一种芪天扶正胶囊HPLC指纹图谱的构建方法及其应用与流程

测量装置的制造及其应用技术一种芪天扶正胶囊hplc指纹图谱的构建方法及其应用技术领域1.本发明涉及中药制剂质量控制技术领域，具体涉及一种芪天扶正胶囊hplc指纹图谱的构建方法及其应用。背景技术：2.芪天扶正胶囊(国药准字z0083496)是陕西医药控股集团山海丹药业股份有限公司的药品，由国家食品药品监督管理局批准，由黄芪、女贞子、北沙参、天冬、山茱萸(酒制)、百合、葫芦巴和陈皮8味中药组成，具有益气滋阴、补肾培本的功效。其中，黄芪补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌；女贞子滋补肝肾，明目乌发；北沙参养阴清肺，益胃生津；天冬养阴润燥，清肺生津；山茱萸补益肝肾，收涩固脱；百合养阴润肺，清心安神；陈皮理气健脾，燥湿化痰。与规范方案中抗肿瘤化学药品联合用于治疗非小细胞肺癌属气阴两虚证，可改善患者神疲乏力，少气懒言，口干咽燥，自汗盗汗，面色晄白，或咳嗽咯痰，或纳呆，或痰中带血等症状，还可减轻由化疗引起的免疫功能低下，以及白细胞下降及恶心、呕吐、脱发等现象，改善患者生活质量。3.目前，该品种质量标准仅对芪天扶正胶囊中部分成分建立含量测定方法，且多为单一药材指纹图谱研究。复方中成药可借助指纹图谱反映其所含成分的全貌信息，可从整体上评价其质量的稳定性和一致性。技术实现要素：4.本发明采用hplc法建立芪天扶正胶囊指纹图谱，并溯源其化学成分，旨在为芪天扶正胶囊的生产质量控制提供技术支撑。5.本发明提供的技术方案如下：6.一种芪天扶正胶囊hplc指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：7.(1)供试品溶液的制备：取芪天扶正胶囊30粒，去胶囊外壳，研细，精密称取1.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入100ml50％甲醇，称定重量，超声处理45min，放冷，50％甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；8.(2)单味药材样品溶液的制备：按芪天扶正胶囊的处方工艺分别制备黄芪、女贞子、北沙参、天冬、山茱萸、百合、葫芦巴和陈皮单味药材样品，按步骤(1)中方法制备，即得单味药材样品溶液；9.(3)混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含腺苷7.05μg、没食子酸5.63μg、5-羟甲基糠醛5.93μg、红景天苷80.00μg、酪醇25.31μg、莫诺苷23.67μg、马钱苷8.65μg、当药苷3.51μg、毛蕊异黄酮苷1.47μg、芦丁5.99μg、木犀草苷122.45μg、特女贞苷240.82μg、芹菜苷1.56μg、橙皮苷40.00μg、橄榄苦苷13.71μg、芒柄花苷2.84μg、女贞苷g13 9.31μg、毛蕊异黄酮0.76μg、木犀草素4.74μg的溶液，即得混合对照品溶液；10.(4)hplc分析的色谱条件：shimadzu c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱；检测波长：258nm；体积流量：0.8ml/min；柱温25℃；进样量10μl；11.(5)在步骤(4)的色谱条件下分析供试品溶液，即得芪天扶正胶囊hplc指纹图谱。12.作为优选，步骤(1)中超声所用超声仪的参数如下：功率250w，频率40khz。13.作为优选，步骤(1)中过滤所用的膜为微孔滤膜，其孔径为0.22μm。14.作为优选，步骤(3)中梯度洗脱的程序具体如下：0-22min，2-5％a；22-55min，17％a；55-82min，17-27％a；82-99min，27-42％a。15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：16.(1)本发明采用hplc法建立芪天扶正胶囊的指纹图谱，可反映其整体化学特征，该方法简单、快捷，为全面提升其产品质量提供了科学依据。17.(2)本发明采用hplc法建立了芪天扶正胶囊指纹图谱，并可溯源其化学成分，为芪天扶正胶囊产品的生产质量控制提供技术支撑。附图说明18.图1为10批芪天扶正胶囊的hplc指纹图谱；19.图2为芪天扶正胶囊的hplc指纹图谱；20.其中，1-35为特征指纹峰；1-腺苷；4-没食子酸；5为5-羟甲基糠醛；11为红景天苷；12为酪醇；14-莫诺苷；16-马钱苷；17-当药苷；21-毛蕊异黄酮苷；23-芦丁；24-木犀草苷；25-特女贞苷(作为参照物的色谱峰)；27-芹菜苷；28-橙皮苷；29-橄榄苦苷；30-芒柄花苷；31-女贞子苷g13；34-毛蕊异黄酮；35-木犀草素；21.图3为混合对照品hplc图谱；22.图4为单味药材hplc色谱图及其化合物的归属；23.其中，a-黄芪；b-女贞子；c-北沙参；d-山茱萸；e-天冬；f-百合；g-葫芦巴；h-陈皮。具体实施方式24.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。25.1材料26.1.1仪器working k2025高效液相色谱仪(山东悟空仪器有限公司)；kq-300da型数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；auw220d型电子天平(日本岛津公司)；优普实验室超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。27.1.2试剂与药物芪天扶正胶囊(每瓶64粒，每粒0.3g)10批，批号分别为21121015(s1)、21121014(s2)、21121012(s3)、21121013(s4)、21121011(s5)、21121009(s6)、21121010(s7)、21121008(s8)、21121007(s9)、21121006(s10)，由陕西医药控股集团山海丹药业股份有限公司提供。当药苷(批号ps010483)、没食子酸(批号ps000688，纯度》98.0％)、5-羟甲基糠醛(批号ps020078，纯度》95.0％)、女贞子g13(批号ps012231)、酪醇(批号ps010516，纯度》98.0％)对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司；马钱子苷(批号hr61122s1，hplc 98％)、莫诺苷(批号hr9123b2，hplc 98％)、毛蕊异黄酮(批号hr1343w2，hplc 98％)、芒柄花苷(批号hr14518s2，hplc 98％)、毛蕊异黄酮苷(批号hr20112b1，hplc 98％)、红景天苷(批号hr81211b1，hplc 98％)、橄榄苦苷(批号hs19522p1，hplc 98％)、木犀草苷(批号hr395w10，hplc 98％)、特女贞苷(批号hs19515s1，hplc 98％)、芹菜苷(批号ha146660198，hplc 98％)对照品均购自宝鸡市晨光生物科技有限公司。橙皮苷(批号110721-200512)、木犀草素(批号111520-200201)、芦丁(批号100080-200707，hplc 90.5％)对照品均购自中国药品生物制品检定所。腺苷(批号z23s7j21814，纯度99％)对照品购自上海源叶生物科技有限公司。药材黄芪、女贞子、北沙参、山茱萸(酒制)、天冬、百合、葫芦巴、陈皮由陕西医药控股集团山海丹药业股份有限公司提供(产地分别为陕西、安徽、河北、陕西、广西、湖南、安徽、浙江)，经陕西中药研究所(陕西医药信息中心)曹爱兰研究员鉴定为正品。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国fisher公司；甲酸为色谱纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司)；纯净水为杭州娃哈哈集团有限公司；其余试剂均为分析纯。28.2方法与结果29.2.1色谱条件shimadzu c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱(0-22min，2-5％a；22-55min，17％a；55-82min，17-27％a；82-99min，27-42％a)；检测波长：258nm；体积流量：0.8ml/min；柱温25℃；进样量10μl。30.2.2供试品溶液制备取本品30粒，去胶囊外壳，研细，精密称取约1.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入100ml50％甲醇，称定重量，超声(功率250w、频率40khz)处理45min，放冷，50％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过(0.22μm微孔滤膜)，取续滤液，即得。31.2.3混合对照品溶液精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含腺苷7.05μg、没食子酸5.63μg、5-羟甲基糠醛5.93μg、红景天苷80.00μg、酪醇25.31μg、莫诺苷23.67μg、马钱苷8.65μg、当药苷3.51μg、毛蕊异黄酮苷1.47μg、芦丁5.99μg、木犀草苷122.45μg、特女贞苷240.82μg、芹菜苷1.56μg、橙皮苷40.00μg、橄榄苦苷13.71μg、芒柄花苷2.84μg、女贞苷g13 9.31μg、毛蕊异黄酮0.76μg、木犀草素4.74μg的溶液，即得。32.2.4单味药材样品溶液按芪天扶正胶囊的处方工艺分别制备黄芪、女贞子、北沙参、天冬、山茱萸、百合、葫芦巴、陈皮单味药材样品，按“2.2”项下方法制备，即得。33.2.5指纹图谱方法学考察34.2.5.1精密度考察取“2.2.2”项下制备的供试品溶液(批号21121010)，在“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，分别对共有峰的相对保留时间与相对峰面积进行分析。结果显示，以特女贞苷为参照峰，26个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd分别为0.01-0.27％与0.25-3.30％，表明仪器精密度良好。35.2.5.2稳定性考察取“2.2.2”项下制备的供试品溶液(批号21121010)，分别于各时间点即0，2，4，6，8，10，12，16，20，24，36和48h进样，记录色谱图，考察26个共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，以特女贞苷为参照峰，其共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd值分别为0.01-0.26％与0.29-4.51％，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。36.2.5.3重复性考察取芪天扶正胶囊样品(批号21121010)，按“2.2.2”项下供试品制备方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。结果显示，以特女贞苷为参照峰，26个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd分别为0.02-0.18％与0.39-4.85％，表明该方法重复性良好。37.2.6指纹图谱建立及相似度评价取10批芪天扶正胶囊供试品溶液(s1-s10)，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。采用“中药指纹图谱相似度评价系统2012年版”，以s7供试品色谱图为参照图谱，中位数法为对照图谱生成方法，时间窗宽度为0.5，多点校正后自动匹配生成供试品叠加图谱与对照图谱r(见图1)。10批样品有35个共有峰，因25号峰(特女贞苷)分离度好，峰面积较大，保留时间较为稳定，故选其作为参照峰(见图2)。38.表1 10批样品共有峰相对保留时间[0039][0040]表2 10批样品共有峰相对峰面积[0041][0042]表1-2结果显示，10批芪天扶正胶囊供试品共有峰的相对保留时间rsd均小于0.47％且相对峰面积rsd均小于8.46％。[0043]表3 10批样品的相似度[0044][0045]表3结果显示，10批样品的相似度均大于0.9，表明其质量较为稳定，化学成分具有良好的一致性。[0046]2.7色谱峰指认与化学成分归属[0047]由图3可知，基于供试品色谱图与混合对照品色谱图的保留时间及紫外光谱图的一致性，共指认19个特征指纹峰，分别为腺苷(1号峰)、没食子酸(4号峰)、5-羟甲基糠醛(5号峰)、红景天苷(11号峰)、酪醇(12号峰)、莫诺苷(14号峰)、马钱苷(16号峰)、当药苷(17号峰)、毛蕊异黄酮苷(21号峰)、芦丁(23号峰)、木犀草苷(24号峰)、特女贞苷(25号峰)、芹菜苷(27号峰)、橙皮苷(28号峰)、橄榄苦苷(29号峰)、芒柄花苷(30号峰)、女贞子苷g13(31号峰)、毛蕊异黄酮(34号峰)、木犀草素(35号峰)。[0048]由图4可知，芪天扶正胶囊样品与单味药材色谱图比较分析，可知1、2、8、10、14、16、17、21、30、32、34号峰来源于黄芪，1、6、8号峰来源于天冬，1、2、5、8、15、18、26、28、32、35号峰来源于陈皮，8、11、15、18、19、25、26、29、31、32、33号峰来源于女贞子，1、3、6、8、14、16、18、19、20、22、23号峰来源于葫芦巴，1、2、4、5、7、8、14、16、17号峰来源于山茱萸，1、8、26号峰来源于百合，1、3、5、6、8、17、18、19、26、28、32、33、34、35号峰来源于北沙参。[0049]3讨论[0050]3.1提取条件的选择考虑到本样品为提取加工后制成的胶囊剂，故前处理采用超声的方法进行提取。分别采用50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇、甲醇、乙醇对样品提取，并考察了超声25、45、60min的提取情况。结果表明，复方中成分可在50％甲醇提取液中得到较好的体现，且超声45min可确保提取完全。因此，选择50％甲醇超声45min作为提取条件。[0051]3.2测定波长考察处方中药材含有没食子酸、特女贞苷、橙皮苷、马钱苷等多种成分，极性差别较大，故采用岛津二极管阵列检测器对芪天扶正胶囊样品溶液及相应的对照品溶液进行紫外可见全波长扫描，分析所得光谱图，选择色谱峰丰富的3个波长，即242nm、258nm、330nm，在working k2025仪器上对芪天扶正胶囊检测确认，结果发现，258nm波长下的色谱峰丰富、杂峰干扰较小、峰形较好、有多个特征峰。故选择258nm为检测波长。[0052]3.3流动相考察通过考察0.1％甲酸-甲醇、0.1％磷酸-甲醇、0.1％甲酸-乙腈、0.1％磷酸-乙腈等流动相体系，比较各流动相组成条件下色谱图中各组分基线状况、峰形、分离度等，结果表明采用乙腈-0.1％甲酸为流动相进行梯度洗脱时，基线平稳、色谱峰峰形良好、分离度高、谱图信息较为丰富。[0053]3.4流速、柱温考察分别考察流速0.6、0.8、1.0ml/min下色谱出峰情况，流速0.8ml/min时色谱峰峰形适中，分离度好，色谱峰的数目多。因此，本研究流速选为0.8ml/min。[0054]考察柱温20℃、25℃、30℃下色谱出峰情况，柱温25℃时色谱峰峰形适中，分离度好，峰个数多。因此，选择25℃为柱温。[0055]3.5进样量考察供试品色谱图中各组分紫外响应值及分离效果与供试品溶液进样量有关。进样量为5μl时，供试品色谱图中各组分紫外响应值较小；进样量为20μl时，供试品色谱图中各组分紫外响应值最大，但部分相邻色谱峰分离效果较差；进样量为10μl时，供试品色谱图中各共有峰分离效果好、基线平稳且紫外响应值满足要求。因此，选择10μl为进样量。[0056]总之，本发明采用hplc法建立了芪天扶正胶囊产品的指纹图谱，并可反映其整体化学特征，该方法简单、快捷，为全面提升芪天扶正胶囊产品质量提供了科学依据。[0057]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。









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