改性的肌酸酶的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术改性的肌酸酶1.本技术是基于申请日为2016年2月23日，优先权日为2015年2月27日，申请号为201680011877.8，发明名称为：“改性的肌酸酶”的专利申请的分案申请。技术领域2.本发明涉及具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽在改性硫醇基的试剂存在下保持活性并具有增强的热稳定性。本发明还涉及用于产生该突变多肽的方法；并且涉及包含该突变多肽的传感器用于测量生理流体样本中肌酸酐的用途。另外，本发明教导如何使用突变多肽提高肌酸酐传感器的寿命，以及制备传感器的方法。背景技术：3.生理流体样本诸如全血、血清、血浆或尿液中的肌酸酐水平是肾功能的一项重要指标。肌酸磷酸储存于脊椎动物的肌肉中并且提供能量储备。其不可逆地转化成肌酸酐(降解产物)和高能磷酸基团。在正常的肌功能期间，每天约1-2％的肌酸磷酸总量转化成肌酸酐。肌酸酐释放到血液中并通过肾排出。因此，在健康个体中，肌酸酐的水平相对恒定地为约35至约75μm。如果血液中的肌酸酐的水平增大，则其可能为某些肾功能障碍的病征。在此类情况中，肌酸酐水平可增大至高达2,000μm的水平。4.来源于受试者的生理流体样本中的肌酸酐水平可通过酶促方法，例如使用肌酸酐亚氨基水解酶(通过检测nh3)或肌酸酐酰胺水解酶测量。肌酸酐酰胺水解酶也被称为“肌酸酐酶”。就肌酸酐酶而言，生理流体中的肌酸酐水平可通过涉及肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)、肌酸脒基水解酶(ec3.5.3.3——“肌酸酶”)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的酶级联反应测定，如由以下反应表示：[0005][0006][0007][0008]该反应级联导致形成h2o2，其继而可通过电流测定法或光度测量法进行检测。在一些体系中，可使用另外的酶(例如过氧化物酶)或指示剂(例如发光团)。[0009]生理流体样本中的肌酸酐水平可使用适于测量肌酸酐的传感器测量，例如包含与肌酸酶和肌氨酸氧化酶组合的肌酸酐酶的传感器。此类传感器通常被称为生物传感器并且可采用电化学和/或光度学原理两者。[0010]中间产物肌酸也存在于这种血液、血清、血浆或尿液样本中。因此，如果通过以上酶级联反应测定肌酸酐，则优选地采用双传感器系统。使用双传感器系统，可将肌酸酐测定为两种物质总和与单独的中间产物之间的差值。因此，在用于测定样本中肌酸酐和肌酸的总浓度的第一传感器中，肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶均存在，以将肌酸酐和肌酸转化成h2o2。在用于测定样本中肌酸的浓度的第二传感器中，存在肌酸酶和肌氨酸氧化酶，以将肌酸转化成h2o2。样本中肌酸酐的浓度因而从样本中肌酸酐和肌酸的总浓度与样本中肌酸的浓度之间的差值来确定。[0011]设计用于分析连续的生理流体样本的生物传感器通常采用将样本递送至传感器或从传感器递送的流动通道；其中各个样本的递送通常在分析后续样本之前继之以冲洗步骤。冲洗步骤用于防止一个样本污染下一个样本，但是也可用于防止传感器和样本流动通道中的细菌生长和生物膜形成。冲洗(或防腐剂)溶液包含活性剂2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(也称为甲基异噻唑啉或mit)或其它异噻唑啉酮衍生的生物杀灭剂，可用于控制含水溶液中的微生物生长。[0012]防腐剂溶液中存在的异噻唑啉酮或mit为硫醇灭活剂，其与细菌和真菌中的各种蛋白质/酶相互作用，导致细胞生长被抑制；不可逆的细胞损伤和细胞死亡。使用异噻唑啉酮或mit试剂的缺点在于，通过使一种或多种含硫醇基的酶在生物传感器中反应和灭活，其可限制生物传感器的有效寿命。肌酸酶为含硫醇的水解酶，其活性可被硫醇灭活剂(诸如异噻唑啉酮衍生的试剂，包括mit)抑制，这限制了这些防腐剂在用于测量生理流体样本中的肌酸酐的传感器中的使用。[0013]因此，需要存在一种这样的肌酸酶：更耐受硫醇灭活剂；使得含此类试剂的冲洗溶液能够在用于测量肌酸酐的传感器中使用。此外，需要一种对硫醇灭活剂的耐受性增强且同时具有热稳定特性的肌酸酶。这是因为通常使用安装于分析仪中的生物传感器并将其在37℃下保存，因此重要的是生物传感器的组分在环境温度范围内(例如至少高至37℃)很稳定。[0014]根据jph10174585(a)，属于产碱菌(alcaligenes)的细菌通常表现出优异的热稳定性。jph10174585(a)还公开了使用蛋白质工程技术产生编码突变肌酸脒基水解酶的突变产碱菌基因，该突变肌酸脒基水解酶在如45℃的温度下具有改善的长期稳定性。突变酶的特征在于相比于野生型肌酸脒基水解酶，第15位的谷氨酸、以及第104位和第135位的精氨酸之中的一个、或两个或更多个组合的替换位置；其中野生型序列在ab016788中有所阐述。[0015]据报道产碱菌菌株ks-85基因(genbank:baa88830.1)编码热稳定性肌酸酶(ec 3.5.3.3)。[0016]jph07255485(a)描述了由黄杆菌(flavobacterium)u-188肌酸酶基因变异的突变获得的突变肌酸酶；由此氨基酸序列第166、第277和第328位中的至少一者被疏水性氨基酸如异亮氨酸替换。突变肌酸酶在55℃保存时保持1个小时的活性。技术实现要素：[0017]本发明提供一种更耐受硫醇试剂诸如mit或其它异噻唑啉酮衍生的试剂的突变肌酸酶。包含突变肌酸酶的传感器与防腐剂诸如neolone 950的使用是相容的，当其与“标准”(且有效)浓度的neolone 950结合使用时具有更长的使用寿命。[0018]根据第一实施方案，本发明提供一种具有肌酸脒基水解酶活性的分离的突变多肽，该突变多肽在高于25℃的温度下在硫醇试剂诸如mit或其它异噻唑啉酮衍生的试剂存在下保持酶活性，其中所述多肽为：[0019]a.包含与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；其中第175位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换并且第299位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换，或者[0020]b.具有选自以下项的氨基酸序列的多肽：seq id no 3(对应于产碱菌属(alcaligenes sp.)肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 7(对应于人苍白杆菌(ochrobactrum anthropic)肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5，具有替换：c171a+c295a)；seq id no 11(对应于中慢生根瘤菌属(mesorhizobium sp.)lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3，具有替换：s175a+c299a)；seq id no 15(对应于玫瑰变色菌属(roseovarius sp)tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 19(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 23(对应于脱氮副球菌(aracoccusdenitrificans)肌酸酶——uniprot：a1b0t5，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 27(对应于rubellimicrobiummesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0，具有替换：c175a+c299a)；seq id no.31(对应于福尔山洛克氏菌(loktanella vestfoldensis)ska53肌酸酶——uniprot：a3v128，具有替换：c298a)；seq id no.35(对应于lutibaculumbaratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5，具有替换：c180a+c304a)；seq id no.39(对应于玫瑰杆菌属(roseobacter sp.)azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7，具有替换：c299a)；seq id no.43(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(dinoroseobacter shibae)肌酸酶——uniprot：a8lqj5，具有替换：c304a)；seq id no.47(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6，具有替换：c150a+c274a)。[0021]根据另一个实施方案，所述分离的突变多肽包含：[0022]a.与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸并且与seq id no:2中第268位半胱氨酸对应的氨基酸残基选自亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸；或者[0023]b.选自以下项的氨基酸序列：seq id no 4(对应于产碱菌属肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 8(对应于人苍白杆菌肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5，具有替换：c171a+c295a+c264l)；seq id no 12(对应于中慢生根瘤菌属lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3，具有替换：s175a+c299a+c268l)；seq id no 16(对应于玫瑰变色菌属tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 20(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 24(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b0t5，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 28(对应于rubellimicrobium mesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no.32(对应于福尔山洛克氏菌ska53肌酸酶——uniprot：a3v128，具有替换：c298a+c267l)；seq id no.36(对应于lutibaculum baratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5，具有替换：c180a+c304a+c273l)；seq id no.40(对应于玫瑰杆菌属azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7，具有替换：c299a+c268l)；seq id no.44(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌肌酸酶——uniprot：a8lqj5，具有替换：c304a+c273l)；seq id no.48(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6，具有替换：c150a+c274a+c243l)。[0024]根据第二实施方案，本发明提供一种包含编码突变肌酸脒基水解酶多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。[0025]根据另一个实施方案，本发明提供一种包含编码突变肌酸脒基水解酶多肽的多核苷酸的核酸构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导突变多肽在表达宿主中产生的控制序列。[0026]根据另一个实施方案，本发明提供一种包含编码突变肌酸脒基水解酶多肽的核酸构建体的经基因修饰的宿主细胞，其中所述细胞优选地选自细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。[0027]根据第三实施方案，本发明提供一种用于产生突变肌酸脒基水解酶多肽的方法，所述方法包括以下步骤：[0028]a.提供重组宿主细胞，其中所述细胞包含dna分子，dna分子包含编码突变肌酸脒基水解酶多肽的核酸序列，[0029]b.在适于表达突变肌酸脒基水解酶多肽的条件下孵育宿主细胞，并且回收宿主细胞表达的突变多肽。[0030]根据第四实施方案，本发明提供一种包含突变肌酸脒基水解酶多肽的组合物，其中所述组合物被配制成干粉、片剂或液体；并且所述组合物任选地还包含肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)、或者肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)两者。[0031]根据第五实施方案，本发明公开了突变肌酸脒基水解酶多肽或包含突变肌酸脒基水解酶多肽的组合物与包含硫醇灭活剂的冲洗溶液在传感器中联合测定肌酸酐和/或肌酸的用途。[0032]根据第六实施方案，本发明提供一种用于测定样本流体中的肌酸酐和/或肌酸的传感器，其包括至少一个具有表面的电极，并且在至少一个电极表面上固定有多种酶，并且其中所述酶中的至少一种是在高于25℃，例如高于30、32、34、35、37或40℃的温度下在硫醇试剂诸如mit或其它异噻唑啉酮衍生的试剂存在下保持酶活性的肌酸脒基水解酶多肽。[0033]根据另一个实施方案，本发明提供一种制备用于测定样本流体中的肌酸酐或肌酸的传感器的方法，所述方法包括使包含多种酶的含水混合物沉积到电极表面的步骤；其中所述酶中的至少一种是突变肌酸脒基水解酶多肽。[0034]根据第七实施方案，本发明提供一种用于测定来源于受试者的生理流体样本中的肌酸酐和/或肌酸的方法，所述方法包括以下步骤：[0035]a)使传感器或双传感器与样本接触；[0036]b)检测样本中的肌酸和/或肌酸酐；[0037]以及冲洗步骤，包括：[0038]c)使传感器与包含硫醇灭活剂的冲洗溶液接触，其中冲洗步骤(c)在步骤(a)之前、步骤(b)之后，或者在步骤(a)之前且在步骤(b)之后；其中所述方法在高于25℃的温度下进行；并且其中所述传感器包含在高于25℃，例如在30、32、34、35、或37℃或以上的温度下在硫醇试剂诸如mit或其它异噻唑啉酮衍生的试剂存在下保持酶活性的肌酸脒基水解酶多肽。[0039]本发明包括以下实施方案：[0040]1.一种具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽选自：[0041]a.包含与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；其中第175位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换并且第299位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换，以及[0042]b.具有选自以下项的氨基酸序列的多肽：seq id no 3(对应于产碱菌属(alcaligenes sp.)肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 7(对应于人苍白杆菌(ochrobactrum anthropic)肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5，具有替换：c171a+c295a)；seq id no 11(对应于中慢生根瘤菌属(mesorhizobium sp.)lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3，具有替换：s175a+c299a)；seq id no 15(对应于玫瑰变色菌属(roseovarius sp)tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 19(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 23(对应于脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)肌酸酶——uniprot：a1b0t5，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 27(对应于rubellimicrobium mesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0，具有替换：c175a+c299a)；seq id no.31(对应于福尔山洛克氏菌(loktanella vestfoldensis)ska53肌酸酶——uniprot：a3v128，具有替换：c298a)；seq id no.35(对应于lutibaculum baratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5，具有替换：c180a+c304a)；seq id no.39(对应于玫瑰杆菌属(roseobacter sp.)azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7，具有替换：c299a)；seq id no.43(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(dinoroseobacter shibae)肌酸酶——uniprot：a8lqj5，具有替换：c304a)；seq id no.47(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6，具有替换：c150a+c274a)。[0043]2.根据实施方案1所述的具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽包含：[0044]a.与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸并且与seq id no:2中第268位半胱氨酸对应的氨基酸残基选自亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸；或者[0045]b.选自以下项的氨基酸序列：seq id no 4(对应于产碱菌属肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 8(对应于人苍白杆菌肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5，具有替换：c171a+c295a+c264l)；seq id no 12(对应于中慢生根瘤菌属lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3，具有替换：s175a+c299a+c268l)；seq id no 16(对应于玫瑰变色菌属tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 20(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 24(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b0t5，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 28(对应于rubellimicrobium mesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no.32(对应于福尔山洛克氏菌ska53肌酸酶——uniprot：a3v128，具有替换：c298a+c267l)；seq id no.36(对应于lutibaculum baratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5，具有替换：c180a+c304a+c273l)；seq id no.40(对应于玫瑰杆菌属azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7，具有替换：c299a+c268l)；seq id no.44(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌肌酸酶——uniprot：a8lqj5，具有替换：c304a+c273l)；seq id no.48(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6，具有替换：c150a+c274a+c243l)。[0046]3.一种分离的多核苷酸，其包含编码实施方案1或2所述的突变多肽的核苷酸序列。[0047]4.一种包含实施方案3所述的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述突变多肽在表达宿主中产生的控制序列。[0048]5.一种经基因修饰的宿主细胞，其包含编码实施方案1或2所述的突变多肽的核酸构建体，其中所述细胞优选地选自细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。[0049]6.一种用于产生实施方案1或2所述的突变多肽的方法，所述方法包括以下步骤：[0050]a.提供重组宿主细胞，其中所述细胞包含dna分子，所述dna分子包含编码根据实施方案1或2所述的突变多肽的核酸序列，[0051]b.在适于表达所述突变多肽的条件下孵育所述宿主细胞，以及[0052]c.回收步骤b)中所述宿主细胞表达的突变多肽。[0053]7.一种包含根据实施方案1或2所述的突变多肽的组合物，其中所述组合物被配制成干粉、片剂或液体。[0054]8.根据实施方案7所述的组合物，其还包含：[0055]a.肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)；或者[0056]b.肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)。[0057]9.根据实施方案1或2所述的突变多肽或根据实施方案7-8所述的组合物与包含硫醇灭活剂的冲洗溶液在传感器中联合测定肌酸酐和/或肌酸的用途。[0058]10.一种用于测定样本流体中的肌酸酐和/或肌酸的传感器，其包括至少一个具有表面的电极，并且在所述至少一个电极表面上固定有多种酶，并且其中所述酶中的至少一种是根据实施方案1或2所述的突变多肽。[0059]11.根据实施方案10所述的用于测定肌酸酐和/或肌酸的传感器，其中所述传感器选自：[0060]a.包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸传感器；[0061]b.包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸酐传感器；以及[0062]c.包括所述肌酸传感器(a)和所述肌酸酐传感器(b)两者的双传感器。[0063]12.一种制备用于测定样本流体中的肌酸酐和/或肌酸的传感器的方法，所述方法包括使包含多种酶的含水混合物沉积到电极表面的步骤；其中所述酶中的至少一种是根据实施方案1或2所述的突变多肽。[0064]13.一种用于测定来源于受试者的生理流体样本中的肌酸酐和/或肌酸的方法，所述方法包括以下步骤：[0065]a.使传感器或双传感器与所述样本接触；[0066]b.检测所述样本中的肌酸和/或肌酸酐；[0067]以及冲洗步骤，包括：[0068]c.使所述传感器与包含硫醇灭活剂的冲洗溶液接触，其中所述冲洗步骤(c)在步骤(a)之前、步骤(b)之后，或者在步骤(a)之前且在步骤(b)之后；其中所述方法在高于25℃的温度下进行；并且[0069]其中所述传感器包括具有表面的电极，并且在所述电极表面上固定有多种酶，并且其中所述酶中的至少一种是根据实施方案1或2所述的突变多肽。[0070]14.根据实施方案13所述的用于测定肌酸酐和/或肌酸的方法，其中所述传感器选自：[0071]a.包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸传感器；[0072]b.包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸酐传感器；以及[0073]c.包括所述肌酸传感器(a)和所述肌酸酐传感器(b)两者的双传感器。附图说明[0074]图1：示出包含电极和膜的常规酶传感器。[0075]图2：示出图1传感器的膜。[0076]图3：示出示例性平坦的、厚膜传感器构造。[0077]定义[0078]分离的多肽：如本文所用，术语“分离的多肽”是指至少20％纯度、优选至少40％纯度、更优选至少60％纯度、甚至更优选至少80％纯度、最优选至少90％纯度，并且甚至最优选至少95％纯度的多肽，如由sds-page所测。[0079]肌酸脒基水解酶活性：术语肌酸脒基水解酶活性(或“肌酸酶”活性)被定义为催化肌酸水解产生肌氨酸和脲的水解酶活性(具有ec号：ec 3.5.3.3)。肌酸酶活性如下测量：将肌酸酶与肌酸和肌氨酸氧化酶在磷酸盐缓冲液中温育，并且通过辣根过氧化物酶、4-羟基苯磺酸盐和4-氨基安替吡啉连续检测形成的h2o2。由氧化的4-羟基苯磺酸盐随后与4-氨基安替吡啉反应而形成的有色产物形成之后，490nm处的吸光度增大。[0080]灵敏度降低：就本发明的传感器而言，当传感器在37℃温度下暴露于包含0.11g mit/l的冲洗溶液时，在高达几周的特定时间段之后，检测肌酸酐或肌酸的灵敏度损失。[0081]热稳定性：在25℃以上，例如在30、32、34、35或37℃或以上，优选地在35或37℃或以上的温度下保持酶活性的肌酸酶据说在本发明的上下文中表现出热稳定性。具体实施方式[0082]当采用包含防腐剂mit(例如防腐剂neolone 950，包含9％mit)的冲洗溶液时，观察到用于测量肌酸酐的包含肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)、肌酸脒基水解酶(ec 3.5.3.3——“肌酸酶”)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的传感器的寿命在特定时间段或特定测量次数之后大大缩短。在高温例如37℃下特别观察到mit使肌酸酶的灭活，造成传感器系统寿命缩短。[0083]用于防止传感器流动通道中的细菌生长和生物膜形成的neolone 950的推荐浓度为约1.25g neolone 950/l(对应于0.11g mit/l)冲洗溶液。neolone 950对肌酸酶的灭活被发现是传感器寿命较短的原因；据信是由于neolone 950中的硫醇试剂mit与肌酸酶中的硫醇基之间发生的相互作用。[0084][0085]虽然可通过使neolone 950的量降低至0.3g/l冲洗溶液而将传感器的寿命延长至2周；但该浓度的防腐剂不足以防止传感器中的细菌生长和生物膜形成。[0086]虽然据报道分离自产碱菌属ks-85的天然肌酸酶(ec 3.5.3.3)是热稳定性的(uniprot q9rhu9)，但是当该酶在高温下保存于包含0.11g mit/l的冲洗溶液中时变得不稳定，如实施例1所示。[0087]i.在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下热稳定的突变肌酸酶(ec3.5.3.3)[0088]构建编码宽泛范围的突变肌酸酶(来源于野生型肌酸酶(uniprot q9rhu9)或其同源物)的合成基因并重组性地表达，从而鉴定出当保存于高温时在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下相比于其野生型亲本酶更稳定的突变体。这些研究显示出具有该种特性的组合(即，在高温下和异噻唑啉酮衍生的试剂中的稳定性)的突变肌酸酶的特征在于，在对应于uniprot q9rhu9中第175和299位氨基酸残基的位置处存在特定氨基酸(参见实施例1)。还示出具有该种期望的特性的组合的突变肌酸酶可如下来源于天然酶：首先选择与产碱菌属ks-85肌酸酶结构上相关的天然肌酸酶，然后替换一个或多个氨基酸残基，由此使得所表达的多肽在对应于uniprot q9rhu9中第175和299位氨基酸残基的位置处具有所需的特定氨基酸。[0089]因此，本发明提供具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽具有相比于其野生型亲本酶更耐受硫醇试剂诸如mit或其它异噻唑啉酮衍生的试剂；以及表现出热稳定性的特性。热稳定性被理解为突变多肽在高达约40℃，更通常高达约37℃的温度下温育3天或更多天，例如10、14、21、30、36天以上或50天以上，优选地36天或以上之后，在液体环境中保留至少50％(更优选至少55、60、65、70、75、80、85或90％)酶活性的能力。观察到本发明的突变肌酸酶在相比于野生型亲本酶时，在25℃以上，例如在30、32、34、35或37℃或以上，优选地在35或37℃或以上的温度下保持更大的酶活性。[0090]根据一个实施方案，突变多肽可来源于产碱菌属的天然肌酸酶(q9rhu9_uniprot)，其中所述天然酶具有seq id no:2，或者可来源于由编码q9rhu9的天然基因(登录号：ab016788.1)的同源物(即直向同源物或横向同源物)的基因所编码的天然肌酸酶。各自由编码q9rhu9的天然基因(登录号：ab016788.1；seq id no 1)的同源物(即直向同源物或横向同源物)的基因所编码的天然肌酸酶(ec 3.5.3.3)共享高度的氨基酸序列同一性，并因此其序列可使用适当的程序(例如，clustal 0(1-2-1))相对于彼此进行比对以显示其序列同一性，并且将对应的残基定位于其相应氨基酸序列中。本发明的突变多肽具有与seq id no:3有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸(参见表1)。突变多肽与seq id no:3的优选的氨基酸序列同一性百分比为至少80％，诸如至少82％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、以及至少99.5％。优选地，多肽中一个或多个氨基酸的替换、插入、添加或缺失的数目被限制，即相比于具有seq id no.:3的对应突变多肽有不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个替换，和/或不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个插入，和/或不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个添加，和/或不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个缺失。如本文所用，术语“序列同一性”指示基本相等长度的两个氨基酸序列之间或基本上相等长度的两个核酸序列之间同一性程度的定量测量。待比较的两个序列必须通过插入缺口或另选地在蛋白质或核酸序列末端截断来将它们比对至尽可能最佳的配合。序列同一性可计算为((nref-ndif)100)/(nref)，其中ndif是比对时两个序列中不相同的残基的总数，并且其中nref是序列之一的残基数目。因此，dna序列agtcagtc将与序列aatcaatc具有75％的序列同一性(ndif＝2并且nref＝8)。缺口计算为特定残基的不同一性，即核酸序列agtgtc将与核酸序列agtcagtc具有75％的序列同一性(ndif＝2并且nref＝8)。同样地，多肽序列alaglythrcysalaglythrcys将与序列alaalathrcysalaalathrcys具有75％的序列同一性(ndif＝2并且nref＝8)。缺口计算为特定残基的不同一性，即多肽序列alaglythrglythrcys将与多肽序列alaglythrcysalaglythrcys具有75％的序列同一性(ndif＝2并且nref＝8)。序列同一性可另选地通过blast程序，例如blastp程序(pearson w.r和d.j.lipman(1988))(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast)来计算。在本发明的一个实施方案中，利用序列比对方法clustalw以默认参数进行比对，该方法描述于thompson j.等人1994，从http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/可获取该方法。[0091]根据另一个实施方案，突变多肽具有与seq id no:3有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸(参见表1)；其中所述多肽包含选自以下项的氨基酸序列：seq id no 3(对应于产碱菌属肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 7(对应于人苍白杆菌肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5(seq id no 6)，具有替换：c171a+c295a)；seq id no 11(对应于中慢生根瘤菌属lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3(seq id no 10)，具有替换：s175a+c299a)；seq id no 15(对应于玫瑰变色菌属tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8(seq id no14)，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 19(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4(seq id no 18)，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 23(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b0t5(seq id no 22)，具有替换：c175a+c299a)；seq id no 27(对应于rubellimicrobium mesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0(seq id no 26)，具有替换：c175a+c299a)；seq id no.31(对应于福尔山洛克氏菌ska53肌酸酶——uniprot：a3v128(seq id no 30)，具有替换：c298a)；seq id no.35(对应于lutibaculum baratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5(seq id no 34)，具有替换：c180a+c304a)；seq id no.39(对应于玫瑰杆菌属azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7(seq id no 38)，具有替换：c299a)；seq id no.43(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌肌酸酶——uniprot：a8lqj5(seq id no 42)，具有替换：c304a)；seq id no.47(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6(seq id no 46)，具有替换：c150a+c274a)。[0092]根据另一个实施方案，突变多肽具有与seq id no:3有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸并且与seq id no:2中第268位半胱氨酸对应的氨基酸残基选自亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸，优选亮氨酸(参见表1)。[0093]根据另一个实施方案，突变多肽具有与seq id no:3有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸，并且与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸并且与seq id no:2中第268位半胱氨酸对应的氨基酸残基是亮氨酸(参见表1)；其中所述多肽包含选自以下项的氨基酸序列：seq id no 4(对应于产碱菌属肌酸脒基水解酶——uniprot：q9rhu9(seq id no 2)，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 8(对应于人苍白杆菌肌酸酶——uniprot：a0a076wgb5(seq id no 6)，具有替换：c171a+c295a+c264l)；seq id no 12(对应于中慢生根瘤菌属lnhc221b00肌酸酶——uniprot：x6dlm3(seq id no 10)，具有替换：s175a+c299a+c268l)；seq id no 16(对应于玫瑰变色菌属tm1035肌酸酶——uniprot：a6dvf8(seq id no 14)，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 20(对应于玫瑰变色菌属217肌酸酶——uniprot：a3w1e4(seq id no 18)，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 24(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b0t5(seq id no 22)，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no 28(对应于rubellimicrobiummesophilum肌酸酶——uniprot：a0a017hrv0(seq id no 26)，具有替换：c175a+c299a+c268l)；seq id no.32(对应于福尔山洛克氏菌ska53肌酸酶——uniprot：a3v128(seq id no 30)，具有替换：c298a+c267l)；seq id no.36(对应于lutibaculum baratangense amv1肌酸酶——uniprot：v4rge5(seq id no 34)，具有替换：c180a+c304a+c273l)；seq id no.40(对应于玫瑰杆菌属azwk-3b肌酸酶——uniprot：a6fqq7(seq id no 38)，具有替换：c299a+c268l)；seq id no.44(对应于恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌肌酸酶——uniprot：a8lqj5(seq id no 42)，具有替换：c304a+c273l)；seq id no.48(对应于脱氮副球菌肌酸酶——uniprot：a1b7i6(seq id no 46)，具有替换：c150a+c274a+c243l)。[0094]根据另一个实施方案，突变多肽具有与seq id no:2有至少80％同一性的氨基酸序列；其中与seq id no:2中第175位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸；与seq id no:2中第299位半胱氨酸对应的氨基酸残基是丙氨酸；并且对应于seq id no 2中第202位的氨基酸残基是丙氨酸，并且对应于seq id no 2中第312位的氨基酸残基是谷氨酸；并且任选地与seq id no:2中第268位半胱氨酸对应的氨基酸残基选自亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸(参见表1)。[0095]表1：本发明肌酸酶的比对[0096][0097]1.5.3.1)；或者另选地包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的组合物；其中所述肌酸酶在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下是热稳定性的；并且其中肌酸酶的氨基酸序列如上文第i部分所定义。组合物可被配制成干粉、片剂或液体。[0106]iv.适于测定包含本发明的突变肌酸酶(ec 3.5.3.3)的生理流体样本中的肌酸酐和/或肌酸的传感器[0107]本发明还提供包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸传感器；或者包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸酐传感器；或者包括肌酸和肌酸酐传感器两者的双传感器，其中所述肌酸酶在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下是热稳定性的；并且其中肌酸酶的氨基酸序列如上文第i部分所定义。[0108]用于测定样本流体中的肌酸酐或肌酸的传感器包括具有表面的电极，其中在电极表面上固定有用于测定肌酸酐或肌酸的多种酶，其特征在于所述酶中的一种是如上文第i部分所定义的肌酸脒基水解酶。[0109]v. 包含本发明的突变肌酸酶(ec 3.5.3.3)的常规传感器[0110]在一个实施方案中，包含突变肌酸酶的传感器是常规传感器，适于测量生理流体样本中的肌酸酐。常规传感器包括由肌酸和肌酸酐传感器组成的双传感器系统，建立为传统的电流测量传感器。图1示出这样的传感器1：其适于安装在用于测量生物样本中的分析物的浓度的设备(例如，abltm837血液气体分析仪(radiometer medical aps,copenhagen,denmark))中。[0111]基本上，传感器1包括膜环3连接于其上的电极2。电极2包括与铂丝5连接的铂阳极4，该铂丝通过微栓塞6与银阳极接触体7连接。铂阳极4和铂丝5的下部密封于玻璃坯体8中。在玻璃坯体8与微栓塞6之间，铂丝5用热收缩管保护。管状银参比电极10环绕玻璃坯体8的上部并在电极2的长度上延伸到阳极接触体7，该阳极接触体通过固定主体11和环氧树脂12紧固到参比电极内部。玻璃坯体8的下部被膜环3连接到其上的电极基体13环绕。[0112]参比电极10的上部被插塞部分14环绕，以将电极2安装到分析设备的对应塞中(未示出)并且固定套膜15。垫圈16和17布置在电极2和套膜15之间，从而确保位于电极2的测量表面的任何电解质不蒸发。安装于套膜15的一端的膜环3包括环20。膜21在环20的下开口上伸展。该膜21在图2中详细示出。[0113]图2示出包括五个层的膜21的细节：面向电极2的铂阳极4的减噪隔层22，干扰限制膜层23，环绕酶层25的垫圈24，以及扩散限制多孔膜层26，该扩散限制多孔膜层涂布有含水量为约80％的聚氨酯亲水性保护层。经涂布的膜层26面向待分析的样本。[0114]减噪隔层22可为约21±2μm的轨道边(track-edged)的甲酸乙二醇酯(petp)膜。干扰限制膜层23可为约6±2μm的乙酸纤维素(ca)多孔膜。[0115]垫圈24可为30±5μm的双面粘着盘，具有1500μm直径的中心孔。垫圈24的粘合剂粘着于干扰限制层23和扩散限制层26，以至防止酶在层之间泄漏的程度。[0116]肌酸传感器的酶层25通常为约20μm的与合适的添加剂如缓冲液混合的交联至戊二醛(由kikkoman.co.jp供应)的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的层。肌酸酐传感器的酶层25通常为约20μm的与合适的添加剂如缓冲液混合的交联至戊二醛的肌酸酐酶(由kikkoman.co.jp供应)、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的层。[0117]扩散限制多孔膜层26可为约12μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯(petp)层(孔直径约0.1μm；孔密度约3·107个孔/cm2)，其已被含水量为约80％的聚氨酯涂布。[0118]在肌酸酐传感器中，肌酸和肌酸酐两者经酶促方法转化为过氧化氢。在肌酸传感器中，仅肌酸经酶促方法转化为过氧化氢。[0119]在电流式电极中，过氧化氢针对ag/agcl被阳极氧化为+675mv。所得的电流与样本中的肌酸酐/肌酸浓度成比例。肌酸酐的浓度从肌酸酐传感器信号(检测肌酸+肌酸酐)与肌酸传感器信号(检测肌酸)之间的差值来确定。[0120]vi.包含本发明的突变肌酸酶(ec 3.5.3.3)的厚膜传感器[0121]在一个实施方案中，包含突变肌酸酶的传感器是厚膜传感器，适于测量生理流体样本中的肌酸酐。厚膜传感器由包括肌酸和肌酸酐传感器的双传感器系统组成，如图3所示的那样建立。[0122]参见图3，200μm厚度的氧化铝衬底110在一个表面设有1000μm直径和10μm厚度的圆形铂工作电极120，3000μm外径、2000μm内径和10μm厚度的环形铂反电极130(覆盖工作电极外周边30-3300的角度范围)，以及50μm直径的圆形银/氯化银参比电极140(定位于工作电极外周边0°处)。所有这三种电极结构经由通过穿越衬底的孔(未示出)而穿入的铂跨越氧化铝衬底110而连接至传感器电子器件(未示出)。在操作时，工作电极120相对于参比电极140极化至+675mv。[0123]此外，氧化铝衬底110为玻璃和聚合物包封材料的两层结构。这些两层结构包括围绕工作电极120的1800μm外径、1200μm内径和50μm厚度的环形结构160、161，以及围绕完整电极系统的50μm厚度的结构150、151。这些两层结构均由面向20μm厚度的esl玻璃4904(得自esl europe，united kingdom)的氧化铝衬底110的内层150、160，以及聚合物包封材料(得自sendx medical inc.，california,usa)的外层151、161组成，该聚合物包封材料如授予california,usa的sendx medical inc.的国际专利申请wo97/43634中所公开，包含28.1重量％的聚甲基丙烯酸乙酯(elvacite，备件号2041，得自dupont)、36.4重量％的乙酸卡比醇酯、34.3重量％的硅烷化高岭土(备件号hf900，得自engelhard)、0.2重量％的煅制氧化硅和1.0重量％的三甲氧基硅烷。[0124]1200μm直径和10μm厚度的乙酸纤维素和乙酸丁酸纤维素的圆形内膜170覆盖工作电极120。[0125]对于肌酸酐传感器，具有1200μm直径和12μm厚度的肌酸酐酶、戊二酸醛处理的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的圆形酶层180覆盖内膜170。[0126]对于肌酸传感器，具有1200μm直径和12μm厚度的戊二酸醛处理的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的圆形酶层180覆盖内膜170。[0127]具有4000μm直径和约10μm厚度的丙烯酸酯的圆形外膜层190(扩散限制膜)覆盖完整电极系统，中心位于工作电极120上。[0128]外膜由经稀释的聚丙烯酸酯(eudragit)分散体制成，分散体分配于传感器区域上以覆盖所有三个电极并与聚合物包封材料151重叠约0.5mm。在肌酸酐传感器中，肌酸和肌酸酐两者经酶促方法转化为过氧化氢。在肌酸传感器中，仅肌酸经酶促方法转化为过氧化氢。肌酸酐的浓度从肌酸酐传感器信号(代表肌酸+肌酸酐)与肌酸传感器信号(代表肌酸)之间的差值来确定。[0129]vii.用本发明的突变肌酸酶(ec 3.5.3.3)测量生理流体样本中的肌酸酐或肌酸的方法[0130]本发明还提供一种用于测量样本中的肌酸和/或肌酸酐的方法，包括使样本与包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)的传感器或双传感器接触，并且检测样本中的肌酸和/或肌酸酐的步骤，所述肌酸酶在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下是热稳定性的。然后使用传感器所检测的肌酸和/或肌酸酐来确定样本中检测的肌酸和/或肌酸酐的水平。在一个实施方案中，所述方法包括使传感器与包含硫醇灭活剂诸如异噻唑啉酮衍生的试剂(例如mit)的冲洗溶液接触的步骤，并且其中冲洗步骤可在使样本与传感器或双传感器接触的步骤之前、之后、或之前且之后进行。用于测量样本中的肌酸和/或肌酸酐和冲洗步骤的方法通常在37℃的温度下进行，但也可在25℃以上进行(例如在26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或45℃或以上)。[0131]在方法的一个实施方案中，传感器包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)以用于测量肌酸；并且在方法的第二实施方案中，传感器包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)以用于测量肌酸酐；或者在方法的第三实施方案中，传感器为包含所述肌酸和肌酸酐传感器两者的双传感器。在方法的另一个实施方案中，其中肌酸酶为突变肌酸酶；并且其中肌酸酶的氨基酸序列如上文第i部分所定义。[0132]vii.本发明的突变肌酸酶(ec 3.5.3.3)用于在37℃及以上和硫醇灭活剂存在下具有增强的稳定性的肌酸酐或肌酸传感器的用途[0133]本发明还提供在硫醇灭活剂(例如，异噻唑啉酮衍生的试剂，如mit)存在下热稳定的肌酸酶(ec 3.5.3.3)与包含硫醇灭活剂的冲洗溶液联合在适于测定肌酸酐的传感器中的用途，其中在约37℃及以上的温度下传感器的寿命延长。[0134]此外，肌酸酶可用于：a)包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸传感器；b)包含肌酸酶(ec 3.5.3.3)、肌酸酐酶(ec 3.5.2.10)和肌氨酸氧化酶(ec 1.5.3.1)的肌酸酐传感器；或者c)包括肌酸和肌酸酐传感器两者的双传感器，其中所述肌酸酶在异噻唑啉酮衍生的试剂存在下是热稳定性的；并且其中肌酸酶的氨基酸序列如上文第i部分所定义。[0135]实施例1：用于产生在改性硫醇基的试剂存在下保持活性且热稳定性增强的肌酸脒基水解酶的方法[0136]将得自产碱菌属的天然肌酸酶(q9rhu9_uniprot)选择为“野生型”亲本酶，因为已知其固有地呈热稳定性。来源于产碱菌属(q9rhu9_uniprot)肌酸酶的突变多肽在用编码期望突变体的合成转基因(由genscript供应)转化的重组细菌细胞中产生。[0137]选择天然肌酸酶(q9rhu9_uniprot)中存在的半胱氨酸残基进行突变，因为这些残基是sh试剂攻击硫醇基的潜在靶标，可能损害肌酸酶活性。从诸如丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的保守替换开始，测试各个半胱氨酸残基的替换数目。因此，产生一系列突变肌酸酶多肽，其包括在给定的突变多肽中半胱氨酸残基的一个、两个、三个或更多个替换。然后在不含防腐剂neolone的100mm磷酸盐缓冲液ph 7.4以及用于abl90分析仪(radiometer medical aps)的包含1.25g/l neolone的冲洗溶液中温育0.2mg/ml酶之后，测试表达和纯化的突变多肽的稳定性(根据保留的肌酸酶活性)，并且在4℃、22℃(室温)或40℃下温育8天(或如所示的4天)。用于abl90分析仪的冲洗溶液为用1.25g/l neolone(包含mit)防腐的ph 7.4的缓冲盐溶液。[0138]在温育之后，将所有样本用100mm磷酸盐缓冲液ph 7.5稀释10倍后测定样本的残余活性。将100μl的各个稀释样本一式三份移取到微孔板中，之后移取包含50mm肌酸、10u/ml肌氨酸氧化酶、5u/ml辣根过氧化物酶、0.04％4-羟基苯磺酸盐和1.5mm 4-氨基安替吡啉的100μl的60mm磷酸盐缓冲液ph 7.5至其中。由氧化的4-羟基苯磺酸盐随后与4-氨基安替吡啉反应而形成的有色产物形成之后，在恒温于25℃的微孔读取器中490nm处的吸光度增大(δabs)。将进度曲线的线性部分上得到的δabs/分钟用作相对肌酸酶活性的量度。[0139]将突变多肽的稳定性(相对于4℃下温育之后的活性而言保留的活性％)与野生型亲本酶和可商购获得的重组热稳定性肌酸酶c2-at(由kikkoman.co.jp供应)进行比较。发现所测定的肌酸酶c2-at的氨基酸序列与产碱菌肌酸酶q9rhu9的序列相同，不同的是具有两个氨基酸替换：a202t和e312k。[0140]表2：肌酸酶突变体的稳定性测试结果[0141][0142][0143]*4天处理[0144]产碱菌肌酸酶中的所有半胱氨酸残基被丝氨酸替换导致酶活性完全丧失(未示出)。一些半胱氨酸残基的保守替换导致在22℃的室温下针对mit的稳定性改善。半胱氨酸残基的可选的保守替换的比较结果令人惊奇地显示出被丙氨酸替换赋予针对mit的最大稳定性。例如，c175以及c299被苏氨酸、甘氨酸或丝氨酸替换无法增强针对mit的稳定性。然而，具有单半胱氨酸替换的突变酶表现出在40℃下酶稳定性的损失，同时示出在室温下针对mit的稳定性增强。[0145]对包括两个半胱氨酸替换的多种不同组合的突变产碱菌肌酸酶多肽进行测试；其中c299a、c175a替换的特定组合赋予针对异噻唑啉酮的最大稳定性，同时在40℃下保持热稳定。另外，发现第三保守半胱氨酸替换c268l在插入具有双替换(c299a，c175a)的突变体中时赋予在40℃下针对异噻唑啉酮的进一步增大的稳定性。然而，两种氨基酸替换a202t和e312k(单独或与c299a、c175a替换组合)并未赋予在40℃针对异噻唑啉酮的稳定性的任何附加增大。[0146]鉴定与来自酶产碱菌属的天然肌酸酶(q9rhu9_uniprot)共享高度结构同源性和相同功能特性的来源于其它微生物源的肌酸酶，这基于其共享大于80％的氨基酸序列同一性以及指定为ec 3.5.3.3的肌酸酶活性。将各个选定肌酸酶的氨基酸序列与得自酶产碱菌属的天然肌酸酶(q9rhu9_uniprot)的氨基酸序列(seq id no 2)进行比对，并且鉴定对应于seq id no 2中的c299a、c175a和任选的c268l的替换(参见表1)，所述替换足以赋予各个相应酶在达至40℃下针对异噻唑啉酮的增大的稳定性。[0147]实施例2：通过采用在改性硫醇基的试剂存在下保持活性且热稳定性增强的肌酸脒基水解酶来提高肌酸酐传感器的有效寿命[0148]采用肌酸酶突变体#42(c175a,a202t,c299a,e312k)以及得自kikkoman的商业肌酸酶c2-at制备肌酸和肌酸酐传感器。将传感器置入radiometer abl90分析仪的传感器盒中，安装到恒温于37℃的分析仪中，该分析仪具有包含0.7g/l neolone 950和9％甲基异噻唑啉酮(mit)的冲洗溶液。使分析仪在标准分析仪条件下运行8天，以确保功能性和稳定的响应。在第9天，将分析仪分为两组(a组和b组，各自由三个具有突变体#42ci酶的分析仪和两个具有商业ci,c2-at的分析仪组成)。向a组施加具有1.2g/l neolone 950的冲洗溶液，并向b组施加具有2g/l neolone950的冲洗溶液。然后在标准冲洗和校正下，使分析仪再运行36天。在这36天过程中，传感器灵敏度的减小汇总于下表中：[0149][0150]在传感器寿命期间可接受的灵敏度损失为约10pa/μm。[0151]就ci突变体#42而言，防腐剂neolone 950的水平和36天中灵敏度的减小均相比于商业酶显著更低。









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