使用数字微滴式PCR和相关技术测定核酸的装置和方法

有机化合物处理,合成应用技术使用数字微滴式pcr和相关技术测定核酸的装置和方法1.相关申请2.本技术要求weitz等人于2020年1月14日提交的第62/961,097号美国临时专利申请的权益，该临时专利申请的名称为“devices and methods for determining nucleic acids using digital droplet pcr and related techniques”，其全部内容通过引用方式并入本文。3.政府资助4.本发明是在国家科学基金会授予的第1420570号基金的政府资助下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。技术领域5.本公开在某些方面总体上涉及基于微滴的微流控装置和方法。在某些情况下，使用通过pcr进行的数字扩增。背景技术：6.存在多种用于在微流控系统中产生流体微滴的技术，例如在编号为wo 2004/091763、wo 2004/002627、wo 2006/096571、wo 2005/021151、wo 2010/033200和wo 2011/056546的国际专利公布文件中公开的那些技术，每个国际专利公布文件的全部内容都通过引用方式并入本文。在某些情况下，可以产生相对大量的微滴，并且通常以相对较高的速度产生，例如，可以以每秒至少约10个微滴的速度产生微滴。微滴还可以在其中包含多种物质。然而，在测定微滴内的物质方面需要改进。技术实现要素：7.在某些方面，本公开总体上涉及基于微滴的微流控装置和方法。在某些情况下，使用通过pcr进行的数字扩增。在一些情况下，本公开的主题包括相关产品、特定问题的备选解决方案、和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。8.一些方面通常涉及某些方法。例如，在一个实施方案中，该方法包括形成第一组多个微滴，其中至少90％的微滴仅含有一种/个靶核酸或不含靶核酸，并且其中至少90％的微滴含有至少一种扩增引物；使用至少一种扩增引物扩增第一组多个微滴内的靶核酸，以产生扩增的核酸；破碎第一组多个微滴以混合扩增的核酸；形成第二组多个微滴，其中至少90％的微滴含有扩增的核酸之一或不含扩增的核酸，并且其中至少90％的微滴含有至少一种选择引物；使用至少一种选择引物扩增第二组多个微滴内的扩增的核酸，以产生可测定的核酸；并且测定至少一些可测定的核酸。9.在另一实施方案中，该方法包括形成多个微滴，其中至少90％的微滴仅含有一种/个靶核酸或不含靶核酸，并且其中至少90％的微滴含有多种不同的扩增引物；使用多种扩增引物在多个微滴内扩增靶核酸，以产生扩增的核酸；破碎微滴，以形成扩增核酸的混合物；并且测定混合物内至少一些扩增的核酸。10.在另一方面，本公开包括制作本文所述的一个或多个实施方案的方法，例如，用于数字微滴式pcr和其他应用。在又一方面，本公开包括使用本文描述的一个或多个实施方案的方法，例如，用于数字微滴式pcr和其他应用。11.当结合附图考虑时，从以下对各种非限制性实施方案的详细描述中，其他益处和新特征将变得明显。附图说明12.将参考附图以示例的方式描述非限制性实施方案，这些附图是示意性的并且并非意在按比例绘制。在附图中，所示出的每个相同或几乎相同的部件通常由单一数字表示。为了清晰起见，并非每个部件都在每幅图中标出，在没有必要为使本领域普通技术人员理解该实施方案而进行图示的情况下也没有示出每个实施方案的每个部件。在附图中：13.图1a-1e展示了根据一个实施方案，使用条形码化微滴对每个单独的突变扩增子进行单分子表征；14.图2a-2b展示了在另一实施方案中的sanger测序；15.图3a-3b展示了在又一实施方案中的下一代测序；以及16.图4展示了在再一个实施方案中的杂交。17.发明详述18.在某些方面，本公开总体上涉及基于微滴的微流控装置和方法。在某些方面，在第一步中，包含在微滴内的靶核酸在微滴内被扩增，其中可能存在多种引物。然而，多种引物可能会导致多种靶核酸在微滴内扩增，这可能使得难以鉴定哪些核酸被扩增。在第二步中，可以测定扩增的核酸。例如，可以破碎微滴，并可以将扩增的核酸汇集在一起并测序。举例来说，可能形成含有扩增的核酸的新微滴，并且微滴内的那些核酸可能通过暴露于某些引物而扩增。这可能是有用的，例如用于确定样品中是否存在某种靶核酸，例如即使靶核酸以非常低的浓度存在。此外，在某些情况下，可以将微滴分成不同的组，从而使这些组暴露于不同的引物。在其他实施方案中，还可以使用其他测序技术。第二步可以允许大得多的多重化，以提高扩增核酸的特异性和/或选择性等。19.一些方面通常涉及测定样品中靶核酸的系统和方法。在某些情况下，靶标可能以非常低的浓度存在。例如，靶核酸可能以1:103、1:104、1:105、1:106、1:107、1:108或甚至更低的浓度存在于含有其它核酸的样品中。20.在某些情况下，核酸可以以某种方式扩增。例如，可以将核酸封装在微滴内。在某些情况下，以相对较低的浓度封装核酸，例如，使得微滴可以平均每个微滴包含少于1个核酸。这可能有助于确保大部分或所有核酸被扩增，例如，基本上均匀地扩增。相反，如果要在批量溶液中扩增核酸，则可能扩增一些核酸而其他核酸未被扩增(或者扩增的程度要低得多)。因此，在如本文所述的某些实施方案中，将核酸封装在微滴内并在其中扩增。21.在某些情况下，可以将多种引物添加到微滴中以引起扩增，例如，使用基于微滴的pcr或者本领域普通技术人员已知的其他技术。在某些情况下，可以存在至少3种、至少5种、至少10种、至少30种、至少50种、至少100种、至少300种、至少500种、至少1,000种、至少2,000种、至少3,000种、至少5,000种或至少10,000种，或者更多种可区分的引物。例如，这可能有助于确保扩增大量潜在的靶核酸。然而，这可能使得难以鉴定哪些核酸被扩增。22.相应地，在第二步中，可以对扩增的微滴进行测定或测序，例如，使用多种技术中的任何一种。例如，在一组实施方案中，可以破碎微滴，并且将它们的内容物汇集在一起，例如，以产生扩增核酸的池。然后可以对扩增核酸的池进行测序或测定(例如，定性或定量地)，例如使用下列技术，诸如sanger测序、illumina测序、dna微阵列、单分子实时测序(例如，pacbio测序)、纳米孔测序、毛细管电泳等技术。作为非限制性示例，核酸的测定可以包括确定是否存在核酸或一类核酸、确定核酸的一些或全部序列、确定核酸的浓度等。在某些情况下，可以测定或鉴定扩增核酸的池，例如，无需任何测序。23.另外，在某些实施方案中，可以使用基于微滴的技术，例如基于微滴的pcr，对扩增核酸的池进行测序。例如，在某些情况下，可以将扩增的核酸收集到微滴内，并使微滴暴露于某些引物，例如能够扩增稀有靶核酸序列的引物。在某些情况下，可以将扩增的核酸以相对较低的浓度收集到微滴内，例如如本文所述，使得微滴可以平均每个微滴含有少于1个核酸或每个微滴含有少于1个靶标。此外，在某些实施方案中，可以将微滴分成不同的微滴组，使这些微滴组暴露于不同的引物。例如，可以将微滴分成至少5、10、30、100个组等，使这些组暴露于各种引物，例如在不同的空间位置上，以确定样品中是否存在靶核酸。然而，应该理解的是，在其他实施方案中，扩增的核酸可能以相对较高的浓度存在，例如，每个微滴至少存在一个核酸或每个微滴至少存在一个靶标。在一些情况下，一个微滴内可能存在多于一个引物或多于一个扩增子。24.一方面，例如，将含有寡核苷酸或其他核酸(包括下文描述的那些核酸)的样品封装到微滴内。例如，这些可以是样品内待测定的靶标，例如定性和/或定量地测定。将寡核苷酸在微滴内扩增，例如，使用pcr或其他技术。例如，在至少一些微滴中可以存在大量引物，或者将大量引物添加到至少一些微滴中，例如，这可以允许在每个微滴内扩增相对较多种寡核苷酸。在某些情况下，寡核苷酸以非常低的密度分布在微滴内，例如，使得大多数或所有微滴仅包含单个寡核苷酸或不包含寡核苷酸。例如，这种系统可用于产生更大数量或更高浓度的寡核苷酸以供后续分析，例如，如下文所论述的。使用相对较大量的引物可以允许扩增大范围的可能的寡核苷酸，而在分别的微滴内隔离出单个寡核苷酸可以允许以相对均匀的方式扩增寡核苷酸，例如，使得大多数或所有寡核苷酸都将被扩增，例如，不存在当两个或更多个寡核苷酸一起扩增时可能发生的竞争效应。25.扩增之后，可以破碎微滴，并将它们的内容物组合在一起，从而产生扩增的寡核苷酸的混合物。然后，可以以某种方式测定寡核苷酸。可以使用多种技术来定量和/或定性地测定寡核苷酸，例如sanger测序、illumina测序、dna微阵列、单分子实时测序(例如，pacbio测序)、纳米孔测序、毛细管电泳等技术。26.作为另一个非限制性示例，可以在微滴内进行第二阶段扩增，例如，以促进对寡核苷酸进行测定和/或测序。根据某些实施方案，扩增的寡核苷酸的混合物可以再次包含在微滴内，然后在微滴内扩增。在某些情况下，扩增的寡核苷酸可以以相对较低的密度包含在微滴内，例如，使得大多数或所有微滴仅包含单个寡核苷酸或不包含寡核苷酸。在一些实施方案中，微滴内的扩增也可以是相对有选择性的，例如，通过使用一种或多种仅允许扩增某些类型寡核苷酸的引物。因此，例如，在此阶段可能存在仅允许某种寡核苷酸序列的突变体的引物，且因此可以使用这些引物扩增与该序列具有足够相似性的寡核苷酸，而其它寡核苷酸，如污染物或无关序列，可能不会在微滴内扩增。扩增之后，可任选地对扩增的寡核苷酸进行测序，例如，使用诸如本文所述的那些技术，或以其他方式进行分析。在某些情况下，可以将微滴分成不同的组，其中至少一些可以暴露于不同的引物，例如，以确定样品中是否存在不同类型的靶寡核苷酸。27.上文的论述说明了可用于对来自样品的寡核苷酸进行测定或测序的某些实施方案的非限制性示例。然而，其他实施方案也是可能的。相应地，更一般地说，一些方面涉及用于对来自样品的核酸如寡核苷酸进行测定或测序的多种系统和方法。28.可以根据不同方面对多种靶核酸进行测定，包括寡核苷酸。核酸可以来自细胞，例如哺乳动物细胞，或者来自其他来源。例如，核酸可以是rna和/或dna，如基因组dna或线粒体dna。在某些情况下，核酸是自由浮动的或者包含在微滴内含有的流体中。核酸可以取自一个或多个细胞(例如，在一个或多个细胞裂解时释放)，可以合成产生等等。如果核酸源自细胞，则细胞可以来自相同或不同的物种(例如，小鼠、人类、细菌等)，和/或相同或不同的个体。例如，核酸可以来自单个生物体的细胞，例如健康或病变细胞(例如，癌细胞)、生物体的不同器官等。在某些情况下，可以使用不同的生物体(例如，相同或不同物种的生物体)。在某些情况下，核酸可以具有这样的分布，即使得一些核酸不通常存在于核酸群体中。例如，在数十、数百、数千或更多个正常或其他细胞中可能存在一个癌细胞或病变细胞。29.例如，在一组实施方案中，可以裂解一个或多个细胞，收集来自细胞的核酸并将其分布或封装至微滴内，例如，如本文所论述的。可以使用任何合适的裂解细胞的技术进行裂解。非限制性示例包括超声波或暴露于合适的试剂如表面活性剂。在某些情况下，选定的确切技术可能取决于被裂解细胞的类型；许多这样的细胞裂解技术会是本领域普通技术人员已知的。30.细胞可以来自任何合适的来源。例如，细胞可以是需要对来自该细胞的核酸进行研究或测序等的任何细胞，并且可以包括一种或多种细胞类型。例如，细胞可以来自特定的细胞群，诸如来自某个器官或组织的细胞(例如，心脏细胞、免疫细胞、肌肉细胞、癌细胞等)、来自特定个体或物种的细胞(例如，人类细胞、小鼠细胞、细菌等)、来自不同生物体的细胞、来自天然存在的样品(例如，池水、土壤等)的细胞等。在某些情况下，细胞可以从组织中解离。31.在一组实施方案中，含有核酸的样品可以包含在多个微滴内，例如包含在合适的载液内。核酸可以在微滴形成期间存在，和/或在形成后添加到微滴中。可以选择任何合适的方法来产生微滴，并且用于形成微滴的多种多样不同的微滴产生器和技术对于本领域普通技术人员来说会是已知的。例如，可以使用通道的接合来产生微滴。例如，接合可以是t形接合、y形接合、通道内通道接合(例如，以同轴布置的方式，或者包括内通道和围绕内通道的至少一部分的外通道)、交叉(或“x”)接合、流动聚焦接合或用于产生微滴的任何其他合适的接合。参见，例如link等人于2004年4月9日提交的第pct/us2004/010903号国际专利申请，名称为“formation and control of fluidic species”，于2004年10月28日公布为wo 2004/091763，或者stone等人于2003年6月30日提交的第pct/us2003/020542号国际专利申请，名称为“method and apparatus for fluid dispersion”，于2004年1月8日公布为wo 2004/002627，每件申请的全部内容都通过引用方式并入本文。32.在某些实施方案中，可以在微滴形成之后将核酸添加到微滴中，例如，通过皮量注射(picoinjection)或其它方法，如在名称为“fluid injection”、公布号为wo 2010/151776的国际专利申请(通过引用方式并入本文)中论述的那些方法、通过使微滴与含有核酸的微滴的融合，或者通过本领域普通技术人员已知的其它技术。33.根据某些实施方案，核酸可以以相对较低的密度包含在微滴内。例如，在一组实施方案中，微滴可以平均每个微滴包含少于1个核酸。例如，平均装载率可以小于约1个颗粒/微滴、小于约0.9个核酸/微滴、小于约0.8个核酸/微滴、小于约0.7个核酸/微滴、小于约0.6个核酸/微滴、小于约0.5个核酸/微滴、小于约0.4个核酸/微滴、小于约0.3个核酸/微滴、小于约0.2个核酸/微滴、小于约0.1个核酸/微滴、小于约0.05个核酸/微滴、小于约0.03个核酸/微滴、小于约0.02个核酸/微滴或小于约0.01个核酸/微滴。在某些情况下，可以选择较低的密度以最小化微滴中含有两个或更多个核酸的可能性。因此，例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的微滴可以不含靶核酸或仅含一个这样的核酸。34.然而，在某些情况下，还可以控制装载密度，使得至少显著量的微滴包含靶核酸。例如，这可能有助于防止在装载或后续操作等中效率过于低下。例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的微滴也可以包含至少一个这样的核酸。35.在某些情况下，可以扩增微滴内的核酸。例如，这可用于产生更大数量或更高浓度的核酸，例如用于后续分析、测序等。本领域普通技术人员将熟悉可以使用的各种扩增方法，包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、逆转录酶(rt)pcr扩增、体外转录扩增(ivt)、多重置换扩增(mda)或定量实时pcr(qpcr)。36.在某些情况下，可以在微滴内扩增核酸。在一些实施方案中，这可以允许扩增“均匀地”发生，例如，使得核酸的分布在扩增之后相对于扩增之前基本上没有改变。例如，根据某些实施方案，可以扩增多个微滴内的核酸，使得每种类型核酸的核酸分子的数量可以具有这样的分布，即，使得在扩增之后，不超过约5％、不超过约2％或不超过约1％的核酸的数量小于每个微滴中扩增的核酸分子的总平均数量的约90％(或小于约95％或小于约99％)和/或大于总平均数量的约110％(或大于约105％或大于约101％)。在一些实施方案中，可以扩增微滴内的核酸，从而可以在扩增的核酸中检测到扩增的每种核酸，并且在某些情况下，使得核酸与总核酸群体的质量比在扩增后相对于扩增前的质量比的变化小于约50％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。37.在某些情况下，微滴内含有某些引物以促进扩增。这种引物可以在微滴形成期间存在，和/或在微滴形成之后添加到微滴中。应该注意的是，将引物添加到微滴中的方式可能与将核酸添加到微滴中的方式相同或不同。38.在某些实施方案中，可以将多种不同类型的引物添加到微滴中。例如，由于引物具有不同的序列和/或使得它们能够扩增不同的潜在靶标，因此可以区分引物。在某些情况下，可以使用至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少75种、至少100种、至少150种、至少200种、至少300种、至少400种、至少500种、至少1,000种、至少2,000种、至少3,000种、至少5,000种或至少10,000种等不同的引物。例如，这可以允许在不同的微滴内扩增多种不同的靶核酸。39.用于形成微滴的技术的示例包括上述那些技术。用于在微滴形成之后引入引物的技术的示例包括皮量注射或其它方法，如在公布号为wo 2010/151776的国际专利申请中论述的那些方法(通过引用方式并入本文)、通过使微滴与含有引物的微滴的融合等。用于这些中任何一种的其他此类技术包括但不限于本文描述的那些技术中的任何一种。40.引物可以以任何合适的密度存在于微滴内。该密度可以与靶核酸的密度无关。在某些情况下，使用过量的引物，例如，使得靶核酸控制反应。例如，如果使用大量过量的引物，则大部分微滴将含有引物(无论微滴是否也含有靶核酸)。例如，在某些实施方案中，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的微滴可以包含至少一种扩增引物。41.可以处理含有引物和靶核酸两者的微滴，以使核酸发生扩增。这可以允许产生大量或高浓度的靶核酸，例如，基本上不改变核酸的分布。在某些情况下，选择引物以允许基本上所有或仅一些疑似存在的靶核酸被扩增。42.作为示例，pcr(聚合酶链式反应)或其他扩增技术可用于扩增核酸，例如包含在微滴内的核酸。通常，在pcr反应中，将核酸加热(例如，在一些情况下加热到至少约50℃、至少约70℃或至少约90℃)，以使核酸解离成单链，并使用热稳定的dna聚合酶(例如taq聚合酶)来扩增核酸。这个过程经常重复多次以扩增核酸。43.因此，在一组实施方案中，pcr扩增可以在微滴内进行。例如，微滴可以包含聚合酶(例如taq聚合酶)和dna核苷酸(脱氧核糖核苷酸)，并且可以对微滴进行处理(例如，通过反复加热和冷却)，以扩增微滴内的核酸。用于pcr或其他扩增技术的合适试剂，例如聚合酶和/或脱氧核糖核苷酸，可以在微滴形成期间和/或之后加入到微滴中(例如，通过与含有此类试剂的微滴合并，和/或通过直接注入此类试剂，例如包含在流体中的试剂)。用于微滴注入或微滴合并的各种技术对于本领域普通技术人员将是已知的。参见，例如公布号为2012/0132288的美国专利申请，其通过引用方式并入本文。在一些实施方案中，可以将引物添加到微滴中，或者引物可以存在于微滴内的一个或多个核酸上。本领域普通技术人员会知晓合适的引物，其中许多可以很容易地从市场上获得。44.在一组实施方案中，例如，可以使用可区分的荧光标签、条形码或其他合适的辨识标签来区分至少一些引物。可以包含在微滴内的条形码的示例包括但不限于在公布号为2018/0304222的美国专利申请或公布号为wo 2015/164212的国际专利申请中描述的那些，每件申请都通过引用方式并入本文。45.核酸可以扩增到任何合适的程度。例如，可以通过控制下列因素来控制扩增程度，诸如温度、循环时间或者微滴内所含酶和/或脱氧核糖核苷酸的量。例如，在一些实施方案中，微滴群体中可具有每个微滴至少约50,000、至少约100,000、至少约150,000、至少约200,000、至少约250,000、至少约300,000、至少约400,000、至少约500,000、至少约750,000、至少约1,000,000个或更多个扩增的核酸分子。46.在一组实施方案中，扩增之后破碎微滴，例如，以使扩增的核酸汇集在一起。本领域普通技术人员可以采用多种多样用于“破碎”或“破裂”微滴的方法。例如，可以使用一些技术诸如机械破坏、化学破坏或超声波来破坏包含在载液中的微滴。还可以使用化学试剂或表面活性剂来破坏微滴，例如，1h,1h,2h,2h-全氟辛醇。47.扩增之后，可以对一种或多种核酸进行测定或测序。然而，应该注意的是，由于存在较大量的核酸(例如由于扩增)，这种分析可以容易得多。这种分析在不同的实施方案中可以采取许多不同的形式，例如，依赖于下列因素，诸如检测的性质、所需的量化程度等。48.用于对核酸进行测定和/或测序的方法的示例包括但不限于链终止测序、杂交测序、马克萨姆-吉尔伯特(maxam–gilbert)测序、染料终止剂测序、链终止法、大规模平行签名测序(lynx therapeutics)、聚合酶克隆(polony)测序、焦磷酸测序、连接法测序、离子半导体测序、dna纳米球测序、单分子实时测序(例如，pacbio测序)、纳米孔测序、sanger测序、数字rna测序(“数字rna-seq”)、illumina测序、毛细管电泳等。在某些情况下，例如，可以使用微阵列如dna微阵列来测定或鉴定核酸。本领域普通技术人员将知晓可以用于对核酸进行测定和/或测序的其它技术，例如定性和/或定量地。49.此外，在某些情况下，可以使用基于微滴的技术，例如基于微滴的pcr，对核酸进行测定。举例来说，根据某些实施方案，扩增的核酸可以包含在微滴内，例如用于后续分析。可以使用任何合适的技术来产生所述微滴，例如本文描述的那些技术，并且用于产生这些微滴的技术可以与用于初始微滴的技术相同或不同。在某些情况下，微滴也可以是单分散性的，和/或具有如本文所述的分布或尺寸。可以使用任何合适的技术将扩增的核酸包含在微滴内，例如，在微滴形成期间或之后。本文已经论述了用于产生微滴和/或将流体添加到微滴中的技术。50.在某些情况下，扩增的核酸可以以相对较低的密度包含在微滴内。例如，微滴可以平均每个微滴包含少于1个核酸。例如，平均装载率可以小于约1个颗粒/微滴、小于约0.9个核酸/微滴、小于约0.8个核酸/微滴、小于约0.7个核酸/微滴、小于约0.6个核酸/微滴、小于约0.5个核酸/微滴、小于约0.4个核酸/微滴、小于约0.3个核酸/微滴、小于约0.2个核酸/微滴、小于约0.1个核酸/微滴、小于约0.05个核酸/微滴、小于约0.03个核酸/微滴、小于约0.02个核酸/微滴或小于约0.01个核酸/微滴。在某些情况下，可以选择较低的密度以最小化微滴中含有两个或更多个核酸的可能性。因此，例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的微滴可以不含靶核酸或仅含一个这样的核酸。此外，在某些情况下，还可以控制装载密度，使得至少显著量的微滴包含靶核酸。例如，这可能有助于防止在装载或后续操作等中效率过于低下。例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的微滴也可以包含至少一个这样的核酸。51.在一些实施方案中，可以进行在微滴内的第二阶段扩增。微滴内的扩增也可以有相对的选择性，例如，用于定量检测，或者用于对特定序列进行测定，例如，通过仅提供某些引物。例如，在某些实施方案中，可以提供一种或仅相对较少数量的引物(例如，不超过20、15、10、5、3或2种)，从而仅允许例如在微滴内扩增特定的核酸序列。在某些情况下，可以存在至少3、4、5、10、15或20种引物。52.作为非限制性示例，在扩增过程中可以使用仅允许扩增核酸中某些突变的引物。例如，可以使用具有相对较小差异的多种引物，例如使得引物具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性，和/或使得扩增引物除了不超过5、4、3、2或1个核苷酸差异之外都基本上相同。另外，在某些情况下，还可以使用防止非突变核酸扩增的阻断核苷酸，例如，以仅允许扩增突变核酸。53.在一些情况下，如果使用引物的话，可以使用诸如本文所述的那些技术将引物包含在微滴内。例如，引物可以在微滴形成期间存在，和/或在微滴形成之后添加到微滴中。应当注意的是，将引物添加到微滴中的方式可能与将核酸添加到微滴中的方式和/或将引物添加到初始微滴中的方式相同或不同。54.在某些实施方案中，可以分布引物，使得一些或所有微滴仅包含单一引物。例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的微滴可不含引物或仅含单一引物。在一些情况下，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的微滴可仅包含单一引物。55.在一组实施方案中，例如，可以使用可区分的荧光标签、条形码或其他合适的辨识标签来区分至少一些引物。可以包含在微滴内的条形码的示例包括但不限于在公布号为2018/0304222的美国专利申请或公布号为wo 2015/164212的国际专利申请中描述的那些，每件申请都通过引用方式并入本文。56.在一些实施方案中，可以使用多种不同的微滴产生器，其中每种微滴产生器在微滴形成时将单一引物导入微滴中。微滴产生器的示例包括通道接合，诸如t形接合、y形接合、通道内通道接合、交叉(或“x”)接合、流动聚焦接合等。用于形成微滴的不同微滴产生器和技术的其他合适的示例包括本文论述的那些中的任何一个。用于在微滴形成之后导入引物的技术的示例包括皮量注射或其它方法，如在公布号为wo 2010/151776的国际专利申请中论述的那些方法(通过引用方式并入本文)、通过使微滴与含有引物的微滴的融合等。57.在一些情况下，可以将微滴分成不同的组，使得微滴暴露于不同的引物，例如注入微滴中的引物。然而，在其它实施方案中，引物可以有差别地分布，例如使得一些或所有微滴包含一些或所有引物。58.因此，在一些实施方案中，尽管引物在某些实施方案中可以分布成使得一些或所有微滴仅包含单一引物，但是因为使用了不同的微滴组，所以对于扩增核酸的池仍然可以测定多种不同的靶标。例如，可以将微滴分成至少3、至少5、至少10、至少30、至少50、至少100、至少300、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少5,000或至少10,000或更多个组，并且一些组可以暴露于不同的引物，例如，以确定是否存在不同的靶核酸。59.然后可以处理含有引物和核酸两者的微滴，以使核酸发生扩增，例如，如果引物是能够识别微滴内的核酸并允许发生扩增的引物的话。在一些实施方案中，甚至也可以测定相对罕见的核酸(例如，具有突变的核酸)，例如从含有较大量非突变核酸的样品中测定。用于扩增核酸的技术包括pcr(聚合酶链式反应)或本文描述的任何其他技术。60.扩增之后，可以任选地对扩增的核酸进行测定和/或测序，例如，使用如本文所述的那些技术。在一些实施方案中，可以使微滴破裂，并且可以组合核酸以促进测定和/或测序，尽管在一些情况下，测定和/或测序可能发生在微滴内。61.用于对核酸进行测定和/或测序的方法的示例包括但不限于链终止测序、杂交测序、马克萨姆-吉尔伯特(maxam–gilbert)测序、染料终止剂测序、链终止法、大规模平行签名测序(lynx therapeutics)、聚合酶克隆测序、焦磷酸测序、连接法测序、离子半导体测序、dna纳米球测序、单分子实时测序(例如，pacbio测序)、纳米孔测序、sanger测序、数字rna测序(“数字rna-seq”)、illumina测序等。在一些情况下，可以使用微阵列诸如dna微阵列，例如以对核酸进行测定或测序。62.根据某些方面，关于用于在微流控系统中操控微滴的系统和方法的其它细节如下。例如，用于筛选和/或分选微滴的多种系统和方法描述于link等人于2006年2月23日提交的第11/360,845号美国专利申请中，名称为“electronic control of fluidic species”，于2007年1月4日公布为公布号为2007/000342的美国专利申请，该申请通过引用方式并入本文。作为非限制性示例，在一些方面，通过施加(或移除)第一电场(或其一部分)，可以将微滴引导至第一区域或通道；通过向装置(或其一部分)施加(或移除)第二电场，可以将微滴引导至第二区域或通道；通过向装置(或其一部分)施加第三电场，可以将微滴引导至第三区域或通道；等等，其中电场可能在某些方面有所差异，例如在强度、方向、频率、持续时间等方面。63.如前所述，某些实施方案包括包含在载液内的微滴。例如，可以存在包含在第二相内的形成第一相的微滴，其中相之间的表面包含一种或多种蛋白质。例如，第二相可以包括油或疏水性流体，而第一相可以包括水或另一种亲水性流体(反之亦然)。应该理解的是，亲水性流体是指在环境条件下(通常为25℃和1atm)基本上可混溶于水并且在平衡时与水不显示相分离的流体。亲水性流体的实例包括但不限于水和其他包含水的水溶液，例如细胞或生物介质、乙醇、盐溶液、盐水、血液等。在一些情况下，流体具有生物相容性。64.类似地，疏水性流体是指在环境条件下基本上可混溶于水并且在平衡时与水会出现相分离的流体。如前所述，疏水性流体有时被本领域普通技术人员称为“油相”或简称为油。疏水性流体的非限制性实例包括油，诸如烃类油、硅油、氟代烃油、有机溶剂、全氟化油、全氟碳化合物例如全氟聚醚等。可能合适的烃类的其他实例包括但不限于轻质矿物油(sigma)、煤油(fluka)、十六烷(sigma)、癸烷(sigma)、十一烷(sigma)、十二烷(sigma)、辛烷(sigma)、环己烷(sigma)、己烷(sigma)等。可能合适的硅油的非限制性示例包括2cst的聚二甲基硅氧烷油(sigma)。氟代烃油的非限制性示例包括fc3283(3m)、fc40(3m)、krytox gpl(dupont)等。此外，在一些实施方案中，其他疏水性实体也可以包含在疏水性流体中。其它疏水性实体的非限制性示例包括药物、免疫佐剂等。65.因此，疏水性流体可作为与亲水性流体分开的相而存在。在一些实施方案中，疏水性流体可以作为分开的层存在，尽管在其他实施方案中，疏水性流体可以作为包含在连续亲水性流体中的个体流体微滴而存在，例如悬浮或分散在亲水性流体内。这通常被称为油/水乳液。微滴可以是相对单分散性的，或者以各种不同的尺寸、体积或平均直径而存在。在一些情况下，微滴可具有小于约1mm的总平均直径，或者如本文所论述的其他尺寸。在一些情况下，表面活性剂可用于稳定亲水性液体中的疏水性微滴，例如，以防止微滴的自发聚结。表面活性剂的非限制性示例包括在公布号为2010/0105112的美国专利申请中论述的那些表面活性剂，该申请通过引用方式并入本文。表面活性剂的其它非限制性示例包括span80(sigma)、span80/吐温-20(sigma)、span80/triton x-100(sigma)、abil em90(degussa)、abil we09(degussa)、聚甘油聚蓖麻油酸酯“pgpr90”(danisco)、吐温-85、749流体(dow corning)、krytox 157fsl的羧酸铵盐(dupont)、krytox 157fsm的羧酸铵盐(dupont)或krytox 157fsh的羧酸铵盐(dupont)。此外，表面活性剂可以是例如肽表面活性剂、牛血清白蛋白(bsa)或人血清白蛋白。66.微滴可以具有任何合适的形状和/或尺寸。在一些情况下，微滴可以是微流控的，和/或具有小于约1mm的平均直径。例如，微滴的平均直径可以小于约1mm、小于约700微米、小于约500微米、小于约300微米、小于约100微米、小于约70微米、小于约50微米、小于约30微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约3微米、小于约1微米等。在一些情况下，平均直径也可以大于约1微米、大于约3微米、大于约5微米、大于约7微米、大于约10微米、大于约30微米、大于约50微米、大于约70微米、大于约100微米、大于约300微米、大于约500微米、大于约700微米或大于约1mm。任何这些的组合也是可能的；例如，微滴的直径可以是约1mm至约100微米。在非球形微滴中，微滴的直径可以被视为与非球形微滴具有相同体积的完美数学球体的直径。67.在一些实施方案中，微滴可以具有基本相同的形状和/或尺寸(即，“单分散性”)，或者具有不同的形状和/或尺寸，这取决于特定的应用。在一些情况下，微滴可以具有均匀分布的横截面直径，即，在一些实施方案中，微滴可具有这样的平均直径分布，即，使得不超过约20％、不超过约10％或不超过约5％的微滴的平均直径可以大于微流控微滴平均直径的约120％或小于约80％、大于约115％或小于约85％、大于约110％或小于约90％、大于约105％或小于约95％、大于约103％或小于约97％，或者大于约101％或小于约99％。一些用于产生具有均匀分布的横截面直径的微滴的技术公开于link等人于2004年4月9日提交的第pct/us2004/010903号国际专利申请，名称为“formation and control of fluidic species”，于2004年10月28日公布为wo 2004/091763，其通过引用方式并入本文。此外，在一些情况下，微滴平均直径的变异系数可以小于或等于约20％、小于或等于约15％、小于或等于约10％、小于或等于约5％、小于或等于约3％，或者小于或等于约1％。然而，在其它实施方案中，微滴不一定是基本上单分散性的，而是可以呈现出一系列不同的直径。68.本领域普通技术人员将能够确定微滴群体的平均直径，例如，使用激光散射或其他已知技术。这样形成的微滴可以是球形的，或者在某些情况下是非球形的。在非球形微滴中，微滴的直径可以被视为与非球形微滴具有相同体积的完美数学球体的直径。69.在一些实施方案中，通过在被液体包围的流体上建立电荷(这可能使流体分离成液体内的单个微滴)可以在通道内产生一个或多个微滴。在一些实施方案中，可以向流体施加电场以引起微滴形成的发生。流体可以作为液体内一系列单个的带电和/或电诱导的微滴而存在。可以使用任何合适的技术在液体内的流体中建立电荷，例如，通过将流体置于电场(其可以是ac、dc等)内，和/或引起发生反应，使流体带有电荷。70.在一些实施方案中，电场由电场发生器产生，即能够产生可施加于流体的电场的装置或系统。电场发生器可以产生ac电场(即，随时间周期性变化的电场，例如，正弦波形、锯齿波形、方波形等)、dc电场(即，随时间恒定的电场)、脉冲电场等。用于产生合适电场(其可以是ac、dc等)的技术对于本领域普通技术人员来说是已知的。例如，在一个实施方案中，通过在一对电极上施加电压来产生电场，该电极可以位于通道附近，使得电场的至少一部分与通道相互作用。电极可以由任何合适的电极材料或本领域普通技术人员已知的材料制成，包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、氧化铟锡(“ito”)等，以及它们的组合。71.在另一组实施方案中，通过以能够诱导流体形成个体微滴的方式改变通道尺寸，可以在通道内从被液体包围的流体中产生流体的微滴。例如，通道可以是在相对于流动方向上扩展的通道，例如，使得流体不会粘附到通道壁上，而是形成个体微滴，或者是在相对于流动方向上变窄的通道，例如，使得流体被迫聚结成个体微滴。在一些情况下，通道尺寸可以随时间而改变(例如，机械式或机电式、气动式)，其方式使得个体微滴的形成得以发生。例如，该通道可以机械式收缩(“挤压”)以使微滴形成，或者可以机械式破坏流体流以使微滴形成，例如通过使用移动挡板、旋转叶片等。72.一些实施方案总体上涉及用于将两个或更多个微滴融合或聚结为一个微滴的系other reactions involving droplets”；和weitz等人的公布号为wo 2010/151776的国际专利申请，名称为“fluid injection”；以及weitz等人的编号为62/072,944的美国专利申请，名称为“systems and methods for barcoding nucleic acids”。76.此外，下列文件的全部内容都通过引用方式并入本文：于2014年4月17日提交的编号为61/981,123的美国专利申请；于2015年4月17日提交的编号为pct/us2015/026338的pct专利申请，名称为“systems and methods for droplet tagging”；于2014年4月17日提交的编号为61/981,108的美国专利申请；于2014年10月30日提交的编号为62/072,944的美国专利申请；于2015年4月17日提交的编号为pct/us2015/026443的pct专利申请，名称为“systems and methods for barcoding nucleic acids”；weitz等人的编号为62/106,981的美国专利申请，名称为“systems,methods,and kits for amplifying or cloning within droplets”；agresti等人的公布号为2010-0136544的美国专利申请，名称为“assay and other reactions involving droplets”；weitz等人的编号为61/981,108的美国专利申请，名称为“methods and systems for droplet tagging and amplification”；weitz等人于2014年5月14日提交的公布号为pct/us2014/037962的国际专利申请，名称为“rapid production of droplets”；和weitz等人于2015年3月13日提交的编号为62/133,140的美国临时专利申请，名称为“determination of cells using amplification”。还有weitz等人于2020年1月14日提交的编号为62/961,097美国临时专利申请，名称为“devices and methods for determining nucleic acids using digital droplet pcr and related techniques”，其全部内容通过引用方式并入本文。77.以下实施例旨在说明本公开的某些实施方案，但并非举例说明本发明的全部范围。78.实施例179.本实施例展示了根据一个实施方案的双数字微滴式pcr。本实施例的基本概念是使用数字微滴式pcr作为两阶段检测方案的第一阶段，随后是第二阶段的检测。第一阶段具有普通数字pcr的所有优点，以及一些不太受重视的优点。第二阶段的检测通过对特定的扩增靶标进行鉴定，允许第一阶段中大得多的多重化。它还允许可以提高对扩增靶标的特异性和选择性的方法。80.在第一阶段中，将样品分隔成微滴或分隔成其他隔室，因此每滴只有一个靶寡核苷酸。然而，可以使用大量多重化的引物。在这种情况下，可以增加初始寡核苷酸的浓度，因为尽管每滴最多有一个靶标仍然是必要的，但是存在许多不同的靶标，并且在一滴中可以存在仅其中任何一种。81.这种高度的多重化提供了数字pcr的一些优点，包括对扩增率缺乏敏感性，因为可以消除竞争性扩增，以及缺乏交叉扩增，因为交叉扩增会给结果带来噪声。它还可以允许对非常罕见的靶标进行灵敏扩增。在发生扩增的部分或者全部隔室或微滴中，仅有一个被扩增的靶标以及例如其数百万个拷贝。82.该结果独立地提供了靶标的大规模扩增，但是没有提供关于靶标是什么的信息。因此，靶标的鉴定在第二阶段的检测中完成。因为有大量的扩增靶标，因此对靶标的检测容易多了。83.第二阶段的检测可以采取许多不同的形式，这取决于检测的性质和所需的量化程度。84.例如，对于灵敏性和/或定量检测，可以进行第二阶段的数字pcr。为此，可以对样品进行重新组合，将所有隔室或微滴中的所有内容物混合在一起。为了获得额外的灵敏度，可以只选择具有扩增靶标的隔室，尽管这并不是必要的或必需的。由于存在大量扩增的寡核苷酸，因此可以将样品分成不同的样品，可以使用例如标准的数字pcr方法检测其中的每份样品，在每个通道中可使用多达4种颜色进行多重化。在一些情况下，通过使用巢式引物消除第一阶段中可能出现的误差可以提高特异性。结果可以是定性的或定量的。85.图1总结了这方面的一个示例，它示出了可以如何使用数字pcr检测kras基因中的特定突变。使用阻断核苷酸进行了第一阶段的数字pcr，该阻断核苷酸阻止了没有突变的野生型基因的扩增，但允许扩增所有其他突变。总共研究了12种可能的突变体。在该第一数字pcr扩增阶段之后，将隔室的内容物组合(例如，通过破碎微滴)，以将所有扩增的突变体合并在一起。86.使用12个独立的液滴产生器进行第二阶段的数字pcr(图1c)，每个液滴产生器都使用针对一种突变体的特异性引物。以这种方式，就可以分别鉴定突变体(图1e)。87.应该理解的是，这只是举例，而在其他情况下也可以使用其他方法，例如传统的q-pcr或rt-pcr。88.在其他实施方案中还可以使用多种测序方法。例如，可以使用sanger测序轻易地鉴定扩增的靶标，如图2所示。作为另一个示例，可以使用第二代或illumina测序。通过靶向扩增对扩增子进行初始分离可以显著提高结果的信噪比，例如，如图3所示。89.在一些情况下，可以将所有引物对都添加到每个微滴中。这使得检测更加灵敏，同时仍会提高信噪比。90.作为另一个示例，可以使用基于杂交的更简单的方法来进行靶标的鉴定，而无需量化。在此，捕获寡核苷酸在空间上的分离区域可以在芯片上布置，例如在微阵列芯片上。合并微滴或隔室，并且含有相对较大数量的扩增靶标的溶液可以流过芯片。特定靶标由已知位置的杂交寡核苷酸捕获。可以使用标准方法，诸如荧光夹心式测定法或酶促扩增测定法，来检测已经捕获靶标的那些区域，如图4所示。91.总之，本实施例示出了使用多重化引物在隔室或微滴中通过pcr进行数字扩增的初始阶段，然后通过合并隔室或微滴进行第二阶段的检测。92.实施例293.在一组实验中，将含有0.1％突变型kras基因的模板混合物与pcr混合物封装到微滴内，随后进行滴内pcr和去乳化。然后，使用sanger测序法对收集到的水相进行分析。微滴内扩增子在密码子12(gtt)上显示出预期结果，而成批扩增子显示出未识别的峰。图2a-2b示出了从滴内扩增或成批扩增中获得的扩增子的sanger测序仪结果。模板混合物含有0.1％的突变型kras基因。94.这如图1所示。图1展示了使用条形码化微滴对每个分别的突变扩增子进行单分子表征。图1a示出了使各种可能的突变型kras模板在微滴中扩增，然后破碎以收集水相。图1b示出了将引物特异性扩增用于在单个实验中表征各种类型的突变。将每个引物都设计为靶向密码子12和13中12种可能的单核苷酸突变之一。在图1c中，为了允许在单次扩增运行中使用所有12种引物，将每种引物都用不同的荧光条形码封装，产生12组条形码化微滴。在图1d中，直方图示出了12组不同的微滴，并且第6组和第7组中显示出荧光信号增强的微滴表明该样品中存在两种类型的单核苷酸突变。图1e示出了ggt‑‑》gtt和ggt‑‑》gat的频率分别为55％和45％。95.如图2a所示，靶扩增子为110至115。靶标在该样品中的浓度非常低，只有在微滴中完成扩增时才能观察到。然后，将每个靶分子隔离在单个液滴中，并在该液滴中扩增。相反，当成批扩增时，低浓度靶分子必须与所有其他分子竞争，并且由于它们没有被很好地扩增，因此在图2b所示的sanger测序中不可见。96.以下是在本实施例和图1中使用的材料和方法。97.dna样品的制备。两种人crc细胞系ht29和sw480购自atcc，并在补充有10％胎牛血清的dmem培养基中培养。ht29(atcc htb-38)具有野生型kras基因，而sw480(atcc ccl-28)在kras基因的密码子12处携带纯合gtt突变体。使用qiaamp dna小提试剂盒(qiagen)从收获的细胞中提取基因组dna(gdna)，并在ae缓冲液中洗脱。通过nanodrop nd 1000分光光度计测量gdna的浓度。98.微流控装置的制作。使用标准软刻蚀方法制作聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控装置。简言之，将su8光致抗蚀剂(microchem)旋涂到硅晶片(university wafer)上，通过光刻掩模用oai uv曝光形成图案，并进行显影。然后，将重量比为基底:固化剂＝10:1的sylgard 184硅酮弹性体混合物(dow corning)倾倒在su8模具上，并在真空下脱气。在65℃固化2小时后，将pdms从模具中轻轻剥离，并用直径为0.75mm的harris uni-core活检打孔器从pdms上打出输入/输出端口。对pdms和玻璃板进行10秒钟的等离子体处理，然后将它们放在一起进行粘接。最后，通过用ppg aquapel处理微流体通道壁使其具有疏水性。99.基于微滴的肽核酸钳pcr混合物。pcr引物和taqman探针由idt合成，而pna购自pna bio。pna钳pcr混合物的最终体积为50微升，包含2微升hotstartaq聚合酶、1x pcr缓冲液、200微摩尔dntp、0.4微摩尔正向和反向引物、1.2微摩尔pna、0.36微摩尔taqman-mgb探针、0.3微克/微升bsa、1.5微升10％吐温20和4.9微克gdna。100.单分散性水性微滴的形成和pcr。使用自装配真空系统来产生微滴。将pcr混合物装入sci 0.28x0.64mm内径/外径的pe/1管(sci)中，一端插入到微滴产生装置的样品入口。将含有1％(w/w)表面活性剂的氟化油hfe-7500放入带有bd 27g1/2注射器针头的10ml塑料注射器中，并使用0.38x1.09mm内径/外径的pe/2管插入到油入口。将pcr管置于另一个配有t形三通管的10ml塑料注射器中。将pe/2管粘在18tw针头(vita)上，并穿过t形三通管插入pcr管的底部。将pe/2管的另一端插入装置出口。为了通过液滴产生器吸取流体以产生微滴，在出口处施加了壁式真空。然后，将微流控装置中产生的微滴收集在pcr管中，之后用矿物油覆盖，接着在pcr机中进行热循环。采用以下顺序执行pcr：在95℃持续10min的初始变性和酶活化步骤，进行在95℃30秒、在55℃30秒用于引物退火、在60℃50秒用于延长的40个循环，以及在60℃持续5分钟的最终延伸。101.使用条形码化微滴对每个分别的突变扩增子进行单分子表征。为了破碎分选的液滴，加入20％的pfo，随后涡旋混合30秒并以5,000rpm离心5分钟。使用相分离的液体直接作为pcr的模板。应用引物特异性扩增在单个实验中表征所有类型的突变。将每种引物都设计为靶向密码子12和13中12种可能的单核苷酸突变之一。使用在第一轮pna-钳pcr中所使用的相同taqman探针来检测微滴中的成功扩增。为了允许在单次扩增运行中使用所有12种引物，将每种引物都用不同的荧光条形码封装，产生12组条形码化微滴。12种条形码使用4种浓度的德克萨斯红与3种浓度的alexa 680配对，它们通过并行微滴产生装置与引物一起多重化。热循环后，测量微滴的荧光。12种荧光条形码中的每一种都指示不同类型的突变核苷酸。因此，可以通过对每个条形码化组中亮绿色微滴的数量进行计数，并除以所有组中绿色微滴的总数，来计算出每种突变体的频率。102.实施例3103.在本实施例中，将含有0.1％突变型egfr基因的模板混合物与pcr混合物封装到微滴内，随后进行滴内pcr和去乳化。然后，使用下一代测序(ngs)法对收集到的水相进行分析。滴内扩增子示出了由唯一峰显示的预期结果，而成批扩增子显示出未识别的峰。104.这可以在图3中观察到，该图示出了从滴内扩增或成批扩增中获得的扩增子的ngs结果。将含有0.1％突变型egfr基因的模板混合物用突变特异性引物进行滴内和成批扩增，随后进行ngs。105.以下是在本实施例和图3中使用的材料和方法。106.dna样品的制备。两种人crc细胞系ht29和sw480购自atcc，并在补充有10％胎牛血清的dmem培养基中培养。ht29(atcc htb-38)具有野生型kras基因，而sw480(atcc ccl-28)在kras基因的密码子12处携带纯合gtt突变体。使用qiaamp dna小提试剂盒(qiagen)从收获的细胞中提取基因组dna (gdna)，并在ae缓冲液中洗脱。通过nanodrop nd 1000分光光度计测量gdna的浓度。107.微流控装置的制作。使用标准软刻蚀方法制作聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控装置。简言之，将su8光致抗蚀剂(microchem)旋涂到硅晶片(university wafer)上，通过光刻掩模用oai uv曝光形成图案，并进行显影。然后，将重量比为基底:固化剂＝10:1的sylgard 184硅酮弹性体混合物(dow corning)倾倒在su8模具上，并在真空下脱气。在65℃固化2小时后，将pdms从模具中轻轻剥离，并用直径为0.75mm的harris uni-core活检打孔器从pdms上打出输入/输出端口。对pdms和玻璃板进行10秒钟的等离子体处理，然后将它们放在一起进行粘接。最后，通过用ppg aquapel处理微流体通道壁使其具有疏水性。108.基于微滴的肽核酸钳pcr混合物。pcr引物和taqman探针由idt合成，而pna购自pna bio。pna钳pcr混合物的最终体积为50微升，包含2微升hotstartaq聚合酶、1x pcr缓冲液、200微摩尔dntp、0.4微摩尔正向和反向引物、1.2微摩尔pna、0.36微摩尔taqman-mgb探针、0.3微克/微升bsa、1.5微升10％吐温20和4.9微克gdna。109.单分散性水性微滴的形成和pcr。使用自装配真空系统来产生微滴。将pcr混合物装入sci 0.28x0.64mm内径/外径的pe/1管(sci)中，一端插入到微滴产生装置的样品入口。将含有1％(w/w)表面活性剂的氟化油hfe-7500放入带有bd 27g1/2注射器针头的10ml塑料注射器中，并使用0.38x1.09mm内径/外径的pe/2管插入到油入口。将pcr管置于另一个配有t形三通管的10ml塑料注射器中。将pe/2管粘在18tw针头(vita)上，并穿过t形三通管插入pcr管的底部。将pe/2管的另一端插入装置出口。为了通过液滴产生器吸取流体以产生微滴，在出口处施加了壁式真空。然后，将微流控装置中产生的微滴收集在pcr管中，之后用矿物油覆盖，接着在pcr机中进行热循环。采用以下顺序执行pcr：在95℃持续10min的初始变性和酶活化步骤，进行在95℃持续30秒、在55℃持续30秒用于引物退火、在60℃持续50秒用于延长的40个循环，以及在60℃持续5分钟的最终延伸。110.微滴破碎、pcr和测序。为了破碎分选的液滴，加入20％的pfo，随后涡旋混合30秒并以5,000rpm离心5分钟。使用相分离的液体直接作为pcr的模板。如果液体少于5微升，则向其中加入5微升ddh2o。50微升的pcr混合物包括2微升qiagen hotstartaq聚合酶、1x pcr缓冲液、200微摩尔dntp、0.4微摩尔正向和反向引物以及2微升液体模板。按照以下步骤执行pcr：先在95℃预热5min，随后进行95℃持续40秒、50℃持续40秒和72℃持续1min的35个循环，最后在72℃延伸7min。然后，将pcr扩增子进行纯化，并送去执行深度测序以确认密码子12和13的状态。111.实施例4112.在本实施例中，使用的技术与上述技术类似，将hcv模板与pcr混合物封装到微滴内，随后进行滴内pcr和去乳化。然后，将收集到的水相导入芯片中，该芯片包含带有多种类型探针的柱杆(post)。显示阳性信号的柱杆携带用于捕获hcv扩增子的特异性探针，而显示阴性信号的其它柱杆携带其它不同的探针。113.图4示出了通过将来自hcv质粒的滴内扩增子流到由带有不同类型探针的柱杆组成的芯片上获得的杂交结果。114.尽管本文已经描述和说明了本公开的若干实施方案，但是本领域普通技术人员会很容易地设想出用于实现本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一种或多种优点的多种其他途径和/或结构，并且这些变更和/或修改中的每一个都应被视为处于本公开的范围内。更一般而言，本领域技术人员将很容易理解到，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都意在示例性的，并且这些实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于具体应用或使用本公开的教导的应用。本领域技术人员会认识到或仅采用常规实验就能够确定本文描述的本公开的具体实施方案的许多等同形式。因此，应当理解的是，上述实施方案仅以示例的方式呈现，并且处于所附权利要求及其等同形式的范围之内，除了所具体描述和要求保护的方式之外，还可以其它方式来实施本公开。本公开涉及本文描述的每种单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不互相抵触的话，两种或更多种此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合依然包括在本公开的范围之内。115.在本说明书和通过引用方式并入的文件包括相抵触和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。如果通过引用方式并入的两个或更多个文件包含相互之间抵触和/或不一致的公开内容，则以生效日期较晚的文件为准。116.如本文所定义且使用的所有定义，都应当理解为支配所定义术语的字典定义、通过引用方式并入的文件中的定义和/或其普通含义。117.如在本文说明书和权利要求书中所用的，不定冠词“一个”和“一种”，除非有明确的相反说明，都应当理解为意指“至少一个/种”。118.如在本文说明书和权利要求书中所用的，短语“和/或”应当理解为意思是这样相结合的要素的“任一个或二者都”，即，在一些情况下这些要素以连接的方式存在，而在其他情况下这些要素以分离的方式存在。使用“和/或”列出的多个要素应当以同样的方式来解释，即，这样相结合的要素的“一个或多个”。无论与那些明确指出的要素相关还是不相关，其它要素可以在除了通过“和/或”分句明确指出的要素之外任选地存在。因此，作为非限制性示例，当与开放式语言如“包括”一起使用时，在一个实施方案中，提及“a和/或b”可以指的是仅a(任选地包括除了b之外的要素)；在另一实施方案中，可以指的是仅b(任选地包括除了a之外的要素)；在又一实施方案中，指的是a和b二者(任选地包括其它要素)；等等。119.如在本文说明书和权利要求书中所用的，“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当在列表中隔开项目时，“或”或“和/或”应解释为包含，即，包含至少一个，但也包括若干要素或一系列要素中的多于一个要素，以及任选地，其它未列出的项目。只有明确指出与此相反的术语，例如“仅其中之一”或“恰好其中之一”，或者在权利要求中使用时的“由……组成”，才指的是包含若干要素或一系列要素中的恰好一个要素。一般而言，本文中使用的术语“或”，当前面有排他性的术语时，例如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”，仅应解释为表示排他性备选方案(即，“一个或另一个，但不是二者”)。120.如在本文说明书和权利要求书中所用的，在提及一个或多个要素的列表时的短语“至少一个”，应当理解为意指选自要素列表内任何一个或多个要素中的至少一个要素，而不必包括在要素列表内具体列出的每个和各个要素中的至少一个并且不排除要素列表内的要素的任意组合。无论与那些明确指出的要素相关还是不相关，除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体指出的要素之外，该定义还允许要素可以任选地存在。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“a和b中的至少一个”(或等同地，“a或b中的至少一个”，或等同地，“a和/或b中的至少一个”)可以指的是至少一个，任选地包括不止一个a，不存在b(并且任选地包括除了b之外的要素)；在另一实施方案中，可以指的是至少一个，任选地包括不止一个b，不存在a(并且任选地包括除了a之外的要素)；在再一实施方案中，可以指的是至少一个，任选地包括不止一个a和至少一个，任选地包括不止一个b(并且任选地包括其它要素)；等等。121.当在本文中提及数字使用单词“约”时，应该理解的是，本公开的又一实施方案包括未因“约”一词的存在而修饰的该数字。122.还应理解的是，除非明确指出相反的情况，否则在本文要求保护的包括不止一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作的叙述顺序。123.在权利要求书以及上述说明书中，所有的过渡短语，例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成(composed of)”等，都应理解为开放式的，即意指包括但不限于。根据美国专利局《专利审查程序手册》第2111.03节中的规定，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡短语。









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