硼替佐米与索拉非尼联合在制备治疗肾透明细胞癌药物中的用途

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及硼替佐米在治疗透明细胞肾癌中的应用，特别涉及硼替佐米与索拉非尼联合在治疗肾透明细胞癌中的用途。本发明属于生物医药技术领域。背景技术：2.根据全国肿瘤登记中心(nccr)数据表明，中国人群死于癌症的病例从1973-75年的10.1％上升至2015年的24.2％，癌症已成为人民死亡的重要因素之一。而透明细胞肾癌(clear cell renal cell carcinoma，ccrcc)是肾癌中最主要的一类癌症，也是肿瘤抑制因子(vhl)突变遗传综合征的一种重要亚型，ccrcc在肾癌中的比例占据70％-80％，同时ccrcc具有很高的致死率，每年全世界大约会有102,000例患者因此而死亡。ccrcc早期常无症状，或只有发热、乏力等全身症状，在肿瘤体积增大后出现临床症状才易被检测，预后较差。3.ccrcc在细胞层次最主要的特征是线粒体含量明显减少，线粒体呼吸功能显著减弱，提示线粒体含量的减少与vhl突变肿瘤发生有关，这些特征导致患者的治疗抵抗和总生存期降低。其主要原因来自于vhl突变导致ccrcc细胞中肿瘤抑制蛋白(pvhl)含量减少或失去功能，无法抑制线粒体离子肽酶1(lonp1)分解线粒体相关蛋白，从而使线粒体转录因子a(tfam)蛋白大量降解，导致线粒体功能障碍。而现阶段对于ccrcc的主要医疗手段除化疗、手术之外，主要通过应用索拉非尼来阻断raf/mek/erk介导的细胞信号传导通路抑制肿瘤增殖，抑制血小板衍生生长因子(pdgf)受体来阻断肿瘤血管生成，来间接抑制ccrcc肿瘤生长。而既往文献报道ccrcc肿瘤细胞可因线粒体功能的减弱而逐渐产生对索拉非尼的耐药性，导致治疗效果逐渐降低直至失去效用。4.本发明发明人研究发现原本用于多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤的治疗药物lonp1抑制剂硼替佐米可使ccrcc细胞抑制tfam降解，恢复对索拉非尼的敏感性。两者的联合运用可达到抑制对索拉非尼产生严重耐药性的肾透明细胞癌生长的效果。因此，本发明借助硼替佐米来提高索拉非尼的敏感性，并在两者联合用药的条件下，达到更好治疗ccrcc患者的目的。技术实现要素：5.针对上述技术问题，本发明提供了硼替佐米与索拉非尼联合在制备治疗肾透明细胞癌药物中的用途，硼替佐米与索拉非尼联合用药，可以提高对索拉非尼产生严重耐药性的肾透明细胞癌对索拉非尼的敏感性，从而得到一种对肾透明细胞癌具有良好治疗效果的用药方案。6.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：7.本发明提供了硼替佐米与索拉非尼联合在制备治疗肾透明细胞癌药物中的用途。8.其中，优选的，所述的肾透明细胞癌为对索拉非尼产生严重耐药性的肾透明细胞癌。9.其中，优选的，所述的肾透明细胞癌为对索拉非尼产生严重耐药性的肾透明细胞癌细胞vhl-null-786-0细胞。10.其中，优选的，硼替佐米通过抑制线粒体转录因子a(tfam)降解来增加线粒体含量来影响肿瘤细胞对索拉非尼的敏感性。11.相较于现有技术，本发明的有益效果是：12.本发明通过硼替佐米恢复对索拉非尼产生严重耐药性的肾透明细胞癌细胞对索拉非尼的敏感性，来达到治疗ccrcc的药理效果。本发明的提出可以使ccrcc晚期患者得到有效的治疗，延长患者的生存期，一定程度上提高其生活质量。附图说明13.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案：14.图1为免疫荧光观察vhl-null-786-0细胞(左)以及vhl-wt细胞(右)中线粒体相关蛋白转录因子a(tfam)的表达；15.图2是western blotting(wb)检测vhl-null-786-0细胞(vhl-/-)以及vhl-wt细胞(vhl-wt)中线粒体相关蛋白tfam蛋白水平；16.图3是用结晶紫染色法观察vhl-null-786-0细胞(vhl-/-)和vhl-wt细胞(vhl-wt)在索拉非尼(sora)和硼替佐米(btz)单独运用，及两者联合用药后的凋亡状态；17.图4是用流式细胞术检测vhl-null-786-0细胞和vhl-wt细胞在sora以及btz单独运用，和两者联合用药后的细胞凋亡率；18.图5是用wb检测dmso和btz单独使用对vhl-null-786-0细胞和vhl-wt细胞中线粒体蛋白tfam、gapdh含量的影响；19.图6是展示分别应用dmso、sora、btz、sora与btz联合对小鼠肿瘤疾病模型治疗下的肿瘤大小；20.其中：左图为通过dmso、sora、btz、联合sora与btz分别对小鼠肿瘤疾病模型治疗的实验效果(治疗后的小鼠肿瘤大小)；右图为对各组肿瘤大小数据的的具体统计分析。具体实施方式21.下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。22.实施例1：免疫荧光染色观察细胞中线粒体相关蛋白tfam表达23.1材料24.vhl-null-786-0细胞、vhl-wt细胞、多聚甲醛、70％甲醇、丙酮、pbs、triton、bsa、dapi染液、dabco、tris、甘油等。25.本发明所用的细胞为vhl-null-786-0细胞、vhl-wt细胞，在含10％胎牛血清(fbs)的dmem(葡萄糖4.5g/l)中，以37℃，5％co2培养。vhl-null-786-0细胞购自美国组织培养库(atcc)。26.2方法27.该细胞实验分为vhl-null-786-0细胞实验组与vhl-wt细胞对照组。在培养板中将已爬好细胞vhl-null-786-0细胞或vhl-wt细胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定爬片15min，pbs浸洗玻片3次，每次3min。0.5％triton x-100(pbs配制)室温通透20min。pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。吸水纸洗掉封闭液，不清洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的tfam一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。然后加荧光二抗：pbst浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，pbst浸洗切片3次，每次3min；最后复染核：滴加dapi避光孵育5min，对标本进行染核，进行pbst每次5min进行四次并洗去多余的dapi。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。28.3结果29.如图1所示，vhl-wt细胞中tfam表达明显多于vhl-null-786-0细胞。结果表明vhl突变缺失可导致细胞中tfam表达减少。30.实施例2：western blotting检测vhk-null-786-0细胞、vhl-wt细胞中线粒体转录因子a(tfam)表达情况。31.1材料32.实验所用的细胞及培养方法同实施例1。裂解液、pbs g 250、考马斯亮蓝溶液、nacl、sds上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、丽春红染液、封闭液、tbst、tbs、洗脱抗体缓冲液、显影液等。33.2方法34.常规提取vhk-null-786-0细胞、vhl-wt细胞中总蛋白，用紫外分光光度计测蛋白浓度；组装胶板，制备电泳凝胶：分离胶7ml(ddh2o 2.24ml，30％丙烯酰胺2.8ml，1.5moltris-ph8.81.82ml，10％sds 70μl，10％ap 70μl，temd 2.8μl)，浓缩胶3ml(ddh2o 2.1ml，30％丙烯酰胺495μl，1.0moltris-ph6.8375μl，10％sds30μl，10％ap 30μl，temd 3.0μl)；灌分离胶，水封，灌浓缩胶，插加样梳；5μl蛋白+1μl 6×loading buffer，沸水浴5min；将胶放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，上样，接通电源，恒压：100v 15ma，15min转为120v，20ma，100min；转膜：3层滤纸+膜+胶+3层滤纸，恒流：i＝面积×1.5，t＝1h；转完膜加封闭液，放在摇床摇1h；加tfam一抗，放在摇床摇5min，4℃过夜；洗涤液洗膜tbst 10min×3，tbs 10min；加二抗，放在摇床摇2h；洗涤液洗膜tbst 10min×3，tbs 10min；染色，避光，凝胶图像处理系统分析。35.3结果36.如图2所示，wb实验发现vhl-null-786-0细胞tfam含量明显低于vhl-wt细胞，结果表明vhl的缺失会导致细胞线粒体相关蛋白降解。37.实施例3：通过结晶紫染色评估dmso、索拉菲尼、硼替佐米与索拉非尼联合用药对分别vhl-null-786-0细胞与vhl-wt细胞的凋亡、杀伤作用38.1材料39.实验所用的细胞及培养方法同实施例1。dmso、d-pbsa、rpmi-1640培养液、结晶紫染液、硼替佐米、索拉非尼等。40.2方法41.1％dmso、btz(10nm)、sora(20μm)、combo(btz与sora联合应用)分别对vhl-null-786-0细胞与vhl-wt细胞2组细胞处理48小时后(每孔2毫升培养基)，后用3-溴丙酮酸或棉酚按指定时间处理。pbs洗涤1次，固定后用结晶紫溶液(0.1％结晶紫，20％甲醇，80％去离子水)在室温下染色45分钟，pbs洗涤4次，拍照。42.3结果43.如图3所示，结果表明，索拉非尼单纯对vhl-null-786-0细胞和vhl-wt处理，vhl-null-786-0细胞受到耐药性的影响，细胞凋亡数量不如vhl-wt细胞组；且对vhl-null-786-0细胞和vhl-wt细胞单独使用硼替佐米凋亡效果并不明显；但sora和btz的联合运用可使vhl-null-786-0细胞达到与vhl-wt细胞相似的凋亡效果；结果表明硼替佐米的运用可恢复vhl-null-786-0细胞对索拉非尼杀伤的敏感性。44.实施例4：通过流式细胞术凋亡检测评估硼替佐米、索拉菲尼、硼替佐米与索拉非尼联合用药对分别vhl-null-786-0细胞与vhl-wt细胞的凋亡、杀伤作用45.1材料46.实验所用的细胞及培养方法同实施例1。pbs、孵育缓冲液等47.2方法48.annexin v-fitc/pi染色检测细胞凋亡率。在dmso、sora(20μm)、btz(10nm)、sora联合btz处理分别处理vhl-null-786-0细胞与vhl-wt细胞48小时后，用pbs冲洗细胞，收集细胞进行annexin v-fitc/pi染色。每个细胞团块重悬于添加5μl fitc和5μl pi的500μl结合缓冲液中，孵育15分钟、上机检测。49.3结果50.如图4所示，vhl-null-786-0细胞表达对索拉非尼的耐药性，其细胞凋亡率远低于vhl-wt细胞。而运用硼替佐米处理的vhl-null-786-0细胞加入索拉非尼后表达同vhl-wt细胞联合用药条件下相似的细胞凋亡率。结果表明硼替佐米可恢复vhl-null-786-0细胞对索拉非尼的敏感性。51.实施例5：运用wb实验分别检测dmso、硼替佐米对vhl-null-786-0细胞与vhl-wt细胞处理后线粒体蛋白tfam含量52.1材料53.如实施例2。54.2方法55.实验方法同实施例2以及实施例356.3结果57.如图5所示，dmso实验组的图像显示vhl的缺失会导致tfam的降解，vhl-null-786-0细胞中tfam含量远小于vhl-wt细胞，而加入硼替佐米后，两种细胞中的tfam含量差距不大。结果表明vhl的缺失导致细胞tfam降解增多，而硼替佐米能显著增加vhl-null-786-0细胞中的tfam含量。58.实施例6：硼替佐米与索拉菲尼联合在治疗动物肿瘤疾病模型中的作用59.1.材料60.1.1肿瘤细胞61.实验所用的细胞及培养方法同实施例1。62.1.2小鼠63.本发明所用小鼠为免疫受损的scid小鼠。小鼠为雄性cb17/icr-prkdcscid/rj小鼠购自法国janvier实验室。动物研究得到了瑞典农业委员会的批准。小鼠饲养在恒温(20±3℃)、湿度(50±10％)的动物设施中。光/暗循环在12h:12h。所有小鼠年龄大致相同，为6-8周。64.2方法65.将小鼠们分为4个组，每组小鼠n＝5，每只小鼠沿背中线皮下注射约5×106个肿瘤细胞。每隔3天测量肿瘤体积，按标准公式(length×width2×0.52)计算。当肿瘤体积达到5mm3时开始药物治疗，运用1％的dmso(cat.stbj9836,sigma)-对照实验、索拉非尼(sora)(15mg/kg,cat.sml2653,sigma)每日口服、硼替佐米(btz)(1mg/kg,cat.3514175,merck)每周两次腹腔注射、或sora与btz联合(combo)治疗。当对照组肿瘤体积达到1.2-1.3cm3时实验终止。66.3结果67.如图6所示，相较于sora与btz单纯治疗，sora与btz联合(combo)在小鼠肿瘤模型中应用获得了最优的治疗效果，使得小鼠肿瘤大小与质量最小，肿瘤得到了有效的杀伤与抑制。









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