因敲除的自发性高尿酸大鼠的尿酸代谢及肾功能，不仅能够降低高尿酸小鼠血液中尿酸水平，还能够抑制因高尿酸诱导的肾功能指标如血清肌酐、尿素氮和胱抑制素c的升高，相对于现有降尿酸药物如别嘌醇，本发明小蓟总黄酮不仅具有降低血清尿酸水平，还具有改善肾功能的效果。19.第四方面，本发明提供小蓟总黄酮在制备治疗与高尿酸血症相关的痛风、尿酸性肾结石、痛风石或尿酸性肾病的药物中的应用。20.第五方面，本发明提供一种用于预防或治疗高尿酸血症的药物，该药物包括上述小蓟总黄酮及其药学上可接受的盐或辅料。21.第六方面，本发明提供小蓟总黄酮在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。22.第七方面，本发明提供一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，该抑制剂包括上述小蓟总黄酮。23.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：24.相对于现有降尿酸药物别嘌醇，本发明小蓟总黄酮不仅能够降低高尿酸血症的尿酸水平，还能够抑制因高尿酸诱导的肾功能指标如血清肌酐、尿素氮和胱抑制素c的升高，具有改善肾功能的效果。附图说明25.图1为小蓟总黄酮对高尿酸小鼠的尿酸和肾功能的影响，其中，图1a为小蓟总黄酮降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠血清中尿酸水平结果；图1b为小蓟总黄酮降低高尿酸小鼠血清中黄嘌呤氧化酶活性的结果；图1c、图1d为小蓟总黄酮改善高尿酸小鼠的肾功能的结果；26.图2为各组大鼠体重及进食、摄水量结果，其中，图2a为各组大鼠的体重变化，图2b、图2c分别为各组大鼠干预第3周时的进食量和摄水量；27.图3为小蓟总黄酮对uox-/-大鼠的尿酸和肾功能的影响，其中图3a为小蓟总黄酮降低uox基因敲除的高尿酸大鼠血清尿酸水平结果；图3b、图3c、图3d分别为小蓟总黄酮改善高尿酸大鼠的肾功能指标血清肌酐、尿素氮和胱抑素c的水平(注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。具体实施方式28.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。29.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。30.氧嗪酸钾(毕得医药科技有限公司，中国)；别嘌醇(上海阿拉丁有限公司，中国)；羧甲基纤维素钠(上海阿拉丁有限公司，中国)；尿酸检测试剂盒(diua-250，博世生物技术有限公司，美国)；黄嘌呤氧化酶测试盒(a002-1-1，南京建成生物工程研究所，中国)；肌酐试剂盒(c011-2-1,南京建成生物工程研究所，中国)；尿素氮试剂盒(c013-2-1,南京建成生物工程研究所，中国)；cysc elisa检测试剂盒(江苏博深公司，中国)；全自动生化分析仪(beckman公司，美国)。31.实施例132.本实施例提供一种小蓟总黄酮的制备方法，具体如下：33.将中药小蓟于60℃干燥后粉碎处理，过40目筛，得到小蓟粉末；向小蓟粉末中先加入其8-12倍重量的乙醚回流提取1-2h，脱脂，弃去乙醚；待脱脂后的小蓟粉末中乙醚挥发干净后，向脱脂小蓟粉末中加入其8-12倍重量、质量浓度为60％-80％的乙醇浸泡0.5-1h，回流提取1-2h，过滤，收集醇提液；将醇提液减压回收乙醇至无醇味，制得小蓟醇提物；向小蓟醇提物中加入蒸馏水分散成相当于含生药0.3-0.5g/ml的分散液，利用ab-8大孔吸附树脂除杂纯化，按极性由大到小的顺序，先用1-2倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去水洗液；继用3-4倍柱体积、质量浓度为10％-30％的乙醇洗脱，弃去该乙醇洗脱液；再用5-6倍柱体积、质量浓度为70％-80％的乙醇洗脱，收集该乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，制得小蓟总黄酮。34.实施例235.本实施例分析小蓟总黄酮对氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠尿酸代谢的影响，具体试验方法及试验结果如下：36.1、试验设计37.将40只昆明鼠(20-25g)，随机分为对照组(ctr组，n＝10)、模型组(mod组，n＝10)、小蓟总黄酮组(cir组，n＝10)和别嘌醇组(alp，n＝10)，适应性饲养1周，饲养条件：饲养温度为21-25℃，相对湿度为60±10％，12h明暗交替照明，自由进食摄水。38.适应性饲养结束后，(1)药物预处理3天：cir组和alp组分别灌胃小蓟总黄酮混悬液(200mg/kg)、别嘌醇混悬液(20mg/kg)，连续给药3天，ctr组和mod组灌胃等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液(0.5％cmc-na)；(2)氧嗪酸钾诱导小鼠高尿酸模型：在小蓟总黄酮和别嘌醇灌胃1小时后，mod组、cir组和alp组小鼠腹腔注射氧嗪酸钾混悬液(po 300mg/kg)，ctr组腹腔注射等体积的0.5％cmc-na，连续干预7天。最后一次给药前8小时进行禁食不禁水，最后一次腹腔注射po 1h后去眼球取血。血液室温静置60min后，在4℃低温环境下，4000rpm离心10min，收集上清，-80℃保存。测定各组小鼠血清中尿酸、黄嘌呤氧化酶活性以及血清肌酐、血清尿素氮水平。39.2、试验结果40.各组小鼠的尿酸及肾功能情况如图1所示，其中，图1a为小蓟总黄酮降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠血清中尿酸水平结果，图1b为小蓟总黄酮降低高尿酸小鼠血清中黄嘌呤氧化酶活性的结果；与ctr组相比，mod组小鼠中尿酸水平、黄嘌呤氧化酶活性相对较高，表明本发明所述方法成功构建了高尿酸小鼠模型，与mod组比较，cir干预后可以降低小鼠的血清尿酸水平，抑制血清黄嘌呤氧化酶活性，两者均有统计学差异(p＜0.05)，cir降尿酸的效果与别嘌醇相近。41.图1c、图1d分别为小蓟总黄酮改善高尿酸小鼠的肾功能血清肌酐和尿素氮的水平结果，相对于mod组，cir干预后可以降低小鼠血清肌酐和尿素氮的水平，改善肾功能，且相对于别嘌醇组，由小蓟总黄酮处理具有更优的抑制由高尿酸诱导的小鼠血清肌酐和尿素氮升高的效果，即相对于别嘌醇组，小蓟总黄酮对高尿酸诱导的小鼠肾功能的改善效果更优。42.实施例343.本实施例分析小蓟总黄酮对uox基因敲除的自发性高尿酸大鼠尿酸代谢及肾功能的影响，具体试验方法及实验结果如下：44.1、试验设计45.本实验所使用的实验大鼠为使用crispr-cas9系统敲除uox基因的sd大鼠，购自南京生物医药研究院，将f1代尿酸酶基因敲除杂合子(uox-/+)大鼠反复交配以获得纯合子uox基因敲除高尿酸sd大鼠。将基因鉴定得到的30只6-7周龄高尿酸sd大鼠(uox-/-)随机分为高尿酸模型组(mod，n＝10)、小蓟总黄酮干预组(cir，n＝10)、别嘌醇干预组(alp，n＝10)，同窝所生的野生型sd大鼠作为空白对照组(ctr，n＝10)。cir组和alp组分别灌胃小蓟总黄酮混悬液(130mg/kg)、别嘌醇混悬液(20mg/kg)，ctr组和mod组灌胃等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液(0.5％cmc-na)，连续干预4周，最后一次给药前8小时进行禁食不禁水，最后一次给药1小时后，经腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉取血，室温静置60min后，在4℃低温环境下，4000rpm离心10min，收集上清，-80℃保存。利用全自动生化分析仪测定血清尿酸、血清肌酐和血清尿素氮水平，利用cysc elisa检测试剂盒检测血清胱抑素c的水平。46.2、实验结果47.(1)小蓟总黄酮对uox-/-大鼠的体重及进食摄水量的影响48.各组大鼠的体重变化、进食量、摄水量变化如图2所示，由图2a结果可知，四组大鼠体重无明显差异，组间比较差异均无统计学意义。各组大鼠的进食量和摄水量分别如图2b、2c所示，各组大鼠的进食量两两组间比较无明显差异，mod组大鼠的摄水量要显著高于ctr鼠，cir组和alp组大鼠摄水量稍低于mod组，但差异无统计学意义。以上结果表明cir对uox-/-大鼠的体重及进食摄水量影响较小。49.(2)小蓟总黄酮对uox-/-大鼠的尿酸和肾功能的影响50.干预后各组大鼠的尿酸及肾功能相关指标变化如图3所示，其中血尿酸水平如图3a所示，mod组的血尿酸水平显著高于ctr组(p＜0.05)；与mod组相比，cir组和alp组血清尿酸均显著降低(p＜0.05)，但alp组大鼠尿酸下降更明显(p＜0.05)；大鼠肾功能指标血清肌酐、尿素氮和胱抑素c检测结果分别如图3b、图3c、图3d所示，mod组的血清肌酐、尿素氮和胱抑素c均显著高于ctr组；小蓟总黄酮干预后，cir组血清肌酐、尿素氮和胱抑素c较mod组均有明显下降，差异均有统计学意义(p＜0.05)，而alp组上述指标则未表现出明显下降，表明小蓟总黄酮不仅具有降低uox-/-大鼠的尿酸水平，并且具有保护肾功能的疗效。51.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。









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