降低脱靶毒性的前抗体的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术降低脱靶毒性的前抗体1.发明技术领域2.本发明总体上涉及降低正常组织靶向并且增强肿瘤靶向的前抗体(pro-antibody，probody)的领域。3.联邦政府资助研究的声明4.不适用。5.对序列表的引用6.本技术包括按照37cfr 1.821-1.825要求单独提交的序列表。7.发明背景8.在不限制本发明的范围的情况下，就前抗体或可激活抗体描述本发明的背景。9.在授予stagliano等人的题为“抗egfr可激活抗体”的第10,059,762号美国专利中教导了一种这样的前抗体。这些发明人教导包含用掩蔽部分(mm)修饰的抗体或抗体片段(ab)的修饰的抗体，其可以进一步与可切割部分(cm)偶联，产生可激活抗体(aa)。在aa中，cm能够被切割、还原、光解或以其他方式修饰。aa可以表现出可激活的构象，使得ab更容易接近靶点，例如，在能够切割、还原或光解cm的试剂存在下，通过切割、还原或光解cm去除mm。然而，该技术的重大限制是mm和靶点之间对于结合靶点结合部分(tbm)的竞争。而且，mm的切割导致明显的脱靶效应。10.在授予sagert等人的题为“抗itga3抗体、可激活的抗itga3抗体，及其使用方法”的第10,233,244号美国专利中教导了另一种这样的前抗体。据称，该发明总体上涉及结合itga3的抗体、特异性结合itga3的可激活抗体，以及在各种治疗、诊断和预防适应症中制备和使用这些抗itga3抗体和抗itga3可激活抗体的方法。11.在授予daugherty等人的题为“可激活的结合多肽及其鉴定和使用方法”的第8,541,203号美国专利中教导了另一种这样的前抗体。这些发明人教导了可激活结合多肽(abp)，其包含靶点结合部分(tbm)、掩蔽部分(mm)和可切割部分(cm)。掩蔽部分覆盖tbm的同源结合位点，并且tbm在cm切割后被暴露。据称，某些可激活抗体组合物包含含有抗原结合结构域(abd)的tbm、mm和cm。据称，abp包括“可激活”构象，使得tbm中的至少一个在未切割时，比能够切割cm的切割剂存在下切割cm后，更难接近靶点。据成，该应用教导候选abp的库、鉴定这样的abp的筛选方法和使用方法。对vegf、ctla-4或vcam具有特异性的abp与具有结合vegf的第一tbm和结合fgf的第二tbm的abp、以及所教导的组合物和使用方法一起被教导。同样，该技术的重大限制是mm和靶点之间对于结合tbm的竞争。而且，mm的切割导致明显的脱靶效应。12.在tipton等人提交的“可激活的抗ctla-4抗体及其用途”的第20190359714号美国专利公开文件中教导了另一种这样的前抗体。据称，这些申请人教导了可激活的抗人ctla-4抗体，其包含含有vh结构域的重链和含有掩蔽部分(mm)、可切割部分(cm)和vl结构域的轻链。这样的可激活的抗人ctla-4抗体在肿瘤微环境中具有ctla-4结合活性，其中掩蔽部分通过肿瘤特异性蛋白酶对可切割部分的蛋白水解切割去除，但在肿瘤外表现出与ctla-4的结合大大降低。13.在由wang提交的题为“治疗肿瘤和癌症的方法和试剂”的第20180271997号美国专利公开文件中教导了另一种这样的前抗体。据称，该申请人教导了治疗肿瘤和癌症的试剂、以及使用所述试剂治疗肿瘤和癌症的方法，所述方法使用前抗体，所述前抗体是可以在肿瘤中被激活的抗体。据称，另一类试剂是唾液酸酶与可以结合到免疫细胞表面的亲和配体的偶联物，或者是唾液酸酶与可以结合到另一种抗体的亲和配体的偶联物，因此提供了一种基于唾液酸酶的癌症免疫疗法。14.迄今为止，已经使用了三种可激活抗体的方法。在第一种方法中，前抗体包括通过蛋白水解接头连接的掩蔽肽，以阻断抗原-抗体相互作用。每种前抗体的开发都需要使用用于掩蔽肽的噬菌体展示的筛选过程。切割接头后，预期掩蔽肽离开并释放抗体的抗原结合位点。这种方法的问题包括：(1)掩蔽肽本身的异质性诱导免疫反应；(2)未释放掩蔽肽降低功效；(3)某些抗原-抗体相互作用太强，以致于无法被短(例如10个氨基酸)肽掩蔽；以及(4)肽在到达肿瘤之前会被降解，并且向正常组织暴露抗体的毒性。15.在第二种方法中，据称双可变域免疫球蛋白(dvd-ig)降低抗ctla4抗体的毒性。抗tta(肿瘤靶向抗原)抗体的vl和vh通过蛋白水解接头与抗ctla-4抗体连接，以覆盖ctla4结合位点。不幸的是，该方法需要肿瘤相关抗原(taa)和ctla4的配对，它需要添加一套精确的vl和vh，从而使分子更大，而精确的vl和vh总是可以与脱靶抗原相互作用并诱导免疫反应。16.第三种方法通过将“假(pseudo)vl”和“假vh”对连接到活性且有功能的vl和vh来在物理上阻断抗cd3可变轻(vl)链和可变重(vh)链的结合。当假vl与vh相互作用时，并且当假vh与vl相互作用时，它不具有活性。用蛋白酶接头将vl、vh、假vl和假vh连接在一起，形成一个非常大的分子。17.所需要的是通过消除对正常组织的靶向和增强肿瘤靶位点的活性克服现有技术中的问题的新融合蛋白。18.发明概述19.在一个实施方案中，本发明包括可激活抗体(aab)，其依次包含以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的第一抗原结合位点；以及其中可切割接头的切割释放第一重链以实现形成第一抗原结合位点，以结合第一抗原。一方面，aab还包含第二抗体结合位点，其由第二轻链可变区和第二轻链恒定区形成，所述第二轻链恒定区连接到结合第二抗原的第一重链，以及任选地包含在第二轻链可变区和第二轻链恒定区之间的柔性不可切割接头。另一方面，aab还包含第一重链恒定区、第一重链恒定区中的至少一个，或两者。另一方面，第一轻链区域、第一重链区域或两者还包含fc区、野生型fc区、突变fc区、单体野生型fc区、单体突变fc区、二聚体野生型fc区、二聚体突变fc区、第二重链可变区和第二fc区，或第二重链可变区和第二fc区和不可切割的柔性接头和第二轻链可变区和第二重链可变区，或第二fc区和不可切割的柔性接头和细胞因子。另一方面，第一抗原和第二抗原是以下中的至少一种：相同的抗原；第一抗原和第二抗原不同；或者第一和第二抗原是相同的抗原，但第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合相同抗原的不同表位。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合肿瘤靶点。另一方面，第一抗原是组织特异性表面抗原，其选自icam1、vcam1、epcam、纤维连接蛋白的额外结构域b、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、黑素瘤相关蛋白聚糖(mapg)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmv-maa)、前列腺特异性膜抗原(psma)、表皮生长因子受体(egfr)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、细胞粘附分子(cam)、人b细胞成熟靶点(bcma)、胎盘生长因子(plgf)、叶酸受体、胰岛素样生长因子受体(ilgfr)、cd133、cd40、cd37、cd33、cd30、cd28、cd24、cd23、cd22、cd21、cd20、cd19、cd13、cd10、her3、her2、非肌肉肌球蛋白重链a型(nmmhca)、转铁蛋白、上皮细胞粘附分子(epcam)、膜联蛋白a1、核仁素(nucleolin)、腱生蛋白、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)、氨肽酶n、tie-1、tie-2或c-met。另一方面，第一抗原选自蛋白、蛋白的一部分或肽，所述蛋白、蛋白的一部分或肽由选自以下中的至少一种基因编码：abcf1、acvr1、acvr1b、acvr2、acvr2b、acvrl1、adora2a、聚集蛋白聚糖、agr2、aicda、aif1、aig1、akap1、akap2、amh、amhr2、angpt1、angpt2、angptl3、angptl4、anpep、apc、apoc1、ar、azgp1、b7.1、b7.2、bad、baff、bag1、bai1、bcl2、bcl6、bdnf、blnk、blr1(mdr15)、blys、bmp1、bmp2、bmp3b(gdf10)、bmp4、bmp6、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmpr2、bpag1(网蛋白)、brca1、c19orfl0(il27w)、c3、c4a、c5、c5r1、cant1、casp1、casp4、cav1、ccbp2(d6/jab61)、ccl1(1-309)、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、ccl13(mcp-4)、ccl15(mip-1d)、ccl16(hcc-4)、ccl17(tarc)、ccl18(parc)、ccl19(mip-3b)、ccl2(mcp-1)、mcaf、ccl20(mip-3a)、ccl21(mip-2)、slc、exodus-2、ccl22(mdc/stc-1)、ccl23(mpif-1)、ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、ccl25(teck)、ccl26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、ccl3(mip-la)、ccl4(mip-lb)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、ccna1、ccna2、ccnd1、ccne1、ccne2、ccr1(ckr1/hm145)、ccr2(mcp-lrb/ra)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr 13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebi1)、ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)、ccr9(gpr-9-6)、ccrl1(vshk1)、ccrl2(l-ccr)、cd164、cd19、cd1c、cd20、cd200、cd-22、cd24、cd28、cd3、cd37、cd38、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40、cd40l、cd44、cd45rb、cd52、cd69、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd8、cd80、cd81、cd83、cd86、cdh1(e-钙粘蛋白)、cdh10、cdh12、cdh13、cdh18、cdh19、cdh20、cdh5、cdh7、cdh8、cdh9、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk9、cdkn1a(p21wapl/cipl)、cdknib(p27kipl)、cdknic、cdkn2a(pl6ink4a)、cdkn2b、cdkn2c、cdkn3、cebpb、cer1、chga、chgb、几丁质酶、chst10、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、cldn3、cldn7(紧密连接蛋白-7)、cln3、cxclio(ip-io)、cxcl11(i-tac/ip-9)、cxcl12(sdf1)、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2(gr02)、cxcl3(gr03)、cxcl5(ena-78/lix)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr4、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、cyb5、cyc1、cysltr1、cgrp、clq、clr、ci、c4a、c4b、c2a、c2b、c3a、c3b、dab2ip、des、dkfzp451j0118、dncl1、dpp4、e-选择素、e2f1、ecgf1、edg1、efna1、efna3、efnb2、egf、egfr、elac2、eng、enol、en02、en03、ephb4、epo、erbb2(her-2)、ereg、erk8、esr1、esr2、f3(tf)、凝血因子vii、凝血因子ix、凝血因子v、凝血因子vila、凝血因子x、凝血因子xii、凝血因子xiii、fadd、fasl、fasn、fcer1a、fcer2、fcγ受体、fcgr3a、fgf、fgfl(afgf)、fgf10、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf13、fgf14、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2(bfgf)、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf8、fgf9、fgfr3、figf(vegfd)、fil1(ε)、fil1(ζ)、flj12584、flj25530、flrtl(纤连蛋白)、fltl、fos、fosll(fra-1)、fy(darc)、gabrp(gabaa)、gagebl、gagecl、galnac4s-6st、gata3、gdf5、gfil、ggtl、gmcsf、gnas1、gnrh1、gpr2(ccr10)、gpr31、gpr44、gpr81(fksg80)、grcc10(cio)、grp、gsn(凝溶胶蛋白)、gstp1、糖蛋白(gp)ilb/iiia、havcr2、hdac4、hdac5、hdac7a、hdac9、her2、hgf、itgb4(b 4整合素)、jag1、jak1、jak3、jun、k6hf、kai1、kdr、kitlg、klf5(gc box bp)、klf6、klk10、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk9、krt1、krt19(角蛋白19)、krt2a、krthb6(毛发特异性ii型角蛋白)、l-选择素、lama5、lep(瘦素)、lingo-p75、lingo-troy、lps、lta(tnf-b)、ltb、ltb4r(gpr16)、ltb4r2、ltbr、macmarcks、mag或omgp、map2k7(c-jun)、mdk、mib 1、肝素结合细胞因子、mif、mip-2、mki67(ki-67)、mmp2、mmp9、ms4a1、msmb、mt3(金属硫蛋白iii(metallothionectin-iii))、mtssl、mucl(粘蛋白)、myc、myd88、nck2、神经蛋白聚糖、nkg2d、nfkb1、nfkb2、ngf、ngfb(ngf)、ngfr、ngr-lingo、ngr-nogo66(勿动蛋白，nogo)、ngr-p75、ngr-troy、nme1(nm23a)、nox5、nppb、nr0b1、nr0b2、nr1d1、nr1d2、nr1h2、nr1h3、nr1h4、nrii2、nrii3、nr2c1、nr2c2、nr2e1、nr2e3、nr2f1、nr2f2、nr2f6、nr3c1、nr3c2、nr4a1、nr4a2、nr4a3、nr5a1、nr5a2、nr6a1、nrp1、nrp2、nt5e、ntn4、odz1、oprd1、p2rx7、pap、parti、pate、pawr、pca3、pcna、pdgfa、pdgfb、pecam1、pf4(cxcl4)、pge2、pgf、pgr、磷酸酶蛋白聚糖、pias2、pik3cg、纤溶酶原激活物、plau(upa)、plg、plxdc1、ppbp(cxcl7)、ppid、pr1、prkcq、prkdl、prl、proc、蛋白c、prok2、psap、psca、ptafr、pten、ptgs2(cox-2)、ptn、rac2(p21rac2)、rage、rarb、rgsl、rgs13、rgs3、rnfllo(znf144)、rob02、si00a2、scgb1d2(亲脂素b)、scgb2a1(乳腺珠蛋白2)、scgb2a2(乳腺珠蛋白1)、scye1(内皮单核细胞激活细胞因子)、sdf2、serpina1、serpina3、serpinb5(乳腺丝抑蛋白)、serpine1(pai-1)、serpinf1、shbg、sla2、slc2a2、slc33a1、slc43a1、slit2、spp1、sprr1b(sprl)、st6gal1、stab1、stat6、steap、steap2、p物质、tb4r2、tbx21、tcp10、tdgf1、tek、tgfa、tgfb1、tgfb111、tgfb2、tgfb3、tgfbi、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、th1l、thbs1(血小板反应蛋白-1)、thbs2、thbs4、thpo、tie(tie-1)、timp3、组织因子、tlr10、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tnf、tnf-a、tnfaip2(b94)、tnfaip3、tnfrsf11a、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf21、tnfrsf5、tnfrsf6(fas)、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsfio(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，trail)、tnfsf11(trance)、tnfsf12(ap03l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hveml)、tnfsf15(血管内皮生长抑制因子，vegi)、tnfsf18、tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf6(fasl，凋亡相关因子配体)、tnfsf7(cd27配体)、tnfsf8(cd30配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tollip、toll-样受体、top2a(拓扑异构酶iia)、tp53、tpm1、tpm2、tradd、traf1、traf2、traf3、traf4、traf5、traf6、trem1、trem2、trpc6、tslp、tweak、凝血调节蛋白、凝血酶、vegf、vegfb、vegfc、多功能蛋白聚糖、vhl c5、vla-4、xcl1(淋巴细胞趋化因子)、xcl2(scm-lb)、xcr1(gpr5/ccxcr1)、yy1和zfpm2。另一方面，肿瘤靶点选自肿瘤靶向抗原、her1、her2、her3、gd2、癌胚抗原(cea)、表皮生长因子受体活性突变体(egfrviii)、cd133、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、上皮细胞粘附分子(epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、eph受体a4(epha)、酪氨酸蛋白激酶met(cmet)、il-13ra2、微粒体环氧化物水解酶(meh)、mage、间皮素、muc16、muc1、前列腺干细胞抗原(psca)、肾母细胞瘤-1(wt-1)或紧密连接蛋白家族蛋白。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合t细胞标记物。另一方面，t细胞标记物选自ctla-4、pd-1、lag3、s15、b7h3、b7h4、tcr-α、tcr-β或tim-3。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合t细胞活化剂。另一方面，t细胞活化剂选自cd3、41bb或ox40。另一方面，可切割接头是蛋白酶可切割接头。另一方面，可切割接头被以下肿瘤相关蛋白酶切割：mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp21、upa、fapa或组织蛋白酶b。另一方面，可切割接头被在细胞凋亡或炎症相关反应期间上调的蛋白酶切割。另一方面，可切割接头被半胱氨酸蛋白酶切割。另一方面，半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶1、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶3、半胱氨酸蛋白酶4、半胱氨酸蛋白酶5、半胱氨酸蛋白酶6、半胱氨酸蛋白酶7、半胱氨酸蛋白酶8、半胱氨酸蛋白酶9、半胱氨酸蛋白酶10、半胱氨酸蛋白酶11和半胱氨酸蛋白酶12。另一方面，可切割接头不掩蔽抗原结合位点。另一方面，aab还包含与aab缀合的试剂。另一方面，aab还包含连接于aab或fc区的细胞因子，或在与aab或fc区的融合蛋白中的细胞因子。另一方面，细胞因子选自以下中的至少一种：生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、tnf-a、米勒管抑制因子、促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、促血小板生成素(tpo)、神经生长因子、血小板生长因子、胎盘生长因子、转化生长因子(tgf)、胰岛素样生长因子-1和-11、促红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子(csf)、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、cd27l、cd30l、fasl、4–1bbl、ox40l、trail、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-18、il-21、il-22、il-23、il-33、ifn-a、ifn-b、ifn-g、ifn-g诱导因子(igif)、骨形态发生蛋白(bmp)、白血病抑制因子(lif)或kit配体(kl)。另一方面，aab具有/选自seq id no.：1、2或3。另一方面，试剂是以下中的至少一种：毒素或其毒性片段、微管抑制剂、核酸损伤剂、可检测的部分或诊断试剂。20.在另一个实施方案中，本发明包括包含可激活ab的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明包括降低可激活ab针对正常组织的结合活性并且靶向癌细胞的方法，其包括将有效量的可激活ab给予有其需要的受试者。在另一个实施方案中，本发明包括治疗癌症、减轻癌症症状或延缓癌症进程的方法，其包括将有效量的可激活ab给予有其需要的受试者。一方面，癌症是表达切割可切割接头的酶的癌症。另一方面，癌症选自膀胱癌、骨癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖癌症或尿路上皮癌。另一方面，癌症选自由以下癌症组成的组：急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、b细胞淋巴瘤、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、食道癌、去势抵抗性前列腺癌(crpc)、宫颈癌、胆管癌、慢性髓细胞性白血病、结直肠腺癌、结直肠癌(crc)、食管癌、胃腺癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔b细胞淋巴瘤、肝细胞癌(hcc)、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、黑色素瘤(mel)、间皮瘤、非鳞状nsclc、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肾细胞癌(rcc)、肉瘤、皮肤黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体子宫内膜样癌和葡萄膜黑色素瘤。21.在另一个实施方案中，本发明包括可激活抗体(aab)，其依次包含以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；并且其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的抗原结合位点；其中可切割接头的切割释放第一重链，以与结合第一抗原的第一轻链形成抗体结合位点。另一方面，aab还分别包含第一轻链恒定区或第一重链恒定区中的至少一个。另一方面，aab还包含连接到第一重链恒定区的fc区，其中fc区是野生型或改变fc受体结合的突变结构域，第二重链可变区和第二fc区，或第二重链可变区和第二fc区和不可切割的柔性接头和第二轻链可变区和第二重链可变区，或第二fc区和不可切割的柔性接头和细胞因子。另一方面，aab还包含第二抗体结合位点，其由第二轻链可变区和连接到结合第二抗原的第一重链的第二轻链恒定区形成，以及任选地包含在第二轻链可变区和第二轻链恒定区之间的柔性不可切割接头。另一方面，aab还包含第一重链恒定区、第一重链恒定区中的至少一个，或两者。另一方面，fc区是野生型fc区、突变fc区、单体野生型fc区、单体突变fc区、二聚体野生型fc区或二聚体突变fc区。另一方面，aab还包含连接于aab或fc区的细胞因子，或在与aab或fc区的融合蛋白中的细胞因子。另一方面，细胞因子选自以下中的至少一种：生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、tnf-a、米勒管抑制因子、促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、促血小板生成素(tpo)、神经生长因子、血小板生长因子、胎盘生长因子，转化生长因子(tgf)、胰岛素样生长因子-1和-11、促红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子(csf)、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、cd27l、cd30l、fasl、4-1bbl、ox40l、trail、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-18、il-21、il-22、il-23、il-33、ifn-a、ifn-β、ifn-γ、ifn-γ诱导因子(igif)、骨形态发生蛋白(bmp)、白血病抑制因子(lif)或kit配体(kl)。另一方面，第一抗原是选自以下的组织特异性表面抗原：icam1、vcam1、epcam、纤维连接蛋白的额外结构域b、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、黑素瘤相关蛋白聚糖(mapg)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmv-maa)、前列腺特异性膜抗原(psma)、表皮生长因子受体(egfr)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、细胞粘附分子(cam)、人b细胞成熟靶点(bcma)、胎盘生长因子(plgf)、叶酸受体、胰岛素样生长因子受体(ilgfr)、cd133、cd40、cd37、cd33、cd30、cd28、cd24、cd23、cd22、cd21、cd20、cd19、cd13、cd10、her3、her2、非肌肉肌球蛋白重链a型(nmmhca)、转铁蛋白、上皮细胞粘附分子(epcam)、膜联蛋白a 1、核仁素、腱生蛋白、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2、(vegfr-2)、氨肽酶n、tie-1、tie-2或c-met。另一方面，第一抗原选自蛋白、蛋白的一部分或肽，所述蛋白、蛋白的一部分或肽由选自以下中的至少一种基因编码：abcf1、acvr1、acvr1b、acvr2、acvr2b、acvrl1、adora2a、聚集蛋白聚糖、agr2、aicda、aif1、aig1、akap1、akap2、amh、amhr2、angpt1、angpt2、angptl3、angptl4、anpep、apc、apoc1、ar、azgp1(锌α糖蛋白)、b7.1、b7.2、bad、baff、bag1、bai1、bcl2、bcl6、bdnf、blnk、blr1(mdr15)、blys、bmp1、bmp2、bmp3b(gdf10)、bmp4、bmp6、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmpr2、bpag1(网蛋白)、brca1、c19orfl0(il27w)、c3、c4a、c5、c5r1、cant1、casp1、casp4、cav1、ccbp2(d6/jab61)、ccl1(1-309)、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、ccl13(mcp-4)、ccl15(mip-1d)、ccl16(hcc-4)、ccl17(tarc)、ccl18(parc)、ccl19(mip-3b)、ccl2(mcp-1)、mcaf、ccl20(mip-3a)、ccl21(mip-2)、slc、exodus-2、ccl22(mdc/stc-1)、ccl23(mpif-1)、ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、ccl25(teck)、ccl26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、ccl3(mip-la)、ccl4(mip-lb)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、ccna1、ccna2、ccnd1、ccne1、ccne2、ccr1(ckr1/hm145)、ccr2(mcp-lrb/ra)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebi1)、ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)、ccr9(gpr-9-6)、ccrl1(vshk1)、ccrl2(l-ccr)、cd164、cd19、cd1c、cd20、cd200、cd-22、cd24、cd28、cd3、cd37、cd38、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40、cd40l、cd44、cd45rb、cd52、cd69、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd8、cd80、cd81、cd83、cd86、cdh1(e-钙粘蛋白)、cdh10、cdh12、cdh13、cdh18、cdh19、cdh20、cdh5、cdh7、cdh8、cdh9、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk9、cdkn1a(p21wapl/cipl)、cdknib(p27kipl)、cdknic、cdkn2a(pl6ink4a)、cdkn2b、cdkn2c、cdkn3、cebpb、cer1、chga、chgb、几丁质酶、chst10、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、cldn3、cldn7(紧密连接蛋白-7)、cln3、cxclio(ip-io)、cxcl11(i-tac/ip-9)、cxcl12(sdf1)、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2(gr02)、cxcl3(gr03)、cxcl5(ena-78/lix)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr4、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、cyb5、cyc1、cysltr1、cgrp、clq、cir蛋白、ci、c4a、c4b、c2a、c2b、c3a、c3b、dab2ip、des、dkfzp451j0118、dncl1、dpp4、e-选择素、e2f1、ecgf1、edg1、efna1、efna3、efnb2、egf、egfr、elac2、eng、enol、en02、en03、ephb4、epo、erbb2(her-2)、ereg、erk8、esr1、esr2、f3(tf)、凝血因子vii、凝血因子ix、凝血因子v、凝血因子viia、凝血因子x、凝血因子xii、凝血因子xiii、fadd、fasl、fasn、fcer1a、fcer2、fcγ受体、fcgr3a、fgf、fgfl(afgf)、fgf10、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf13、fgf14、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2(bfgf)、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf8、fgf9、fgfr3、figf(vegfd)、fil1(ε)、fil1(ζ)、flj12584、flj25530、flrtl(纤连蛋白)、fltl、fos、fosll(fra-1)、fy(darc)、gabrp(gabaa)、gagebl、gagecl、galnac4s-6st、gata3、gdf5、gfil、ggtl、gmcsf、gnas1、gnrh1、gpr2(ccr10)、gpr31、gpr44、gpr81(fksg80)、grcc10(cio)、grp、gsn(凝溶胶蛋白)、gstp1、糖蛋白ilb、糖蛋白iiia、havcr2、hdac4、hdac5、hdac7a、hdac9、her2、hgf、hif1a、hip1、组胺和组胺受体、hla-a、hla-dra、hm74、hmgb1、hmox1、humcyt2a、iceberg、icosl、id2、ifn-α、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifnb1、ifn-γ、ifnw1、igbp1、igf1、igf1r、igf2、igfbp2、igfbp3、igfbp6、il-1、il1a、il1b、il10、il10ra、il10rb、il11、il11ra、il-12、il12a、il12b、il12rb1、il12rb2、il13、il13ra1、il13ra2、il14、il15、il15ra、il16、il17、il17b、il17c、il17r、il18、il18bp、il18r1、il18rap、il19、ilia、il1b、il1f10、il1f5、il1f6、il1f7、il1f8、il1f9、il1hy1、il1r1、il1r2、il1rap、il1rapl1、il1rapl2、il1rl1、il1rl2、il1rn、il2、il20、il20ra、il21r、il22、il22r、il22ra2、il23、il24、il25、il26、il27、il28a、il28b、il29、il2ra、il2rb、il2rg、il3、il30、il3ra、il4、il4r、il5、il5ra、il6、il6r、il6st(糖蛋白130)、il7、il7r、il8、il8ra、il8rb、il8rb、il9、il9r、ilk、inha、inhba、insl3、insl4、iraki、irak2、itga1、itga2、itga3、itga6(a6整合素)、itgav、itgb3、itgb4(b 4整合素)、jag1、jak1、jak3、jun、k6hf、kai1、kdr、kitlg、klf5(gc box bp)、klf6、klk10、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk9、krt1、krt19(角蛋白19)、krt2a、krthb6(毛发特异性ii型角蛋白)、l-选择素、lama5、lep(瘦素)、lingo-p75、lingo-troy、lps、lta(tnf-b)、ltb、ltb4r(gpr16)、ltb4r2、ltbr、macmarcks、mag或omgp、map2k7(c-jun)、mdk、mib1、肝素结合细胞因子、mif、mip-2、mki67(ki-67)、mmp2、mmp9、ms4a1、msmb、mt3(金属硫蛋白iii)、mtssl、mucl(粘蛋白)、myc、myd88、nck2、神经蛋白聚糖、nkg2d、nfkb1、nfkb2、ngf、ngfb(ngf)、ngfr、ngr-lingo、ngr-nogo66(nogo)、ngr-p75、ngr-troy、nme1(nm23a)、nox5、nppb、nr0b1、nr0b2、nr1d1、nr1d2、nr1h2、nr1h3、nr1h4、nrii2、nrii3、nr2c1、nr2c2、nr2e1、nr2e3、nr2f1、nr2f2、nr2f6、nr3c1、nr3c2、nr4a1、nr4a2、nr4a3、nr5a1、nr5a2、nr6a1、nrp1、nrp2、nt5e、ntn4、odz1、oprd1、p2rx7、pap、parti、pate、pawr、pca3、pcna、pdgfa、pdgfb、pecam1、pf4(cxcl4)、pge2、pgf、pgr、磷酸酶蛋白聚糖、pias2、pik3cg、纤溶酶原激活物、plau(upa)、plg、plxdc1、ppbp(cxcl7)、ppid、pr1、prkcq、prkdl、prl、proc、蛋白c、prok2、psap、psca、ptafr、pten、ptgs2(cox-2)、ptn、rac2(p21rac2)、rage、rarb、rgsl、rgs13、rgs3、rnfllo(znf144)、rob02、si00a2、scgb1d2(亲脂素b)、scgb2a1(乳腺珠蛋白2)、scgb2a2(乳腺珠蛋白1)、scye1(内皮单核细胞激活细胞因子)、sdf2、serpina1、serpina3、serpinb5(乳腺丝抑蛋白)、serpine1(pai-1)、serpinf1、shbg、sla2、slc2a2、slc33a1、slc43a1、slit2、spp1、sprr1b(sprl)、st6gal1、stab1、stat6、steap、steap2、p物质、tb4r2、tbx21、tcp10、tdgf1、tek、tgfa、tgfb1、tgfb111、tgfb2、tgfb3、tgfbi、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、th1l、thbs1(血小板反应蛋白-1)、thbs2、thbs4、thpo、tie(tie-1)、timp3、组织因子、tlr10、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tnf-α、tnfaip2(b94)、tnfaip3、tnfrsf11a、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf21、tnfrsf5、tnfrsf6(fas)、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsfio(trail)、tnfsf11(trance)、tnfsf12(ap03l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hveml)、tnfsf15(vegi)、tnfsf18、tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf6(fasl)、tnfsf7(cd27配体)、tnfsf8(cd30配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tollip、toll-样受体、top2a(拓扑异构酶iia)、tp53、tpm1、tpm2、tradd、traf1、traf2、traf3、traf4、traf5、traf6、trem1、trem2、trpc6、tslp、tweak、凝血调节蛋白、凝血酶、vegf、vegfb、vegfc、多功能蛋白聚糖、vhl c5、vla-4、xcl1(淋巴细胞趋化因子)、xcl2(scm-lb)、xcr1(gpr5/ccxcr1)、yy1和zfpm2。另一方面，第一抗原和第二抗原是以下中的至少一个：相同的抗原；第一抗原和第二抗原不同；或者第一抗原和第二抗原是相同的抗原，但第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合相同抗原的不同表位。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合肿瘤靶点。另一方面，肿瘤靶点选自肿瘤靶向抗原、her1、her2、her3、gd2、癌胚抗原(cea)、表皮生长因子受体活性突变体(egfrviii)、cd133、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、上皮细胞粘附分子(epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、eph受体a4(epha)、酪氨酸蛋白激酶met(cmet)、il-13ra2、微粒体环氧化物水解酶(meh)、mage、间皮素、muc16、muc1、前列腺干细胞抗原(psca)、肾母细胞瘤-1(wt-1)或紧密连接蛋白家族成员。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合t细胞标记物。另一方面，t细胞标记物选自ctla-4、pd-1、lag3、s15、b7h3、b7h4、tcr-α、tcr-β、tim-3。另一方面，第一抗原结合位点或第二抗原结合位点结合t细胞激活剂。另一方面，t细胞激活剂选自cd3、41bb或ox40。另一方面，可切割接头是蛋白酶可切割接头。另一方面，可切割接头被以下肿瘤相关蛋白酶切割：mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp9、mmp10、mmp11、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp21、upa、fapa或组织蛋白酶b。另一方面，可切割接头被在细胞凋亡或炎症相关反应期间上调的蛋白酶切割。另一方面，可切割接头被半胱氨酸蛋白酶切割。另一方面，半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶1、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶3、半胱氨酸蛋白酶4、半胱氨酸蛋白酶5、半胱氨酸蛋白酶6、半胱氨酸蛋白酶7、半胱氨酸蛋白酶8、半胱氨酸蛋白酶9、半胱氨酸蛋白酶10、半胱氨酸蛋白酶11和半胱氨酸蛋白酶12。另一方面，可切割接头不掩蔽抗原结合位点。另一方面，aab还包含与aab缀合的试剂。另一方面，所述试剂是以下中的至少一种：毒素或其毒性片段、微管抑制剂、核酸损伤剂、可检测的一部分或诊断试剂。另一方面，aab选自seq id no.：1、2或3。22.在另一个实施方案中，本发明包括编码可激活抗体(aab)的核酸，所述可激活抗体(aab)依次包含以下结构：包含第一轻链可变区第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的第一抗原结合位点；以及其中可切割接头的切割释放第一重链以实现形成第一抗原结合位点，以结合第一抗原。23.在另一个实施方案中，本发明包括编码可激活抗体(aab)的核酸，所述可激活抗体依次包含以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；以及其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的抗原结合位点；其中可切割接头的切割释放第一重链以与结合第一抗原的第一轻链形成抗体结合位点。24.在另一个实施方案中，本发明包括包含编码可激活抗体(aab)的核酸的细胞，所述可激活抗体(aab)依次包含以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的第一抗原结合位点；以及其中可切割接头的切割释放第一重链以实现形成第一抗原结合位点，以结合第一抗原。25.在另一个实施方案中，本发明包括包含编码可激活抗体(aab)的核酸的细胞，所述可激活抗体(aab)依次包括以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；以及其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的抗原结合位点；其中可切割接头的切割释放第一重链以与结合第一抗原的第一轻链形成结合抗体结合位点。26.在另一个实施方案中，本发明包括包含可激活ab和载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明包括降低抗体对正常组织的结合活性并且靶向癌细胞的方法，其包括将有效量的可激活ab给予有其需要的受试者。27.在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗癌症、减轻癌症症状或延缓癌症进程的方法，其包括将有效量的可激活ab给予有其需要的受试者。一方面，癌症是表达切割可切割接头的酶的癌症。另一方面，癌症选自膀胱癌、骨癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖癌症或尿路上皮癌。另一方面，癌症选自由以下癌症组成的组：急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、b细胞淋巴瘤、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、食道癌、去势抵抗性前列腺癌(crpc)、宫颈癌、胆管癌、慢性髓细胞性白血病、结直肠腺癌、结直肠癌(crc)、食管癌、胃腺癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔b细胞淋巴瘤、肝细胞癌(hcc)、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、黑色素瘤(mel)、间皮瘤、非鳞状nsclc、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤、前列腺癌、肾细胞癌(rcc)、肉瘤、皮肤黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、胸腺瘤、甲状腺乳头状癌、子宫癌肉瘤、子宫体子宫内膜样癌和葡萄膜黑色素瘤。28.在另一个实施方案中，本发明包括可激活抗体(aab)，其依次包含：第一轻链可变区；可切割接头；和第一重链可变区；和fc区；其中可切割接头阻止第一轻链可变区和第一重链可变区形成针对第一抗原的第一抗原结合位点，其中可切割接头不掩蔽抗原结合位点；并且其中可切割接头的切割释放第一重链可变区以实现形成结合第一抗原的第一抗原结合位点。29.在另一个实施方案中，本发明包括表达可激活抗体(aab)的细胞，所述可激活抗体依次包含以下结构：包含第一轻链可变区的第一轻链；可切割接头；包含第一重链可变区的第一重链；其中可切割接头阻止或减少第一轻链和第一重链形成针对第一抗原的第一抗原结合位点；并且其中可切割接头的切割释放第一重链以实现形成第一抗原结合位点，以结合第一抗原。一方面，细胞是t细胞或间充质干细胞。另一方面，aab还包括跨膜序列，所述跨膜序列将aab锚定到t细胞表面以形成嵌合抗原受体，其中细胞是car t细胞。30.附图简述31.为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，其中：32.图1显示蛋白的示意图和显示前抗体设计如何在切割后恢复抗原结合能力的图。图1a为aab的示意图。图1b显示第一种类型的抗原结合激活。cl和vh与对mmp14敏感的蛋白水解接头相连。vh在切割前不能与vl配对以形成稳定的抗原结合位点。vh在被mmp14切割后释放，并能够与vl配对以形成抗原结合位点。图1c显示第二种类型的抗原结合激活。第一fc和vh与对mmp14敏感的蛋白水解接头连接。vh在切割前不能与vl配对以形成稳定的抗原结合位点。vh在被mmp14切割后被释放，并能够与vl配对以形成抗原结合位点。33.图2：在用mmp14切割接头后，前抗-cldn18.2-fc恢复抗原结合能力。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2-fc与表达cldn18.2的katoiii细胞的结合与阳性对照一样强。未切割蛋白的结合比阳性对照弱约100倍。34.图3：在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3恢复抗原结合能力。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3与表达cldn18.2的katoiii细胞的结合比未切割蛋白的强20倍以上。35.图4：在mmp14切割后，双特异性前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3对t细胞的活化比未切割蛋白的强10倍以上。在有或没有mmp14切割的情况下，报告jurkat细胞与katoiii细胞和前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3混合。孵育24小时后，通过荧光素酶的产生来测量t细胞的活化水平。36.图5：在用mmp14切割后，前抗-hctla4 scfv-fc与表面包被的hctla4蛋白的结合比未切割蛋白强10倍以上。37.图6：在用mmp14切割接头后，前抗-cldn18.2克隆2恢复抗原结合能力。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2克隆2与表达cldn18.2的katoiii的结合比未切割蛋白的强约100倍。38.图7：在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3 scfab恢复hcd3e结合能力。elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3 scfab与表面包被的hcd3e的结合比未切割蛋白的强20倍以上。39.图8：在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3(aab7)恢复hcd3e结合能力。elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3(aab7)与被包被的hcd3e的结合比未切割蛋白的强10倍以上。40.图9：在用mmp14切割接头后，前抗-hctla4(aab7)恢复抗原结合能力。基于流式细胞术的结合试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hctla4(aab7)与表达hctla4的细胞的结合与阳性对照一样强，而未切割蛋白显示几乎没有结合。41.图10：在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3(aab7)恢复刺激t细胞活化的能力。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3(aab7)对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。42.图11：在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-hpd-l1恢复刺激t细胞活化的能力。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-hpd-l1对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。43.图12：在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-cldn18.2 scfv恢复刺激t细胞活化的能力。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-cldn18.2scfv对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。44.图13：在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-前抗-hpd-l1恢复刺激pbmc中t细胞活化的能力。在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-前抗-hpd-l1对pbmc中t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过ifn-γ产生来测量。45.图14：在用mmp14切割接头后，前抗-hctla4(aab1)-fc恢复抗原结合能力。基于流式细胞术的结合试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hctla4(aab1)-fc对表达hctla4细胞的结合与阳性对照一样强，而未切割蛋白显示几乎没有结合。46.发明详述47.虽然以下详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用，但是应理解的是本发明提供了许多可应用的发明构思，其可以体现在很多处具体上下文中。本文讨论的具体实施方案仅说明形成和使用本发明的具体方式，而不限制本发明的范围。48.为了便于理解本发明，以下定义了多个术语。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”不旨在仅指代单一实体，而是包括其可以使用具体实例说明的大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不限制本发明，除非在权利要求中概述。49.治疗性单克隆抗体已被开发用于治疗包括癌症在内的各种人类疾病。在癌症治疗中，例如，抗ctla4抗体或抗cd3抗体已经被用于通过降低肿瘤微环境中的免疫抑制信号来活化t细胞。然而，由于脱靶ag-ab相互作用导致的全身性t细胞过活化导致严重不良事件。针对肿瘤相关抗原(taa)的抗体通常靶向表达相同抗原的非肿瘤组织。在现有技术的抗ctla4可激活抗体的情况下，除了可切割接头之外，构建体还添加了合成的/外来的外源多肽(掩蔽部分)两者来阻断抗ctla-4的活性。这两种额外的多肽会导致对接头的免疫反应，此外，接头的切割并不确保掩蔽部分从抗原结合位点释放。50.本发明通过消除掩蔽部分的使用，降低单克隆抗体疗法的脱靶毒性，从而提高患者的治疗指数和药物耐受性。人们发现，在药物到达肿瘤之前，本文教导的前抗体几乎没有活性至没有活性，因此产生长半衰期、蛋白稳定性和可制造性。新的前抗体被设计成用短接头缩短抗体的重链和轻链，所述短接头减少与靶向分子的结合。由于该短接头对肿瘤相关蛋白酶敏感，因此当接头被切割时，它恢复重链和轻链的拓扑位置，并因此恢复它对肿瘤组织处的靶点的结合亲和性。51.如本文所使用的，术语“可激活抗体”、“aab”、“前抗体(pro-antibody)”或“前抗体(probody)”是指一种融合蛋白，其包括被可切割接头分开的抗体抗原结合结构域。融合蛋白的基本结构从氨基到羧基包括：轻链可变区-可切割接头-重链可变区或重链可变区-可切割接头-轻链可变区。第一融合蛋白可以与靶向第二抗原的第二融合蛋白共表达，而第一融合蛋白结合第一抗原。第一和第二抗原可以是相同的抗原，不同的抗原，或者甚至可以是相同的抗原，但结合抗原的不同表位。融合蛋白还可以包括以下中的一种或多种：轻链恒定区、重链恒定区、fc区(野生型或突变的)、fc和第二蛋白(例如细胞因子)之间的第二接头。52.编码aab的核酸可以是用于在宿主细胞，如细菌、真菌、植物或哺乳动物细胞中表达aab的载体的一部分。53.如本文所使用的，术语“抗体”或“(多种)抗体肽”是指完整抗体，或其与完整抗体竞争特异性结合的结合片段。结合片段由dna重组技术产生，或由完整抗体的酶促或化学切割产生。结合片段包括fab、fab’、f(ab’)2、fv和单链可变片段(scfv)抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体之外的抗体被理解为具有相同的结合位点。当过量的抗体使与反受体结合的受体的量降低至少约20％、40％、60％或80％，以及更通常大于约85％(如在体外竞争性结合试验中所测量的)时，抗体实质上抑制了受体与反受体的结合。54.如本文所使用的，术语“双特异性”或“双功能”抗体被理解为具有两个不同的抗原结合位点。例如，本发明的双特异性抗体将包括两个不同的抗原结合结构域，例如分别与第一和第二抗原各自结合的第一和第二抗原结合结构域。双特异性抗体还可以具有两个不同的抗原结合区，它们结合相同的抗原，但在两个不同的表位处。更常见的是，双特异性抗体将结合两种不同的抗原。第一或第二抗原通常将是肿瘤特异性抗原，而另一种抗原结合区与t细胞上的t细胞活化分子结合。55.如本文所使用的，术语“抗体”以最广泛的意义使用，具体涵盖单克隆抗体(包括全长抗体或其他含fc区的二价抗体，如二价scfv fc融合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(如fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv)，只要它们表现出所需的生物活性。抗体(ab)和免疫球蛋白(ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定抗原表现出结合特异性，但是免疫球蛋白既包括抗体，也包括其他缺乏抗原特异性的抗体样分子。例如，后一种多肽由淋巴系统以低水平产生，而由骨髓瘤以升高的水平产生。本发明包括完全重组的单克隆抗体(及其结合片段)，换言之，其中互补决定区(cdr)被基因拼接成人抗体骨架，通常被称为镶饰抗体。因此，在某些方面，单克隆抗体是完全合成的抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体(及其结合片段)可在细菌或真核细胞，包括植物细胞中制备。56.如本文所使用的，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区，并且包括fab、fab’、f(ab’)2、fv和scfv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为fab片段，每个片段都有单一的抗原结合位点，和残留的“fc”片段，之所以这么称呼是因为其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab’)2片段，其含有两个能够交联抗原的抗原结合片段，和残留的其他片段(其称为pfc’)。如本文所用的，就抗体而言，“功能片段”是指fv、f(ab)和f(ab’)2片段。57.如本文所使用的，“fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密的、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体(vh-vl二聚体)组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用，以在vh-vl二聚体表面上限定抗原结合位点。六个cdr共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单一的可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管是以低于完整的结合位点的亲和力。58.fab片段，也被称为f(ab)，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab’片段与fab片段的不同之处在于，在重链ch1结构域的羧基端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’–sh在本文中是对fab’的命名，其中恒定结构域的(多个)半胱氨酸残基具有游离的硫醇基团。f(ab’)片段是通过对f(ab’)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键的切割产生的。抗体片段的其他化学偶联对本领域普通技术人员来说是已知的。59.天然抗体和免疫球蛋白通常是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连。而在不同免疫球蛋白亚型的重链之间，二硫键的数目不相同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端有一个可变结构域(vh)，其后是若干恒定结构域。每条轻链在一端有一个可变结构域(vl)和在它的另一端有一个恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面(clothia et al.，j.mol.biol.186，651-66，1985)；novotny和haber，proc.natl.；acad.sci.usa 82 4592-4596(1985)，相关部分通过引用并入本文。60.如本文所使用的，“分离的”抗体是已经从其被产生的环境的组分中被鉴定、分离和/或回收的抗体。其产生环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可能包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在某些实施方案中，抗体将被纯化为通过至少三种不同的方法可测量的：1)至如通过劳里(lowry)法测定的大于50重量％的抗体，例如大于75重量％，或大于85重量％，或大于95重量％，或大于99重量％；2)至足以通过使用旋杯式测序仪(spinning cup sequentator)获得至少10个n端或内部氨基酸序列的残基的程度，例如至少15个序列残基；或3)至通过sds-page在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝(coomasie blue)或优选使用银染色确定的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。61.如本文所用的，术语“抗体突变体”是指其中一个或多个氨基酸残基被修饰的抗体的氨基酸序列变体。这样的突变体必需具有小于100％的与这样的氨基酸序列的序列同一性或相似性，即所述氨基酸序列具有至少75％的与抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性，例如至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95、96、97、98或99％。62.如本文所使用的，术语“可变的”在抗体可变结构域的语境中是指在抗体之间，可变结构域的某些部分在序列上存在着广泛的差异，并且被用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并不是贯穿抗体的可变结构域均匀分布的。它集中在轻链和重链可变结构域的三个片段，称为互补决定区(cdr)，也被称为高变区。至少有两种确定cdr的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，kabat等人，sequences of proteins of immunological interest(national institute of health,bethesda,md.1987)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(chothia,c.等人(1989),nature 342:877)，或两种方法，即chothia加kabat。可变结构域中更高度保守的部分被称为框架(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各包含4个fr区，主要采用β-折叠构型，由3个cdr连接，其形成环连接，以及在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链上的cdr被fr区极接近地保持在一起，并与另一条链上的cdr一起，促进抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等人)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒性。63.来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链可以基于其恒定结构域的氨基序列被划分至两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。[0064]“免疫球蛋白”可以根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，划分至不同的类别。有至少有五(5)个主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，这些中的几个还可以还划分为亚类(亚型)，如igg-1、igg-2、igg-3和igg4；iga-1和iga-2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。[0065]如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能自然发生的突变外，该群包含的单一抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制剂(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是从基本上均质的抗体群获得的，不应被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。例如，根据当前公开和要求保护的发明所使用的单克隆抗体可以由kohler和milstein首次描述的杂交瘤方法制成，nature 256,495(1975)，相关部分通过引用并入本文。[0066]根据当前公开和要求保护的发明使用的所有单克隆抗体将是：(1)如本文以下更详细地描述的目的性免疫方案的结果；或(2)免疫反应的结果，所述免疫反应导致在疾病或癌症过程中自然产生抗体。[0067]当前公开和要求保护的发明的单克隆抗体的使用可能需要将这样的或类似的单克隆抗体施用于受试者，如人。然而，当单克隆抗体在非人动物，如啮齿动物或鸡中产生时，向人患者给予这样的抗体通常会引起免疫反应，其中免疫反应是针对抗体本身的。这样的反应限制了这样的疗法的持续时间和有效性。为了克服这样的问题，当前公开和要求保护的发明的单克隆抗体可以被“人源化”，也就是说，对抗体进行工程化，使得其抗原部分被去除，并且人抗体的类似部分取代它，同时保留对特定抗原的抗体亲和力。这种工程化可能只涉及几个氨基酸，或者可能包括抗体的整个框架区域，只留下抗体的互补决定区完整。几种人源化抗体的方法在本领域中是已知的，并公开于于2001年1月30日授予queen等人的第6,180,370号美国专利；于2000年4月25日授予brickell的第6,054,927号美国专利；于1999年2月9日授予studnicka的第5,869,619号美国专利；于1999年1月19日授予lin的第5,861,155号美国专利；于1998年1月27日授予rodriquez等人的第5,712,120号美国专利；于1989年3月28日授予cabilly等人的第4,816,567号美国专利；相关部分通过引用并入本文。[0068]抗体的人源化形式是主要由人免疫球蛋白的序列组成，并包含来自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化可以按照winter和同事的方法进行(jones等人，1986；riechmann等人，1988；verhoeyen等人，1988)，通过将非人(即啮齿动物、鸡)cdr或cdr序列替换为人抗体的相应序列(另外参见第5,225,539号美国专利)。在某些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被来自供体抗体的相应的非人残基所取代。人源化抗体还可以包含既不存在于受体抗体中，也不存在于输入的cdr或框架序列中的残基。一般来说，人源化抗体将包含至少一个，以及通常是两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的cdr区域对应于非人免疫球蛋白的cdr区域，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最好还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。[0069]本发明的aab也可以包含在抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)、抗体依赖性中性粒细胞吞噬作用(adnp)或抗体依赖性补体沉积(adcd)功能中赋予优选的活性水平的工程化序列或糖基化位点，所述优选的活性水平如通过基于珠或基于细胞的测定或动物模型的体内研究所测量的。[0070]aab可以是单链可变片段(scfv)，它是免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合体。该嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去掉了恒定区，并在两个抗原结合结构域之间引入了接头肽。该修饰通常使特异性在接头切割后保持不变。这些分子在历史上是为了促进噬菌体展示而创造的，在噬菌体展示中，将抗原结合结构域表达为单个肽是非常方便的。scfv可以直接从源自杂交瘤或b细胞的重链和轻链亚克隆而生成。单链可变片段缺失完整抗体分子中存在的恒定fc区，并因此缺失用于纯化抗体的共同结合位点(例如蛋白a/g)。由于protein l与κ轻链的可变区相互作用，这些片段通常可以用protein l纯化/固定。[0071]本发明包括靶向特定抗原的可激活抗体(也称为前抗体(pro-antibody)或前抗体(probody))。抗原的实例包括第一抗原，其是选自以下的组织特异性表面抗原：icam1、vcam1、epcam、纤维连接蛋白的额外结构域b、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、黑素瘤相关蛋白聚糖(mapg)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmv-maa)、前列腺特异性膜抗原(psma)、表皮生长因子受体(egfr)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、细胞粘附分子(cam)、人b细胞成熟靶点(bcma)、胎盘生长因子(plgf)、叶酸受体、胰岛素样生长因子受体(ilgfr)、cd133、cd40、cd37、cd33、cd30、cd28、cd24、cd23、cd22、cd21、cd20、cd19、cd13、cd10、her3、her2、非肌肉肌球蛋白重链a型(nmmhca)、转铁蛋白、上皮细胞粘附分子(epcam)、膜联蛋白a1、核仁素、腱生蛋白、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)、氨肽酶n、tie-1、tie-2或c-met。其他抗原包括蛋白、蛋白的一部分或肽，所述蛋白、蛋白的一部分或肽由选自以下中的至少一个基因编码：abcf1、acvr1、acvr1b、acvr2、acvr2b、acvrl1、adora2a、聚集蛋白聚糖、agr2、aicda、aif1、aig1、akap1、akap2、amh、amhr2、angpt1、angpt2、angptl3、angptl4、anpep、apc、apoc1、ar、azgp1、b7.1、b7.2、bad、baff、bag1、bai1、bcl2、bcl6、bdnf、blnk、blr1(mdr15)、blys、bmp1、bmp2、bmp3b(gdf10)、bmp4、bmp6、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmpr2、bpag1(网蛋白)、brca1、c19orfl0(il27w)、c3、c4a、c5、c5r1、cant1、casp1、casp4、cav1、ccbp2(d6/jab61)、ccl1(1-309)、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、ccl13(mcp-4)、ccl15(mip-1d)、ccl16(hcc-4)、ccl17(tarc)、ccl18(parc)、ccl19(mip-3b)、ccl2(mcp-1)、mcaf、ccl20(mip-3a)、ccl21(mip-2)、slc、exodus-2、ccl22(mdc/stc-1)、ccl23(mpif-1)、ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、ccl25(teck)、ccl26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、ccl3(mip-la)、ccl4(mip-lb)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、ccna1、ccna2、ccnd1、ccne1、ccne2、ccr1(ckr1/hm145)、ccr2(mcp-lrb/ra)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr 13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebi1)、ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)、ccr9(gpr-9-6)、ccrl1(vshk1)、ccrl2(l-ccr)、cd164、cd19、cd1c、cd20、cd200、cd-22、cd24、cd28、cd3、cd37、cd38、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40、cd40l、cd44、cd45rb、cd52、cd69、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd8、cd80、cd81、cd83、cd86、cdh1(e-钙粘蛋白)、cdh10、cdh12、cdh13、cdh18、cdh19、cdh20、cdh5、cdh7、cdh8、cdh9、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk9、cdkn1a(p21wapl/cipl)、cdknib(p27kipl)、cdknic、cdkn2a(pl6ink4a)、cdkn2b、cdkn2c、cdkn3、cebpb、cer1、chga、chgb、几丁质酶、chst10、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、cldn3、cldn7(紧密连接蛋白-7)、cln3、cxclio(ip-io)、cxcl11(i-tac/ip-9)、cxcl12(sdf1)、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2(gr02)、cxcl3(gr03)、cxcl5(ena-78/lix)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr4、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、cyb5、cyc1、cysltr1、cgrp、clq、clr、ci、c4a、c4b、c2a、c2b、c3a、c3b、dab2ip、des、dkfzp451j0118、dncl1、dpp4、e-选择素、e2f1、ecgf1、edg1、efna1、efna3、efnb2、egf、egfr、elac2、eng、enol、en02、en03、ephb4、epo、erbb2(her-2)、ereg、erk8、esr1、esr2、f3(tf)、凝血因子vii、凝血因子ix、凝血因子v、凝血因子vila、凝血因子x、凝血因子xii、凝血因子xiii、fadd、fasl、fasn、fcer1a、fcer2、fcγ受体、fcgr3a、fgf、fgfl(afgf)、fgf10、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf13、fgf14、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf2(bfgf)、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf8、fgf9、fgfr3、figf(vegfd)、fil1(ε)、fil1(ζ)、flj12584、flj25530、flrtl(纤连蛋白)、fltl、fos、fosll(fra-1)、fy(darc)、gabrp(gabaa)、gagebl、gagecl、galnac4s-6st、gata3、gdf5、gfil、ggtl、gmcsf、gnas1、gnrh1、gpr2(ccr10)、gpr31、gpr44、gpr81(fksg80)、grcc10(cio)、grp、gsn(凝溶胶蛋白)、gstp1、糖蛋白(gp)ilb/iiia、havcr2、hdac4、hdac5、hdac7a、hdac9、her2、hgf、itgb4(b 4整合素)、jag1、jak1、jak3、jun、k6hf、kai1、kdr、kitlg、klf5(gc box bp)、klf6、klk10、klk12、klk13、klk14、klk15、klk3、klk4、klk5、klk6、klk9、krt1、krt19(角蛋白19)、krt2a、krthb6(毛发特异性ii型角蛋白)、l-选择素、lama5、lep(瘦素)、lingo-p75、lingo-troy、lps、lta(tnf-b)、ltb、ltb4r(gpr16)、ltb4r2、ltbr、macmarcks、mag或omgp、map2k7(c-jun)、mdk、mib 1、肝素结合细胞因子、mif、mip-2、mki67(ki-67)、mmp2、mmp9、ms4a1、msmb、mt3(金属硫蛋白iii)、mtssl、mucl(粘蛋白)、myc、myd88、nck2、神经蛋白聚糖、nkg2d、nfkb1、nfkb2、ngf、ngfb(ngf)、ngfr、ngr-lingo、ngr-nogo66(nogo)、ngr-p75、ngr-troy、nme1(nm23a)、nox5、nppb、nr0b1、nr0b2、nr1d1、nr1d2、nr1h2、nr1h3、nr1h4、nrii2、nrii3、nr2c1、nr2c2、nr2e1、nr2e3、nr2f1、nr2f2、nr2f6、nr3c1、nr3c2、nr4a1、nr4a2、nr4a3、nr5a1、nr5a2、nr6a1、nrp1、nrp2、nt5e、ntn4、odz1、oprd1、p2rx7、pap、parti、pate、pawr、pca3、pcna、pdgfa、pdgfb、pecam1、pf4(cxcl4)、pge2、pgf、pgr、磷酸酶蛋白聚糖、pias2、pik3cg、纤溶酶原激活物、plau(upa)、plg、plxdc1、ppbp(cxcl7)、ppid、pr1、prkcq、prkdl、prl、proc、蛋白c、prok2、psap、psca、ptafr、pten、ptgs2(cox-2)、ptn、rac2(p21rac2)、rage、rarb、rgsl、rgs13、rgs3、rnfllo(znf144)、rob02、si00a2、scgb1d2(亲脂素b)、scgb2a1(乳腺珠蛋白2)、scgb2a2(乳腺珠蛋白1)、scye1(内皮单核细胞激活细胞因子)、sdf2、serpina1、serpina3、serpinb5(乳腺丝抑蛋白)、serpine1(pai-1)、serpinf1、shbg、sla2、slc2a2、slc33a1、slc43a1、slit2、spp1、sprr1b(sprl)、st6gal1、stab1、stat6、steap、steap2、p物质、tb4r2、tbx21、tcp10、tdgf1、tek、tgfa、tgfb1、tgfb111、tgfb2、tgfb3、tgfbi、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、th1l、thbs1(血小板反应蛋白-1)、thbs2、thbs4、thpo、tie(tie-1)、timp3、组织因子、tlr10、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tnf、tnf-a、tnfaip2(b94)、tnfaip3、tnfrsf11a、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf21、tnfrsf5、tnfrsf6(fas)、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsfio(trail)、tnfsf11(trance)、tnfsf12(ap03l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hveml)、tnfsf15(vegi)、tnfsf18、tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf6(fasl)、tnfsf7(cd27配体)、tnfsf8(cd30配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tollip、toll-样受体、top2a(拓扑异构酶iia)、tp53、tpm1、tpm2、tradd、traf1、traf2、traf3、traf4、traf5、traf6、trem1、trem2、trpc6、tslp、tweak、凝血调节蛋白、凝血酶、vegf、vegfb、vegfc、多功能蛋白聚糖、vhl c5、vla-4、xcl1(淋巴细胞趋化因子)、xcl2(scm-lb)、xcr1(gpr5/ccxcr1)、yy1和zfpm2。[0072]本发明还包括肿瘤靶向抗原，其选自：her1、her2、her3、gd2、癌胚抗原(cea)、表皮生长因子受体活性突变体(egfrviii)、cd133、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、上皮细胞粘附分子(epcam)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、eph受体a4(epha)、酪氨酸蛋白激酶met(cmet)、il-13ra2、微粒体环氧化物水解酶(meh)、mage、间皮素、muc16、muc1、前列腺干细胞抗原(psca)、肾母细胞瘤-1(wt-1)，或紧密连接蛋白家族蛋白。[0073]本发明还包括靶向t细胞标记物的抗原结合结构域。t细胞标记物的实例包括ctla-4、pd-1、lag3、s15、b7h3、b7h4、tcr-α、tcr-β和/或tim-3。抗体也可能与活化t细胞标记物cd3、41bb或ox40结合。[0074]本发明还包括可切割接头，如蛋白酶可切割接头。可切割接头的实例是包含被以下肿瘤相关蛋白酶切割序列的肽：mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp21、upa、fapa或组织蛋白酶b。其他的实例包括可切割接头，其被在细胞凋亡或炎症相关反应期间上调的蛋白酶，例如半胱氨酸蛋白酶切割。半胱氨酸蛋白酶的实例为半胱氨酸蛋白酶1、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶3、半胱氨酸蛋白酶4、半胱氨酸蛋白酶5、半胱氨酸蛋白酶6、半胱氨酸蛋白酶7、半胱氨酸蛋白酶8、半胱氨酸蛋白酶9、半胱氨酸蛋白酶10、半胱氨酸蛋白酶11、和/或半胱氨酸蛋白酶12。与现有技术中的可激活抗体不同，本发明的可切割接头不直接掩蔽抗原结合位点。[0075]本发明还可以包括与aab一起的细胞因子，例如，作为aab融合蛋白的一部分或单独连接至aab。细胞因子可选自以下中的至少一种：生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、tnf-a、米勒管抑制因子、促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、促血小板生成素(tpo)、神经生长因子、血小板生长因子、胎盘生长因子，转化生长因子(tgf)、胰岛素样生长因子-1和-11、促红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子(csf)、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、cd27l、cd30l、fasl、4-1bbl、ox40l、trail、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-18、il-21、il-22、il-23、il-33、ifn-a、ifn-b、ifn-g、ifn-g诱导因子(igif)、骨形态发生蛋白(bmp)、白血病抑制因子(lif)或kit配体(kl)。[0076]本发明的前抗体设计。为了避免脱靶的ag-ab相互作用，本发明的策略是通过引入蛋白水解接头以扭曲抗原结合位点的蛋白结构，来减少甚至阻断抗体的抗原结合。接头在靶位点被切割之后，共同形成抗体的抗原结合区的抗体的两部分从扭曲结构释放出来，并且抗体重新获得抗原结合能力。[0077]本文公开的融合蛋白的设计和方法可以应用于所有种类抗体，而不需要在抗体结构中添加额外要素。此外发现降低免疫原性的短接头和抗体的高产量。此外，本发明不包括重复的g4s接头，从而降低了融合蛋白在切割接头之前聚集的问题。[0078]实施例1[0079]材料和方法。克隆和蛋白产生。[0080]用于蛋白表达的dna片段或由genewiz合成，或由pcr产生，并通过等温组件(quantabio)克隆到pee6.4载体中。[0081]为了表达蛋白，在free style 293培养基(gibco)中混合质粒与pei(sigma)，并转染到293f细胞中。细胞在37℃下以120rpm振荡孵育。孵育5～6天后，收集上清液并过滤。蛋白用protein a树脂(repligen)纯化，并储存于中和洗脱缓冲液(40mm tris ph7.0/100mm甘氨酸/100mm nacl)中。[0082]elisa和基于细胞的elisa。为了检测抗ctla4抗体的结合强度，将ctla4蛋白(sino biological)稀释至2ug/ml，并包被在96孔板上。将检测抗体稀释到不同浓度，并加入孔中。在37℃孵育1小时后，用洗涤缓冲液(pbs/0.05％吐温20)洗掉未结合的蛋白。加入检测抗体(来自jackson immunoresearch的ap-山羊-抗-人igg)。在37℃孵育1小时后，用洗涤缓冲液将未结合的蛋白洗掉。然后加入pnpp底物(pierce)溶液。在室温下孵育直至黄色显现。用biotek epoch 2测量od405，并用gen5软件分析。为检测抗cldn18.2蛋白的结合强度，方法同上，除了表达cldn18.2蛋白的katoiii细胞(atcc)，而不是蛋白被包被在96孔板上。每个孔包含105个细胞。[0083]t细胞活化试验。为了检测mmp14切割前后，前抗-cldn18.2-fc-cd3活化t细胞的能力，将jurkat nfat细胞(invivogen)、katoiii细胞(atcc)和mmp14切割前后的稀释蛋白在96孔板的每个孔中混合。每孔含有104个jurkat细胞和104个katoiii细胞。在37℃孵育30小时后，从每孔转移30μl上清液到黑色96孔板中。然后注入quanti-luc测定溶液(invivogen)，使用发光仪(biotek synergy)测量荧光素酶活性，并使用gen5软件分析。[0084]蛋白序列[0085]前抗-ctla4-fc[0086]minefsslagaqrqrllgvvvvqslvhhgaakhvallpsalvhcqiaseskaavgiqhghgglvvvlglavafpfhgdiarvealhqtaqrhlilgqlvsagrlgvhlrlprlafgladgllngggqslvgdlalvllavepvlvqhgqhghhsicgvvlllsglgfgvvhfdavhvpvklhlgvlmadvhhhachlgcsrdhqcilgfgreqkhgrsaqqfgsrtarnryhraltpivevagltrtvisrgvlggyrvnlqkelvfrgvtgdrdtrfdrrvvigrtfiidethpfnfltweltdpiptitggdggagnrarqaertgrinqtrtrffqfylsayvltppfdfqlgartervrivvpllavvkrlvfvlnrrngqrevgtrarttetvrnagvtgrrvvdqqfrrltrllhvpiqivgfrvrveqalrafardgrfftrrhaqrrwrlghhnvsggtwnpeqqyp(seq id no:1)[0087]前抗-cldn18.2-fc[0088]metdtlllwvlllwvpgstgdivmtqspdslavslgeratisckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndyfypftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecgssgrsenirtaggsqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsnyliewvkqapgqglewiglinpgsggtnynekfkgkatitadkststaymelsslrsedtavyycarvyygnsfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:2)[0089]前抗-cldn18.2-fc-cd3[0090]metdtlllwvlllwvpgstgdivmtqspdslavslgeratisckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndyfypftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecgssgrsenirtaggsqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsnyliewvkqapgqglewiglinpgsggtnynekfkgkatitadkststaymelsslrsedtavyycarvyygnsfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsggggsqivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinggggsggggsggggsqvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss(seq id no:3)[0091]图1显示蛋白的示意图和显示前抗体设计如何在切割后恢复抗原结合能力的图。图1a为aab的示意图。图1b显示第一种类型的抗原结合激活。cl和vh与对mmp14敏感的蛋白水解接头相连。vh在切割前不能与vl配对以形成稳定的抗原结合位点。vh在被mmp14切割后释放，并且能够与vl配对形成抗原结合位点。图1c显示第二种类型的抗原结合激活。第一fc和vh与对mmp14敏感的蛋白水解接头连接。vh在切割前不能与vl配对以形成稳定的抗原结合位点。vh在被mmp14切割后被释放，并且能够与vl配对以形成抗原结合位点。[0092]图2是显示在用mmp14切割接头后，前抗-cldn18.2-fc恢复抗原结合能力的图。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2-fc与表达cldn18.2的katoiii细胞的结合与阳性对照一样强。未切割蛋白的结合比阳性对照弱约100倍。[0093]图3是显示在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3恢复抗原结合能力的图。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3与表达cldn18.2的katoiii细胞的结合比未切割蛋白的强20倍以上。[0094]图4是显示在mmp14切割后，双特异性前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3对t细胞的活化比未切割蛋白的强10倍以上的图。在有或没有mmp14切割的情况下，报告jurkat细胞与katoiii细胞和前抗-cldn18.2-fc-抗-hcd3混合。孵育24小时后，通过荧光素酶的产生来测量t细胞的活化水平。[0095]图5是显示在用mmp14切割后，前抗-hctla4 scfv-fc与表面包被的hctla4蛋白的结合比未切割蛋白强10倍以上的图。[0096]图6是显示在用mmp14切割接头后，前抗-cldn18.2克隆2恢复抗原结合能力的图。基于细胞的elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-cldn18.2克隆2与表达cldn18.2的katoiii的结合比未切割蛋白的强约100倍。[0097]图7是显示在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3 scfab恢复hcd3e结合能力的图。elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3 scfab与表面包被的hcd3e的结合比未切割蛋白的强20倍以上。[0098]图8是显示在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3(aab7)恢复hcd3e结合能力的图。elisa数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3(aab7)与被包被的hcd3e的结合比未切割蛋白的强10倍以上。[0099]图9是显示在用mmp14切割接头后，前抗-hctla4(aab7)恢复抗原结合能力的图。基于流式细胞术的结合试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hctla4(aab7)与表达hctla4的细胞的结合与阳性对照一样强，而未切割蛋白显示几乎没有结合。[0100]图10是显示在用mmp14切割接头后，前抗-hcd3(aab7)恢复刺激t细胞活化的能力的图。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hcd3(aab7)对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。[0101]图11是显示在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-hpd-l1恢复刺激t细胞活化的能力的图。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-hpd-l1对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。[0102]图12是显示在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-cldn18.2 scfv恢复刺激t细胞活化的能力的图。报告t细胞活化试验数据显示，在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-抗-cldn18.2 scfv对t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过荧光素酶的产生来测量。[0103]图13是显示在用mmp14切割接头后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-前抗-hpd-l1恢复刺激pbmc中t细胞活化的能力的图。在用mmp14切割后，双特异性前抗-hcd3(aab8)-前抗-hpd-l1对pbmc中t细胞活化的刺激比未切割蛋白的强20倍以上。t细胞活化水平通过ifn-γ产生来测量。[0104]图14是显示在用mmp14切割接头后，前抗-hctla4(aab1)-fc恢复抗原结合能力的图。基于流式细胞术的结合试验数据显示，在用mmp14切割后，前抗-hctla4(aab1)-fc对表达hctla4细胞的结合与阳性对照一样强，而未切割蛋白显示几乎没有结合。[0105]预期就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，该说明书中讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。[0106]应理解的是，本文描述的具体实施方案以举例说明的方式显示，而不作为对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，该发明的主要特征可以用于各种实施方案。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文描述的具体过程的多种等同方案。这样的等同方案被认为在该发明的范围内并被权利要求涵盖。[0107]说明书中提及的所有出版物和专利申请表明与该发明相关领域中的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其相同程度如同具体且单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。[0108]当在权利要求和/或说明书中与术语“包含(comprising)”联合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以指“一(one)”，但其也符合“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义。在权利要求中使用术语“或”用来指“和/或”，除非明确指出仅指代供选择的方案或供选择的方案相互排斥，但公开内容支持仅指代供选择的方案和“和/或”的定义。贯穿该申请，术语“约”用来表示数值包含装置、用于确定数值的方法的误差的固有变化或研究对象中存在的变化。[0109]如在该说明书和(多项)权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”或“含有(containing)”(和含有(containing)的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”是包括性或开放式的，并且不排除另外的、未列举的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除存在其它未陈述的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含(comprising)”可以被“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“由……组成(consisting of)”代替。如本文所使用的，术语“组成(consisting)”用来表示仅列举的整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/加工步骤或限定)或整体(例如(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/加工步骤或(多个)限定)的组存在。如本文所使用的，短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”要求限定的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，但不排除存在其它未指定的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤，以及不实质上影响要求保护的发明的基本和(多个)新颖特性和/或功能的那些。[0110]本文使用的术语“或其组合”是指在术语之前所列举的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中的至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果在具体上下文中顺序是重要的，则还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或条目的重复的组合，如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等等。技术人员将理解对任意组合中项目或条目的数量通常没有限制，除非另外从上下文显而易见。[0111]如本文所使用的，近似的词语如但不限于“约(about)”、“基本的(substantial)”或“基本上(substantially)”是指这样的情况，当如此修饰时，被理解为不必是绝对的或精确的，而是将被考虑为对于本领域普通技术人员而言足够接近以确保指明所述情况是存在的。描述可以变化的程度将取决于能够实施并且仍使本领域普通技术人员认识到修饰的特征仍具有未修饰的特征所需要特征和能力的变化的程度。一般，但受之前的讨论的限制，由近似词如“约(about)”修饰的本文的数值可以由所述数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。[0112]本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以根据本公开内容并且在没有过度实验的情况下形成和实施。虽然该发明的组合物和方法已经就优选的实施方案描述，但对本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法和在方法的步骤中或在步骤的顺序中施加变化。对本领域技术人员显而易见的所有这样相似的替代和修改被视为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。[0113]为了帮助专利局以及根据本技术发布的任何专利的任何读者来解释所附的权利要求，申请人希望注意，他们不希望任何所附的权利要求援引u.s.c.§112(f)段、35u.s.c.§112第6段或等同法案，因为其在本技术提交之日存在，除非在特定权利要求中明确使用词语“用于……的手段(means for)”或“用于……的步骤(step for)”。[0114]对于每项权利要求，每项从属权利要求可以既从属于独立权利要求，也可以从属于每一项权利要求的每项在先从属权利要求，只要在先权利要求为权利要求术语或要素提供适当的基础。









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