用于核酸转染的类脂质及其用途的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及新的可电离类脂质(lipidoid)以及这些化合物用于将核苷酸和核酸及其合成类似物转染和施用到细胞和组织中的用途。背景技术：2.近年来，基于核酸(na)的疗法的发展经历了前所未有的复兴。由于与先前测试的治疗性脱氧核糖核酸(dna)相比具有高功效且同时不良副作用风险低，因此核糖核酸(rna)疗法现在正在取得进展。几种此类药物已经达到临床应用，例如用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的帕提西兰、用于某些类型的杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy)的依特立生或用于治疗脊髓性肌萎缩的诺西那生。所有这些疾病都危及生命，并且没有针对其的替代治疗。靶向核糖核酸(rna)的潜在药物或其用途可以根据其是靶向na或蛋白质还是编码蛋白质而分为三类。第一类包括阻断信使rna(mrna)的翻译或rna剪接的13-25个核苷酸(nt)的单链反义寡核苷酸(诺西那生，依特立生)；和降解mrna的小干扰rna(sirna，21-23nt)(帕提西兰)。靶向蛋白的治疗性rna分子使用一类称为rna适体的分子。它经设计以调控具体蛋白质的功能。此类药物的实例是哌加他尼，用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性，其是2004年同类药物中第一个获批的。使用mrna的疗法主要用于制备所谓的针对癌症的个性化疫苗或针对传染病的疫苗(例如寨卡病毒，sars-cov-2)。在病毒性疾病中，基于mrna的针对狂犬病和大流行性流感的预防性疫苗的候选者已被证明在健康志愿者中诱导安全的抗体产生。针对导致covid-19大流行的病毒、即严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)的疫苗开发已经投入了巨大的努力。这些努力导致了正在分发以供广泛使用的安全和高效的mrna疫苗候选者。蛋白质-替代mrna疗法也处于临床前开发阶段，例如用于治疗血友病。3.能够直接基因组编辑的分子技术、特别是基于crispr-cas9系统的那些技术现在正在蓬勃发展。crispr技术是一种允许更改dna序列并修饰基因功能的工具。潜在应用包括修复遗传缺陷、治疗和预防疾病传播或改良农作物。crispr-cas9系统已在多项临床前和临床研究中进行了测试，包括hiv治疗、治疗血液系统恶性肿瘤和遗传病症(包括镰状细胞病和β-地中海贫血)。然后rna编辑通过adar(作用于rna的腺苷脱氨酶)系统启用，其从临床角度来看迄今为止似乎更安全。用于直接基因组编辑的分子技术可以以编码负责编辑的适当酶的mrna的形式递送至作用位点。4.能够安全使用上述所有技术(或基于na的其他技术)的关键因素是它们安全且有效地转运到作用位点。关键步骤是带负电的na穿透细胞的磷脂膜；有意引入na至真核细胞中的过程称为转染。近几十年来，大量开发了载剂(所谓的载体)以有效地将na转运穿过细胞膜，同时保护na免受体内降解(stewart,m.p.:chem.rev.2018,118,7409-7531)。5.病毒和非病毒(物理、化学)载体均用于na转染。尽管迄今为止基因治疗领域中大约70％的临床试验是使用病毒载体进行的，但这种方法存在许多风险(致癌性、免疫响应的诱导、组织非特异性、有限的na掺入能力和制造复杂性)。物理方法(例如电穿孔)很难在人医学中系统地使用。6.相比之下，合成化学载体通常具有较低的免疫原性，能够转运更大量遗传物质，并且由于它们由明确定义的分子组成，因此可以根据需要影响其结构以提高其效率并抑制毒性。阳离子聚合物或阳离子脂质用作化学载体，其与带负电荷的na形成复合物。这种复合物能够穿透细胞膜，同时保护na免于在胞外环境中降解。7.从结构的角度来看，所谓的脂质纳米颗粒(lnp)是目前这些复合物的最有前途和临床上最先进的形式。在它们中，阳离子脂质通常与防止聚集、影响粒径和转染效率的聚乙二醇化脂质以及对于稳定nk封装是必需的辅助脂质和胆固醇一起配制，例如如sirna转染系统中所示(kulkarni,j.:nanoscale,2019,11,21733–21739)。lnp可以容纳大小从几个核苷酸单位到数百万个范围内的na分子。8.合成的阳离子脂质和类脂质(类似于脂质的合成分子，区别在于有大量的疏水链)由阳离子和疏水结构域形成。迄今为止，通过靶向设计和通过测试组合生成的文库两者，已经开发了大量这些物质，在这两个结构域都具有高度的结构可变性。9.已专门开发脂质和类脂质(例如d-lin-mc3-dma、c12-200、ckk-e12、sa2-sc8和其他)用于sirna转染(dong,y.:adv.drug deliv.rev.2019,144,133–147)。一种含有d-lin-mc3-dma的制剂最近(2018年8月)以onpattro(原patisiran)的名称引入临床实践，使其成为历史上第一个获批的sirna药物(zhang,x.:j.clin.pharmacol.2020,60(1),37-49)。然而，针对sirna开发的制剂可能对mrna无效，因此必须进行靶向优化(cullis,p.:mol.ther.2017,25(7),1467–1475)。10.可电离的脂质和类脂质(例如d-lin-mc3-dma、c12-200、ckk-e12和tt3)用于转染mrna(zhong,z.:nano today 2018,23,16–39；kowalski,p.:mol.ther.2019,27(4),1-19；li,b.:nano lett.2015,15,8099-8107)。可电离脂质也用于dna转染。再次应该强调的是，针对小分子(sirna)转染所优化的转染体系并不总是适用于dna转染，并且甚至针对mrna开发的制剂也可能对dna无效(buck,j.:acs nano 2019,13,3754-3782)。11.由于事实上尽管具有巨大的治疗潜力，但迄今为止很少有基于可电离脂质的合成载体进入临床使用阶段，因此有必要开发效率更高的新体系，其还具有非常低的体内毒性。技术实现要素：12.本发明提供了使用可电离(阳离子)脂质转染和靶向递送核苷酸和核酸及其合成类似物的效率问题以及这些脂质对靶生物体或细胞的毒性问题的解决方案。出人意料地发现了如果将金刚烷用作可电离类脂质的中心核，则与先前已知的解决方案相比，此类类脂质的转染效率显著提高，尤其是在转染mrna、环状二核苷酸、sirna和dna方面。同时，这些含金刚烷的类脂质在相关剂量下表现出极低的细胞毒性。在静脉内或腹腔内施用后，它们在小鼠中没有显示出毒性迹象。用作新的可电离类脂质的中心结构部分的金刚烷核的特殊性质是其附近的空间复杂性和与目前已知的可电离的类脂质和类脂质相比的高刚性。结构上来源于金刚烷的生物活性物质的另一个优点通常是良好的生物相容性，因此适用于药物用途，特别是在人类医学中。13.本发明涉及通式i的可电离类脂质及其药学上可接受的盐、加成盐和溶剂合物[0014][0015]其中x选自由以下组成的组：-c(＝o)nh-、-c(＝o)o-、-c(＝s)o-、-c(＝o)s-、[0016]-c(＝s)s-、-c(＝o)nhnh-、-ch2-、-o-、-oc(＝o)-、-s-、-sc(＝o)-、-nh-、-nhnh-、-nhc(＝o)-、-nhnhc(＝o)-、-c≡c-、-ch＝ch-、含有至少2个氮原子的五元杂环、-ch2c(＝o)nh-、-ch2c(＝o)o-、-ch2c(＝s)o-、-ch2c(＝s)s-、-ch2c(＝o)nhnh-、-n＝ch-和-ch＝n-；[0017]y独立选自由以下组成的组：亚烷基链c2-c10，其中在所述亚烷基链中，一个或多个-ch2-基团可任选地被一个或多个o或s原子替代；[0018]z选自由以下组成的组：氢、-oh、-ch2oh、-nh2、-n+(ch3)2-(ch2)3-so3-、-n+(ch3)2-(ch2)2-coo-和-nhch3、-n(ch3)2、-n+(ch3)3、-och3、-och2ch3、-c(＝o)r1，[0019]其中r1选自-nh2、-nh(ch2)noh、-n[(ch2)noh]2、-nhch(ch2oh)2、-nhch2ch(-oh)ch2oh、-nh(ch2)nc(＝o)nh2、-n[ch2c(＝o)nh2]2、-nhch[c(＝o)nh2]2、-nh(ch2)2nhc(＝o)nh2、其中n是在2至5的范围内的整数；[0020]并且r彼此相同或不同，每个r独立选自由以下组成的组：烷基c8-c20、烯基c8-c20和炔基c8-c20，其中在所述烷基、烯基或炔基中，一个或多个-ch2-基团可任选地被选自以下的一个或多个基团替代：-ch(oh)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-s-s-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-o-和-s-。[0021]在一些实施方式中，x选自由以下组成的组：-c(＝o)nh-、-c(＝o)o-、-c(＝s)o-、-c(＝o)s-、-c(＝s)s-、-c(＝o)nhnh-、-ch2-、-o-、-s-、-nh-、-nhnh-、-nhc(＝o)-、-nhnhc(＝o)-、-c≡c-、-ch＝ch-、包含至少两个氮原子的五元杂环、-ch2c(＝o)nh-、-ch2c(＝o)o-、ch2c(＝s)o-、ch2c(＝s)s-、-ch2c(＝o)nhnh-、-n＝ch-、-ch＝n-。[0022]在一些实施方式中，y选自由以下组成的组：亚烷基链c2-c10。[0023]在一些实施方式中，z选自由以下组成的组：氢原子、-oh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-n+(ch3)3、-och3、-och2ch3、-n+(ch3)2-(ch2)3-so3-、-n+(ch3)2-(ch2)2-coo-。[0024]在一些实施方式中，z选自由以下组成的组：氢、-oh、-ch2oh、-nh2、-n+(ch3)2-(ch2)3-so3-、-n+(ch3)2-(ch2)2-coo-和-c(＝o)r1，[0025]其中r1选自-nh2、-nh(ch2)noh、-n[(ch2)noh]2、-nhch(ch2oh)2、-nhch2ch(oh)ch2oh、-nh(ch2)nc(＝o)nh2、-n[ch2c(＝o)nh2]2、-nhch[c(＝o)nh2]2、-nh(ch2)2nhc(＝o)nh2、其中n是在2至5的范围内的整数。[0026]在一些实施方式中，z选自由以下组成的组：氢、-oh、-ch2oh、-nh2、-n+(ch3)2-(ch2)3-so3-、-n+(ch3)2-(ch2)2-coo-和-c(＝o)r1，[0027]其中r1选自-nh2、-nh(ch2)2oh、-n[(ch2)2oh]2、-nhch(ch2oh)2、-nhch2ch(-oh)ch2oh、-nh(ch2)2c(＝o)nh2、-n[ch2c(＝o)nh2]2、-nhch[c(＝o)nh2]2、-nh(ch2)2nhc(＝o)nh2、[0028]术语“烷基”意指饱和烃链，它可以是直链、支化或环状或含环的。[0029]术语“烯基”意指在碳原子之间含有至少一个双键的烃链。烃链可以是直链、支化或环状或含环的。[0030]术语“炔基”意指在碳原子之间含有至少一个三键并且任选地在碳原子之间还含有一个或多个双键的烃链。烃链可以是直链、支化或环状或含环的。[0031]术语“亚烷基链”意指饱和烃链，其可以是直链、支化或环状或含环的，但优选直链。该链具有两个化合价，即它经由两个键作为接头或桥结合。[0032]当通式i的分子具有正电荷时，化合物包括反离子，其可以是有机酸或无机酸的药学上可接受的阴离子，以形成药学上可接受的盐。此类阴离子可例如选自由以下组成的组：乙酸根、天冬氨酸根、苯磺酸根、苯甲酸根、苯磺酸根、碳酸氢根、酒石酸氢根、溴离子、樟脑磺酸根、碳酸根、氯离子、柠檬酸根、癸酸根、依地酸根、乙磺酸根、富马酸根、葡庚糖酸根、葡糖酸根、谷氨酸根、乙醇酸根、己酸根、碘离子、乳酸根、苹果酸根、马来酸根、扁桃酸根、甲磺酸根、甲硫酸根、萘磺酸根、硝酸根、辛酸根、油酸根、棕榈酸根、泛酸根、磷酸根、聚半乳糖醛酸根、丙酸根、水杨酸根、硬脂酸根、琥珀酸根、硫酸根、酒石酸根和甲苯磺酸根。[0033]当式i的化合物含有手性中心时，则式i包括纯对映异构体以及对映异构体混合物，包括外消旋体。[0034]式i包括呈游离形式的式i的化合物，以及呈盐、加成盐(与酸或碱)和/或溶剂合物(包括水合物或醇溶剂合物)形式的化合物。[0035]式i中的接头x通过分子的胺部分与中心金刚烷核的附接的反应形成。因此，取决于所选择的反应，这些可能是不同的接头，所述反应例如是酯、酰胺及其类似物的形成、点击反应(例如叠氮基-炔烃环加成)等。x因此选自由以下组成的组：-c(＝o)nh-、-c(＝o)o-、-c(＝s)o-、-c(＝o)s-、-c(＝s)s-、-c(＝o)nhnh-、-ch2-、-o-、-oc(＝o)-、-s-、-sc(＝o)-、-nh-、-nhnh-、-nhc(＝o)-、-nhnhc(＝o)-、-c≡c-、-ch＝ch-、含有至少2个氮原子的五元杂环、-ch2c(＝o)nh-、-ch2c(＝o)o-、-ch2c(＝s)o-、-ch2c(＝s)s-、-ch2c(＝o)nhnh-、-n＝ch-和-ch＝n-。优选地，x选自-c(＝o)nh-、含有至少2个氮原子的五元杂环和-c(＝o)o-。[0036]接头y是亚烷基链，提供胺与接头x和金刚烷核的至少最小距离。y是c2-c10亚烷基链，优选地c2-c8亚烷基链，其中在所述亚烷基链中，一个或多个-ch2-基团可任选地被一个或多个o或s原子替代。[0037]取代基z可以在较小程度上进一步改变式i的化合物的性质。[0038]优选地，z是氢原子或-c(＝o)r1。部分-c(＝o)r1通常由胺末端分子与带有羧酸基团的中心金刚烷核的反应形成。r1因此选自由以下组成的组：-nh2、-nh(ch2)noh、-n[(ch2)noh]2、-nhch(ch2oh)2、-nhch2ch(-oh)ch2oh、-nh(ch2)nc(＝o)nh2、-n[ch2c(＝o)nh2]2、-nhch[c(＝o)nh2]2、-nh(ch2)2nhc(＝o)nh2、其中n是在2至5的范围内的整数。[0039]优选地，r1选自-nh2、-nh(ch2)2oh、-nhch(ch2oh)2。[0040]为了合成简单，r链可以彼此相同或不同，优选地它们相同，或所有氮原子被(两个相同的r或两个不同的r)相同取代。r取代基是脂肪链，并且它们选自由以下组成的组：c8-c20烷基、c8-c20烯基和c8-c20炔基，其中在所述烷基、烯基或炔基中，一个或多个-ch2-基团可任选地被选自以下的一个或多个基团替代：-ch(oh)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-ss-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-o-和-s-。优选地，取代基r选自由以下组成的组：c8-c20烷基、c8-c20烯基和c8-c20炔基，其中在所述烷基、烯基或炔基中，一个或多个-ch2-基团可任选地被选自以下的一个或多个基团替代：-ch(oh)-、-oc(＝o)-和-c(＝o)o-。[0041]优选地，r选自c10-c16烷基，其中-ch2-基团被-ch(oh)-或-c(＝o)o-替代的c10-c16烷基、含一个或两个或三个双键的c14-c20烯基、其中-ch2-基团被-c(＝o)o-或-ch(oh)-替代的含一个或两个或三个双键的c14-c20烯基。[0042]式i的化合物通过在位置7被基团z取代的金刚烷前体和在位置1、3、5的接头x的前体基团与通式x′‑y-nr2的胺的相应反应来制备，其中x′是接头x的前体基团。胺可以通过本领域技术人员已知的反应和程序制备，并且合适的胺也可商购获得。[0043]在更特定的示例中，式i的化合物优选通过[0044]使式ii的化合物[0045][0046]其中a是氢，与式iii的二胺[0047][0048]在缩合剂和碱的存在下反应来制备，或[0049]通过使通式ii的化合物(其中a是卤素)与通式iii的二胺在碱的存在下反应来制备。[0050]在式ii和iii中，z、y和r如上所述。[0051]本发明还涉及包含至少一种通式i的类脂质和至少一种辅助脂质的转染剂。可以通过组合组分来制备转染剂。呈溶液形式的转染剂可以通过溶解和混合组分来制备。呈固体形式(颗粒形式，优选纳米颗粒形式)的转染剂可以通过常规纳米颗粒技术中使用的技术(例如通过微流体混合)制备。转染剂的颗粒通常为纳米颗粒，其通常理解为意指尺寸在1至500nm范围内的颗粒。通常，纳米颗粒的尺寸在30至250nm、更优选40至150nm的范围内。[0052]优选地，转染剂含有量为10至50mol％的至少一种通式i的类脂质，和量为50至90mol％的至少一种辅助脂质。优选地，转染剂含有量为15至30mol％的至少一种通式i的类脂质，和量为70至85mol％的至少一种辅助脂质。在一些优选的实施方式中，转染剂包含量为15至30mol％的至少一种通式i的类脂质、量为30至55mol％的胆固醇以及量为20至50mol％的至少一种其他辅助脂质。[0053]在特别优选的实施方式中，转染剂含有量为15至30mol％的至少一种通式i的类脂质、量为30至55mol％的胆固醇、量为20至45mol％的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和量为0.5至5mol％的1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。[0054]本发明还涉及包含至少一种式i的类脂质、至少一种核酸和/或其部分和/或核酸衍生物和优选地还有至少一种辅助脂质的转染颗粒。例如，可以通过将任选含有辅助脂质的通式i的类脂质的溶液与核酸和/或其部分和/或核酸衍生物的溶液混合来制备转染颗粒。可以通过常规纳米颗粒技术中使用的技术进行混合，例如通过微流体混合。[0055]转染颗粒中核酸和/或其部分和/或核酸衍生物的总量与通式i的类脂质和辅助脂质的总量的重量比优选在1:2至1:500、更优选1:5至1:100的范围内。具体且为了说明：在下文实施例中制备的颗粒中，该比率对于mrna约为1:9并且对于sirna约为1:68。[0056]转染颗粒通常是纳米颗粒，其通常理解为意指尺寸在1至500nm范围内的颗粒。通常，转染纳米颗粒的尺寸在30至250nm、优选40至200nm、更优选40至150nm的范围内。[0057]通过低温透射电子显微术观察转染颗粒的结构，并且观察表明转染颗粒为内部含有核酸(或其部分或衍生物)的致密层状脂质纳米颗粒。[0058]转染试剂和转染颗粒中的辅助脂质主要是中性脂质、甾醇或含亲水聚合物的脂质缀合物。[0059]中性脂质在生理ph下的净电荷为零，并且它们可以在生理ph下以不带电形式或电中性两性离子形式存在，诸如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(cyanine 5)。[0060]例如，甾醇可以选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、岩藻甾醇、燕麦甾醇、粪甾醇、菜籽甾醇、麦角甾醇和9,11-脱氢麦角甾醇。优选地，甾醇是胆固醇。[0061]具有亲水性聚合物的脂质缀合物包含脂质部分和聚合物部分，诸如聚(乙二醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(甘油)、聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚(肌氨酸)或乙二醇壳聚糖。优选地，聚合物部分由分子量范围可为约500至约10,000da、更优选约1,000至约5,000da的聚(乙二醇)组成。具有亲水性聚合物的脂质缀合物可以例如选自1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚(乙二醇)-2000、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)-2000、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)-2000、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)-2000等。具有亲水性聚合物的脂质缀合物可以优选为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚(乙二醇)-2000。[0062]核酸或其部分是含有一种或多种核苷酸和/或脱氧核苷酸的部分。核酸或其部分可以是治疗剂、诊断剂或预防剂，或者可以为它们转染到其中的细胞或组织提供标记。因此，式i的化合物主要具有治疗或生物技术用途。[0063]术语“核酸或其部分”理解为意指优选选自以下的核酸或其区段：寡核苷酸(1-100个核苷酸，例如适体)、环状二核苷酸(例如2’,3’‑cgamp)、反义寡核苷酸、脱氧核糖核酸(单链dna，双链dna、cdna、编码一种或多种基因的质粒dna)、核糖核酸，通常是信使rna (mrna)、转移rna(trna)、小干扰rna(sirna)、双链rna、微小-rna(mirna)、piwi-rna(pirna)、反义rna(asrna)、用于crispr系统的引导rna(grna)及其组合(通常，例如编码cas9核酸酶、cas13a/c2c2和cas13b或类似核酸酶的grna和mrna，适用于crispr、crispri及其他变体和随后修饰宿主细胞或组织基因组或者修饰宿主细胞或组织转录组)。此外，本文所公开的所有核酸(na)可以用合成碱基类似物形成或修饰，例如以增加它们在生物系统中的稳定性。合成na类似物特别是涉及以下取代：在链的5'和/或3'末端处的磷酸化，5-甲基胞苷-5'-三磷酸、n1-甲基假尿苷-5'-三磷酸、p1-(5'-(3'-o-甲基)-7-甲基-鸟苷基)-p3-(5'-(鸟苷基))三磷酸、p1-(鸟苷基)p3-(5'-(鸟苷基))三磷酸、p1-(5'-7-甲基-鸟苷基)p3-(5'-(鸟苷基))三磷酸、p1-(5'-2,2,7-三甲基-鸟苷基)p3-(5'-(鸟苷基))三磷酸、n6-甲基腺苷-5'-三磷酸、2-硫代尿苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、5-甲氧基尿苷-5'-三磷酸、n1-甲基腺苷-5'-三磷酸、n4-乙酰基胞苷-5'-三磷酸、2'-o-甲基、2'-o-甲氧基乙基、2'-氟、在戊糖环(所谓的锁核酸)的2'-氧和4'-碳之间的亚甲基桥、硼代膦酸酯(boranophosphonate)或硫代磷酸酯(phosphorothioate)。[0064]本发明进一步包括式i的类脂质或转染剂或转染颗粒在体外用核酸和/或其部分和/或核酸衍生物转染细胞或组织的用途。此外，本发明包括类脂质或转染颗粒用于在体内用核酸和/或其部分和/或核酸衍生物转染细胞或组织的式i的用途(排除用于工业或商业用途的人胚胎转染，和排除人类种系的修饰)。[0065]含有通式i的类脂质的转染颗粒可用于基础研究中的许多生物学应用，特别是用于转染细胞培养物或动物以递送活性核酸和随后的一种或多种染色体基因的沉默或激活、基因组编辑(基因切除、基因插入或突变引入)或转录组编辑，或能够表达由通过转染颗粒插入的核酸编码的给定蛋白质(所谓的“反式”)。[0066]在兽医和人类医学中，含有通式i的类脂质的转染颗粒可以优选用于治疗或预防目的。可以将含有治疗性核酸的颗粒施用给动物或人类以沉默或激活染色体基因、以沉默或激活免疫原、以抑制或激活信号传导通路、以编辑基因组(基因切除、基因插入或突变引入)或转录组，或能够表达由核酸编码的蛋白质。[0067]本发明还提供了用作药物、特别是用于基因疗法的通式i的类脂质或转染剂或转染颗粒。具体地，它们适用于治疗恶性肿瘤和/或遗传病症。[0068]通式i的类脂质或转染颗粒可以与药学上可接受的赋形剂配制成制剂形式用于治疗、美容或生物技术用途。制剂可以是液体或固体形式，或其他形式，诸如气雾剂。液体形式包括溶液、混悬液、分散体，适用于例如用于注射或口服施用。固体形式包括例如胶囊剂、片剂、包衣片剂、粉剂、栓剂和其他形式。[0069]液体制剂可以被雾化。雾化的混悬液可以直接从雾化设备吸入，或者雾化设备可以连接到面罩帐或间歇正压呼吸机。[0070]固体剂型也可以使用干粉吸入器经由吸入施用。混悬液或干粉制剂可以通过以适当方式递送药物组合物的设备经口或经鼻施用。[0071]为了将活性物质递送到皮肤或粘膜上，具有活性物质的转染颗粒也可以制成乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂、香膏剂、液体的形式。这些局部形式可以直接施加至作用位点。[0072]药学上可接受的赋形剂包括溶剂、溶解度控制剂、ph调节剂、载体、填充剂、粘合剂、助流剂、崩解剂、保护剂、吸附剂、粘度控制剂、影响感官特性(诸如制剂的味道、气味或颜色)的剂。[0073]此外，通式i的类脂质或转染剂或转染颗粒可以优选用于美容品工业的目的，以便将活性物质递送至作用位点。具有活性物质的转染颗粒可以制备成霜剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂、香膏剂、液体等形式，并用作化妆品、美发化妆品或个人卫生用品。附图说明[0074]图1.类脂质4a-g的合成方案。[0075]图2.类脂质9的合成方案。[0076]图3.类脂质13的合成方案。[0077]图4.化合物19，类脂质21的前体的合成方案。[0078]图5.类脂质21的合成方案。[0079]图6.化合物22及其酰氯，类脂质23-25的前体的合成方案。[0080]图7.类脂质23-25的合成方案。[0081]图8.类脂质29a-f的合成方案。[0082]图9.类脂质31a-d的合成方案。[0083]图10.mrna-lnp(b39)至鼠肝的功能性递送的测试。具体实施方式[0084]缩写列表：[0085]eq.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ当量[0086]rfꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ滞留因子[0087]tlcꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ薄层色谱[0088]rveꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ旋转真空蒸发器[0089]rtꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ室温[0090]br sꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ宽信号[0091]sꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ单重峰[0092]dꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ双重峰[0093]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ多重峰[0094]ddꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二双重峰[0095]jꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ交互作用常数[0096]δꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ化学位移[0097]hrmsꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ高分辨率质谱[0098]esiꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ电喷射离子化[0099]maldiꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ基质辅助激光解吸/电离[0100]irꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ红外光谱法[0101]nmrꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ核磁共振[0102]ce5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ环己烷-乙酸乙酯混合物95:5(v/v)[0103]ce20ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ环己烷-乙酸乙酯混合物80:20(v/v)[0104]ce50ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ环己烷-乙酸乙酯混合物50:50(v/v)[0105]d1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二氯甲烷-甲醇-25％水性nh3混合物75::3(v/v/v)[0106]d2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二氯甲烷-甲醇-25％水性nh3混合物175:22:3(v/v/v)[0107]d3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二氯甲烷-甲醇-25％水性nh3混合物275:22:3(v/v/v)[0108]d4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二氯甲烷-甲醇-25％水性nh3混合物375:22:3(v/v/v)[0109]tfaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ三氟乙酸[0110]hctuꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀo-(1h-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐[0111]dipeaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀn,n-二异丙基乙胺[0112]dmfꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀn,n-二甲基甲酰胺[0113]dcmꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二氯甲烷[0114]acnꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ乙腈[0115]tbdpsclꢀꢀꢀꢀꢀ叔丁基二苯基氯硅烷[0116]dicꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二异丙基碳二亚胺[0117]dmapꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ4-二甲基氨基吡啶[0118]lnpꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ脂质纳米颗粒[0119]naꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ核酸[0120]dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ脱氧核糖核酸[0121]rnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ核糖核酸[0122]mrnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ信使rna[0123]sirnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ小干扰rna[0124]trnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ转移rna[0125]mirnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ微小rna[0126]ssdna/rnaꢀꢀꢀ单链dna/rna[0127]dsdna/rnaꢀꢀꢀ双链dna/rna[0128]dmg-peg2000 1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000[0129]dopeꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[0130]dopcꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱[0131]dspcꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱[0132]dope-cy5ꢀꢀꢀꢀ1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(cyanine 5)[0133]lip2000ꢀꢀꢀꢀ2000(invitrogen)[0134]实施例1[0135]n1,n1-双十二烷基乙-1,2-二胺3a[0136]将装有氯钙盖和磁力搅拌器的500ml圆底烧瓶用胺1a(5.00g，31.2mmol)于dcm(100ml)中的溶液填充，并在冰浴中冷却至0℃。在剧烈搅拌下，加入正十二烷基醛(20.8ml，93.6mmol，3eq.)，然后在10分钟内分三份加入三乙酰氧基硼氢化钠(19.8g，93.6mmol，3eq.)。移去冷却浴，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。在用氨预饱和的tlc板上(用茚三酮检测)，使用80:20(v/v)己烷-乙酸乙酯流动相通过tlc监测反应进程。反应完成后，加入naoh水溶液(1m，200ml)，将反应混合物搅拌15分钟，然后倒入分液漏斗中并用水(300ml)稀释。将产物用dcm(300ml，2x50ml)萃取，将合并的有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并在rve中蒸发溶剂。使用乙酸乙酯于己烷(10-30％)中的的线性梯度，通过硅胶柱色谱纯化深色油状残余物。获得呈淡黄色油状物的胺2a(5.12g，33.0％)。[0137]将三氟乙酸(10ml)添加到化合物2a(5.12g)于dcm(10ml)中的溶液，在冰浴中搅拌下冷却至0℃，并将反应混合物在0℃下放置3小时。然后将溶液倒入1l分液烧瓶中，用20％na2co3水溶液(300ml)稀释，并将产物用dcm(250ml，2x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱使用d1于dcm(0-70％)中的线性梯度纯化。获得呈淡黄色油状物形式的二胺3a(2.55g，62.4％；rf0.46于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝2.895,2.64,2.48,1.45,1.28,1.26,1.24–1.28,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝54.31,53.85,38.33,31.90,29.65,29.62,29.61,29.52,29.34,26.36,23.88,22.67,14.10ppm。ir(膜):νmax/cm-1＝3371w和3315w(νnh2),2801m(νs n-ch2),2953s(νas ch3),2924vs(νas ch2),2853s(νs ch2),1467m和1457m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w和1367w(δsch3),721m(βas ch2)。hrms(esi):m/z c26h57n2[m+h]+的计算值397.45163；实测值397.45093。[0138]n1,n3,n5-三(2-(双十二烷基氨基)乙基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4a[0139]将o-(1h-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(hctu，256mg，0.596mmol，4eq.)和n,n-二异丙基乙胺(dipea，0.415ml，2.39mmol，16eq.)添加至金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)于无水dmf(1.5ml)中的溶液，并将溶液在室温下搅拌15分钟。然后加入n1,n1-双十二烷基乙-1,2-二胺3a(237mg，0.149mmol，4eq.)于dcm(1.0ml)中的溶液，并将反应混合物搅拌12小时。将溶液倒入250ml分液烧瓶中，用饱和nahco3水溶液(50ml)稀释，并将产物用dcm(50ml，2x20ml)萃取。将合并的有机相用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱使用d1于dcm(20-50％)中的线性梯度纯化。获得呈粘稠淡黄色油状物的形式的类脂质4a(71mg，33.9％；rf0.73于d2中，于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.33,3.56,3.32,3.125,3.075,2.34,2.01,1.91,1.79,1.67,1.36,1.285,1.26–1.32,1.25,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝180,48,56.72,53.78,41.38,39.04,36.86,36.29,31.90,29.64,29.62,29.50,29.40,29.35,29.04,27.79,26.36,23.88,22.68,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3440w和3322w(νnh),1653w(酰胺i)和1623w(酰胺i结合),1535w(酰胺ii),2956m(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855m(νs ch2),1467w和1457w(βs ch2和δas ch3),1378w(δsch3)。hrms(maldi):m/z c91h179n6o3[m+h]+的计算值1404.4033；实测值1404.4012。[0140]实施例2[0141]n1,n1-双十二烷基丙-1,3-二胺3b[0142]胺2b根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1b(6.0g，34.43mmol)、正十二烷基醛(22.91ml，103.30mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(21.89g，103.30mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺2b(7.72g，43.9％)。[0143]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行胺2b的脱保护；获得呈淡黄色油状物形式的二胺3b(4.26g，68.6％；rf0.35于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝3.07,2.70,2.50,1.81,1.46,1.28,1.26,1.25–1.29,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝53.70,53.30,41.18,31.90,29.64,29.62,29.60,29.58,29.48,29.33,27.42,25.71,23.87,22.67,14.10ppm。ir(膜):νmax/cm-1＝3361w和3274w(νnh2),2803m(νs n-ch2),2954s(νas ch3),2924vs(νas ch2),2853s(νs ch2),1467m和1456m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w和1364w(δs ch3),720m(βas ch2)。hrms(esi):m/zc27h59n2[m+h]+的计算值411.46728；实测值411.46652。[0144]n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4b[0145]类脂质4b根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(20mg，0.075mmol)、hctu(128mg，0.298mmol，4eq.)、dipea(0.208ml，1.19mmol，16eq.)和二胺3b(123mg，0.298mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠黄色油状物的类脂质4b(64mg，59.3％；rf 0.51于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.59,3.36,2.99,2.88,2.31,2.13,2.00,1.96,1.81,1.67,1.31,1.28,1.25-1.30,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177,39,55.22,50.70,41.78,40.38,37.20,35.67,31.89,29.60,29.51,29.48,29.32,29.19,28.39,26.94,24.10,23.68,22.67,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3466w和3287w(νnh),1656m(酰胺i)和1511m(酰胺ii),2814w(νs ch2nr2),2954s(νas ch3),2927vs(νas ch2),2871m(νs ch3),2855s(νs ch2),1468m和1456m(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3),721w(βas ch2)。hrms(maldi):m/z c94h185o3n6[m+h]+的计算值1446.45027；实测值1446.44896。[0146]实施例3[0147]n1,n1-双十二烷基丁-1,4-二胺3c[0148]胺2c根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1c(5.0g，26.56mmol)、正十二烷基醛(17.67ml，79.67mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(16.89g，79.67mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺2c(4.15g，29.8％)。[0149]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行胺2c的脱保护；获得呈淡黄色油状物形式的二胺3c(2.36g，70.3％：rf 0.29于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝2.85,2.81,2.59,1.725,1.68,1.51,1.28,1.265,1.25–1.30,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝53.33,52.74,40.44,31.90,29.64,29.60,29.60,29.40,29.33,28.65,27.46,24.83,24.40,22.67,14.10ppm。ir(膜):νmax/cm-1＝3370w和3274w(νnh2),2798m(νs n-ch2),2957s(νas ch3),2924vs(νas ch2),2853s(νs ch2),1467m和1456m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w和1367w(δs ch3),720m(βas ch2)。hrms(esi):m/z c28h61n2[m+h]+的计算值425.48293；实测值425.48227。[0150]n1,n3,n5-三(4-(双十二烷基氨基)丁基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4c[0151]类脂质4c根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)、hctu(256mg，0.596mmol，4eq.)、dipea(0.416ml，2.39mmol，16eq.)和二胺3c(253mg，0.596mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物形式的类脂质4c(64mg，28.8％；rf 0.48于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.27,3.335,3.03,2.98,2.28,2.12,2.06,1.875,1.81,1.74,1.64,1.33,1.28,1.25–1.29,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177.27,52.78,52.27,41.83,40.26,37.36,37.20,31.88,29.58,29.49,29.43,29.31,29.10,28.37,26.82,26.56,22.94,22.66,20.79,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3441w和3329w(νnh),1641m(酰胺i),1534w(酰胺ii),2956m(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855m(νs ch2),1466m和1458m(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3)。hrms(maldi):m/z c97h191n6o3[m+h]+的计算值1488.4972；实测值1488.4956。[0152]实施例4[0153]n1,n1-双十二烷基戊-1,5-二胺3d[0154]胺2d根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1d(5.0g，24.72mmol)、正十二烷基醛(16.45ml，74.15mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(15.71g，74.15mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺2d(6.01g，45.1％)。[0155]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行胺2d的脱保护；获得呈淡黄色油状物的二胺3d(4.32g,88.3％；rf 0.28于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝2.75,2.68,2.55,1.565,1.53,1.50,1.35,1.28,1.27,1.24–1.28,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝53.61,53.55,41.48,32.10,31.89,29.63,29.61,29.58,29.45,29.32,27.41,25.74,24.90,24.55,22.66,14.09ppm。ir(薄膜):νmax/cm-1＝3367w和3284w(νnh2),2797m(νs n-ch2),2956s(νas ch3),2924vs(νas ch2),2853s(νs ch2),1467m和1456m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w和1367w(δs ch3),720m(βas ch2)。hrms(esi):m/z c29h63n2[m+h]+的计算值439.49858；实测值439.49783。[0156]n1,n3,n5-三(5-(双十二烷基氨基)戊基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4d[0157]类脂质4d根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)、hctu(256mg,0.596mmol,4eq.)、dipea(0.416ml,2.39mmol,16eq.)和二胺3d(262mg,0.596mmol,4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质4d(74mg,32.4％；rf 0.49于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝6.91,3.27,2.99,2.29,2.09,1.97,1.82,1.81,1.76,1.59,1.45,1.34,1.28,1.25-1.30,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177.01,52.77,52.30,41.82,40.10,38.33,37.59,31.88,29.58,29.48,29.43,29.30,29.09,28.53,28.39,26.84,23.83,23.09,23.02,22.66,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3322w(νnh),1640m(酰胺i),1535w(酰胺ii),2956m(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855m(νs ch2),1467m和1457m(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3),722m(βas ch2)。hrms(maldi):m/z c100h197n6o3[m+h]+的计算值1530.5442；实测值1530.5478。[0158]实施例5[0159]n1,n1-双十二烷基己-1,6-二胺3e[0160]胺2e根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1e(5.0g，23.11mmol)、正十二烷基醛(15.38ml，69.34mmol,3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(14.70g，69.34mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺2e(3.67g，28.7％)。[0161]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行胺2e的脱保护；获得呈淡黄色油状物的二胺3e(2.17g，72.2％；rf 0.31于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝2.73,2.65,2.57,1.56,1.52,1.51,1.36,1.31,1.28,1.25–1.29,1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝53.51,53.20,41.62,32.40,31.89,29.63,29.61,29.57,29.44,29.32,27.39,27.09,26.53,25.65,25.02,22.66,14.10ppm。ir(膜):νmax/cm-1＝3374w和3294w(νnh2),2797m(νs n-ch2),2956s(νas ch3),2924vs(νas ch2),2853s(νsch2),1467m和1455m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w和1367w(δs ch3),721m(βas ch2)。hrms(esi):m/z c30h65n2[m+h]+的计算值453.51423；实测值453.51340。[0162]n1,n3,n5-三(6-(双十二烷基氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4e[0163]类脂质4e根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)、hctu(256mg，0.596mmol，4eq.)、dipea(0.416ml，2.39mmol，16eq.)和二胺3e(270mg，0.596mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质4e(91mg，38.8％；rf 0.52于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.80,3.33,3.03,2.99,2.37,2.27,2.02,1.92,1.81,1.76,1.62,1.43,1.41,1.34,1.285,1.26–1.30,1.24,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177.87,52.87,52.26,41.74,39.31,36.86,31.90,29.60,29.50,29.44,29.32,29.10,28.26,26.82,25.77,25.52,23.44,23.14,22.68,14.12ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3463w和3327w(νnh),1641m(酰胺i),1535m(酰胺ii),2958s(νas ch3),2871s(νs ch3),1467m和1457m(βsch2和δas ch3),2927s(νas ch2),2855s(νs ch2),1378w(δs ch3),721w(βas ch2),2799w(νs ch2nr2)。hrms(maldi):m/z c103h203n6o3[m+h]+的计算值1572.5911；实测值1572.5881。[0164]实施例6[0165]n1,n1-双十二烷基庚-1,7-二胺3f[0166]胺2f根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1f(1.0g，4.34mmol)、正十二烷基醛(3.14ml，13.02mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.76g，13.02mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺2f(1.74g，70.6％)。[0167]根据实施例1中的对2a所述的程序在tfa(4ml)和dcm(4ml)的混合物中进行胺2f的脱保护；获得呈淡黄色油状物的二胺3f(0.842g，59.1％；rf 0.38于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝2.73,2.69,2.64,1.56,1.50,1.30,1.28,1.25-1.31,1.25,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝53.37,53.20,41.62,32.22,31.89,27.10–29.60,26.57,25.14,22.66,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3391vw(νas nh2)；2960s,sh(νas ch3)；2927vs(νas ch2)；2872s,sh(νs ch3)；2855vs(νs ch2)；2798m(νs n-ch2)；1467s和1458m(βs ch2和δas ch3)；1378w(δs ch3)；1302w(γs ch2)；721w(βas和γas ch2)。hrms(esi):m/z c31h67n2[m+h]+的计算值467.52988；实测值467.52974。[0168]n1,n3,n5-三(7-(双十二烷基氨基)庚基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺4f[0169]类脂质4f根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)、hctu(256mg，0.596mmol，4eq.)、dipea(0.416ml，2.39mmol，16eq.)和二胺3f(278mg，0.596mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质4f(199mg，82.6％；rf0.55于用氨预饱和的tlc板上的流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝(2.57g，67.82mmol，2.5eq.)，并将反应混合物在0℃下搅拌3.5小时。将溶液倒入1000ml分液烧瓶中，用水(100ml)和盐水(100ml)稀释，并将产物用乙酸乙酯(300ml，50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱使用乙酸乙酯于环己烷(0-20％)中的线性梯度纯化。获得呈无色油状物的氯醇5(2.79g，46.6％；rf 0.42于流动相ce20中，用kmno4检测)。[0179]将naoh(11.37g，0.284mmol，22.5eq.)于水(49ml)中的溶液添加至氯醇5(2.79g，12.64mmol)于二噁烷(38ml)中的溶液，并将混合物在35℃下搅拌30小时。然后将溶液倒入500ml分液烧瓶中，用水(100ml)稀释，并将产物用dcm(100ml，50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱使用乙酸乙酯于环己烷(0-5％)中的线性梯度纯化。获得呈无色油状物的环氧化物6(1.797g，77.2％；rf 0.38于流动相ce5中，用磷钼酸/ce4+检测)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝0.92(t,j＝6hz,3h),1.29-1.60(m,18h),2.47-2.49(m,1h),2.76-2.78(m,1h),2.90-2.95(m,1h)ppm。13c nmr(101mhz,cdcl3)δ＝14.11,22.68,25.97,29.33,29.45,29.56,29.59,31.90,32.50,47.14,52.42ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝环氧树脂:2997w,sh(νas ch2)；1482w,1410w,1130w(δs o-ch2)；1259w(νs骨架，呼吸道)；917w(δas环)；896vw(δas coc)；alif.链：2957s(νas ch3)；2928vs(νas ch2)；2872m(νs ch3)；2856s(νs ch2)；1467m和1458m(βs ch2和δas ch3)；1379w(δs ch3),hrms(ei):m/z c12h24o[m]+计算值184.1827；实测值184.1832。[0180]n1,n1-双(2-羟基十二烷基)己-1,6-二胺8[0181]将胺1e(0.86g，3.98mmol)和环氧化物6(1.76g，9.54mmol，2.4eq.)在4ml玻璃小瓶中混合，并将混合物在氩气气氛下在存在在溶剂下加热至80℃持续24小时。将所得的淡黄色液体通过硅胶柱色谱使用d1于dcm(0-30％)中的线性梯度纯化。获得呈淡黄色油状物的胺7(1.98g，85.1％；rf 0.51于流动相d3中，用茚三酮检测)。[0182]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序，在tfa(4ml)和dcm(6ml)的混合物中进行胺7的去保护；获得呈粘稠淡黄色油状物的二胺8(1.271g，77.4％；rf 0.20于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝3.65,3.63,2.84,2.82,2.565,2.55,2.41,2.325,1.60,1.59,1.41,1.38,1.35,1.30–1.48,1.28,1.25–1.29,1.25,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝69.39,67.71,62.72,61.05,55.78,54.77,40.86,40.56,35.22,35.08,31.90,30.45,29.6–29.9,29.33,25.65–26.77,22.67,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3412w,vbr(νoh)；1077w,vbr(νc-oh)；1621vw,vbr(βs nh2)；1090w(νc-nh2)；2956m,sh(νas ch3)；2928vs(νas ch2)；2871m(νs ch3)；2855s(νs ch2)；2810w,sh(νsn-ch2)；1467w和1457w(βs ch2和δas ch3)；1378vw(δs ch3)；722vw(βas和γas ch2)。hrms(esi):m/z c30h65n2o2[m+h]+的计算值485.50406；实测值485.50461。[0183]n1,n3,n5-三(6-(双(2-羟基十二烷基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺9[0184]类脂质9根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(40mg，0.149mmol)、hctu(256mg，0.596mmol，4eq.)、dipea(0.416ml，2.39mmol，16eq.)和二胺8(289mg，0.596mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质9(188mg，75.5％；rf 0.43于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝6.97,4.10,4.075,4.04,4.00,3.38,3.31,3.28,3.24,3.21,3.19,3.16,3.11,2.34,2.14,1.93,1.87,1.28,1.25–1.31,1.25,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177.50,66.38,65.92,65.10,64.73,61.43,61.23,60.55,59.64,57.63,54.48,53.38,41.70,39.42,39.23,37.16,31.90,29.63,29.56,29.52,29.34,28.39,22.68,14.11ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3300-3500m,br(νoh)；1090w(νc-oh)；3439w(游离)和3344w(结合)(νnh)；1635m(酰胺i)；1536m(酰胺ii)；2956m,sh(νas ch3)；2873m,sh(νs ch3)；2927vs(νas ch2)；2855s(νs ch2)；1378w(δs ch3)；2808w,sh(νs ch2nr2)；721w(βs ch2)。hrms(maldi):m/z c103h203n6o9[m+h]+的计算值1668.5612；实测值1668.5628。[0185]实施例9[0186]亚油醛10[0187]将戴斯-马丁高碘烷(4.45g，10.49mmol，1.3eq.)添加到亚油醇(2.50ml，8.07mmol)于dcm(120ml)中的溶液中，在冰浴中冷却至0℃，并将混合物在0℃下搅拌4小时。然后将反应物通过添加硫代硫酸钠溶液(20g na2s2o3.5h2o/100ml h2o)和饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)猝灭，并在室温搅拌1小时直到最初的乳状溶液变澄清。将溶液倒入1000ml分液烧瓶中，用水(150ml)稀释，并将产物用dcm(150ml，2x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(150ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗物质通过硅胶柱色谱(等度条件，5％乙酸乙酯于环己烷中)纯化。获得呈无色油状物的醛10(1.271g，59.6％；rf0.36于流动相ce5中，用kmno4检测)。[0188]n1,n1-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)己-1,6-二胺12[0189]胺11根据实施例1中的对化合物2a所述的程序从胺1e(0.345g，1.59mmol)、醛10(1.27g，4.78mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(1.01g，4.78mmol，3eq.)制备。获得呈淡黄色油状物的胺11(1.08g，94.9％；rf0.18于流动相ce20中，用茚三酮检测)。[0190]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序，在tfa(4ml)和dcm(5ml)的混合物中进行胺11的去保护；获得呈淡黄色油状物的二胺12(0.594g，64.0％；rf 0.13于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.30–5.40,2.765,2.73,2.67,2.59,2.04,1.51,1.385,1.37,1.34,1.295,1.29,1.28–1.34,1.28,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝130.19,130.06,127.99,127.89,53.49,53.45,41.67,32.52,31.50,29.62,29.46,29.20–29.48,27.37,27.20,27.18,26.52,25.61,22.56,14.06ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3011s(νas＝ch)；1646-1673m(νc＝c)；3455w(νas nh2)；3394(νs nh2)；1620w(βs nh2)；1087m(νc-nh2)；2957s,sh(νas ch3)；2928vs(νas ch2)；2873s,sh(νs ch3)；2856vs(νs ch2)；2801m(νs n-ch2)；1467m和1457m,sh(βs ch2和δas ch3)；1378m(δs ch3)；721m(βas和γas ch2)。hrms:m/z c42h81n2[m+h]+的计算值613.63943；实测值613.63899。[0191]n1,n3,n5-三(6-(双((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺13[0192]类脂质13根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(30mg，0.112mmol)、hctu(192mg，0.447mmol，4eq.)、dipea(0.312ml，2.39mmol，16eq.)和二胺12(274mg，0.447mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质13(154mg，67.1％；rf 0.48于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝6.32,5.37,5.32,3.23,2.76,2.31,2.04,1.90,1.81,1.52,1.35,1.305,1.295,1.29,1.28-1.35,1.28,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.42,130.21,129.99,128.04,127.87,52.94,41.72,39.98,1.39(m,6h),1.51-1.66(m,4h),2.34(t,j＝7.5hz,2h),3.65(t,j＝6.5hz,2h),7.36-7.44(m,6h),7.66-7.68(m,4h)ppm。13c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝19.23,24.63,25.59,26.89,28.97,29.02,32.48,33.95,63.91,127.57,129.49,134.15,135.58,179.60ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3534w(νoh,单体)；3100w,2740w,2674w(νoh,二聚体)；1711vs(νc＝o)；1413w,1289w(νco和δcoh)；2561m,sh(tbu,νas ch3)；2898m,sh(tbu,νs ch3)；1590w；1487w(19a)；1463m,1472m(tbu,δas ch3)；1429m(19b)；1390w,1362w(tbu,δs ch3)；1112s,(νas cosi)；1093m(18b)；1030w；1008w(δph-si)；940w(r ch3)；701s(4)；688w(sioc)；622w(6b)；614m(6a)；505w(16b)；2932s(νas ch2)；2858m(νs ch2)。hrms(esi):m/z c24h33o3si[m+h]+的计算值397.22044；实测值397.22018。[0199](z)-壬-2-烯-1-基-8-羟基辛酸酯17[0200]将二异丙基碳二亚胺(1.08ml，6.90mmol，1.1eq.)和4-二甲基氨基吡啶(23.0mg，0.188mmol，0.03eq.)添加至酸15(2.50g，6.27mmol)于dcm(100ml)中的溶液，在冰浴中冷却至0℃，并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后添加反式-2-壬烯-1-醇(1.37ml，8.15mmol，1.3eq.)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将溶剂于rve中蒸发，并将残余物通过硅胶柱色谱(等度条件，5％乙酸乙酯于环己烷中)纯化。获得呈无色油状物的酯16(2.784g,84.9％；rf 0.61于流动相ce5中，用kmno4检测)。[0201]将四丁基氟化铵一水合物(2.95g，10.56mmol，2eq.)于四氢呋喃(10ml)中的溶液添加到酯16(2.76g，5.28mmol)于四氢呋喃(40ml)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌20小时。将溶液倒入500ml分液烧瓶中，用10％氯化铵水溶液(150ml)稀释，并将产物用二乙醚(150ml，50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并在rve中蒸发溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱使用乙酸乙酯于环己烷(0-45％)中的线性梯度纯化。获得微淡黄色油状物的醇17(1.311g，87.3％；rf 0.61于流动相ce50中，用kmno4检测)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝0.87(t,j＝6hz,3h),1.26-1.38(m,14h),1.51-1.66(m,4h),2.07-2.12(m,2h),2.30(t,j＝7.5hz,2h),3.63(t,j＝6.6hz,2h),4.61-4.62(m,2h),5.48-5.55(m,1h),5.60-5.67(m,1h)ppm。13c nmr (101mhz,cdcl3):δ＝14.07,22.60,24.88,25.54,27.54,28.86,29.02,29.07,29.39,31.68,32.68,34.30,60.22,62.97,123.34,135.45,173.75ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3637w,3453w(νoh)；1056m(νc-oh)；1736vs(νc＝o)；1238m,1170s(νc-o)；3025w(νas＝ch)；1659w(νc＝c)；1419w(ρ＝c-h)；2955s(νas ch3)；2931vs(νas ch2)；2858s(νs ch2)；2872s,sh(νs ch3)；1466m和1457m(βs ch2和δas ch3)；1378m(δs ch3)；722m(βas和γas ch2)。hrms(ei):m/z c17h32o3[m]+的计算值284.2351；实测值284.2355。[0202](z)-壬-2-烯-1-基-8-氧代辛酸酯18[0203]将戴斯-马丁高碘烷(2.46g，5.80mmol,1.3eq.)添加到醇17(1.27ml，4.46mmol)于dcm(100ml)中的溶液中，在冰浴中冷却至0℃，并将混合物在0℃下搅拌4小时。然后将反应物通过添加硫代硫酸钠溶液(10g na2s2o3.5h2o/50ml h2o)和饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)猝灭，并在室温下搅拌1小时直到最初的乳状溶液变澄清。将溶液倒入500ml分液烧瓶中，用水(100ml)稀释，并将产物用dcm(100ml，50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(150ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并在rve中蒸发溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱使用乙酸乙酯于环己烷(0-30％)中的线性梯度纯化。获得呈无色油状物的醛18(0.573g，45.4％；rf 0.49于流动相ce20中，用kmno4检测)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝0.88(t,j＝7hz,3h),1.26-1.38(m,14h),1.59-1.67(m,4h),2.07-2.12(m,2h),2.30(t,j＝7.5hz,2h),2.40-2.44(m,2h),4.61-4.63(m,2h),5.48-5.55(m,1h),5.61-5.68(m,1h),9.76(t,j＝1.8hz,1h)ppm。13c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝14.07,21.86,22.60,24.71,27.54,28.77,28.83,28.86,29.39,31.68,34.19,43.79,60.25,123.31,135.49,173.59,202.62ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝2818m,2716m(醛,νch)；1733vs(醛,νc＝o)；1395m,sh(醛,δoch)；1733vs(νc＝o)；1244m,1172s(νc-o)；3026m(νas＝ch)；1659w(νc＝c)；2956s(νas ch3)；2930vs(νas ch2)；2858s(νs ch2)；2873s,sh(νs ch3)；1466m a 1462m(βs ch2 aδas ch3)；1378m a 1373m(δs ch3)。hrms(esi):m/zc17h29o4[m-h]-的计算值297.20713；实测值297.20722。[0204]n1,n1-双(8-((z)-壬-2-烯-1-基)氧基-8-氧代辛基)己-1,6-二胺20[0205]胺19根据实施例1中的对2a所述的程序从胺1e(140mg，0.647mmol)、醛18(0.548g，1.94mmol，3eq.)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.411g，1.94mmol，3eq.)制备，不同之处在于将反应混合物在没有预先萃取的情况下蒸发并将残余物通过色谱直接纯化。获得呈微淡黄色油状物的胺19(0.446g，92.0％)。[0206]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序，在tfa(4ml)和dcm(4ml)的混合物中进行胺19的去保护；获得呈淡黄色油状物的二胺20(0.333g，86.2％；rf 0.16于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.63,5.50,4.61,3.06,3.02,2.99,2.29,2.08,1.82,1.74,1.60,1.57,1.42,1.34,1.28,1.27,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.59,135.39,129.29,60.24,52.64,52.19,39.50,34.12,31.64,29.34,28.84,28.82,28.73,27.51,26.60,25.76,25.36,24.69,23.11,22.57,14.05ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3446w(νas nh2)；1612w(βs nh2)；2800m,sh(νs n-ch2)；1736vs(νc＝o)；1236m,1168s(νc-o)；3024m(νas＝ch)；1679w(νc＝c)；1419w(ρ＝ch)；2957s(νas ch3)；2931vs(νas ch2)；2858s(νs ch2)；2873s,sh(νs ch3)；1467m和1457m(βs ch2和δas ch3)；1378m(δs ch3)；721w(βas和γas ch2)。hrms(esi):m/z c40h77o4n2[m+h]+的计算值649.58779；实测值649.58767。[0207]n1,n3,n5-三(6-(双(8-((z)-壬-2-烯-1-基)氧基-8-氧代辛基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺21[0208]类脂质21根据实施例1中的对化合物4a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(30mg，0.112mmol)、hctu(192mg，0.447mmol，4eq.)、dipea(0.312ml，1.79mmol，16eq.)和二胺20(290mg，0.447mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠淡黄色油状物的类脂质21(181mg，74.9％；rf 0.29于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.54,5.63,5.50,4.61,3.29,3.00,2.98,2.34,2.29,2.23,2.08,1.98,1.89,1.76,1.60,1.585,1.42,1.38,1.35,1.28,1.26,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝177.29,173.53,135.41,123.27,60.25,52.62,52.27,41.72,39.57,39.20,37.12,34.09,31.64,29.34,28.85,28.82,28.74,28.44,28.37,27.51,26.63,25.83,25.56,24.67,23.11,22.57,14.06ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3321w(νnh)；1644m(酰胺i)；1535w-m(酰胺ii)；1736s(νc＝o)；1276w-m,1166m(νc-o)；3025w(νas＝ch)；1419w(ρ＝ch)；2956s,sh(νas ch3)；2930vs(νas ch2)；2858s(νs ch2)；2873m,sh(νs ch3)；1467m和1457m(βs ch2和δas ch3)；1378w-m(δs ch3)。hrms(maldi):m/z c133h239n6o15[m+h]+的计算值2160.8118；实测值2160.8164。[0209]实施例11[0210]3,5,7-三((6-(双十二烷基氨基)己基)氨基甲酰基)金刚烷-1-羧酸22[0211]将亚硫酰氯(300μl)和dmf(2μl)添加至金刚烷-1,3,5,7-四羧酸(21mg，0.067mmol)，并将悬浮液在70℃下在密闭小瓶中搅拌2小时；在此期间，将悬浮液变成澄清的均质溶液。用干燥的氮气流吹出过量的socl2，将残余物真空干燥(10分钟)，并且在冷却至室温后，将其溶解在0.5ml无水dmf中以形成澄清溶液。然后，将n1,n1-双十二烷基己-1,6-二胺(76mg，0.168mmol，2.5eq.)和dipea(117μl，0.672mmol，10eq.)于dcm(1.5ml)和dmf(0.5ml)的混合物中的溶液，反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后将反应混合物吸附到二氧化硅(10g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速硅胶色谱(用d1于dcm中的线性梯度洗脱，35-85％)纯化，得到呈浓稠的浅黄色油状物的目标化合物22(45mg，41.4％；rf 0.50于d2/3中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.32,3.24,3.05-2.95,2.16,1.97,1.92,1.80-1.72,1.55,1.38-1.23,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.52,52.89,52.20,42.28,39.39,38.96,31.89,29.60,29.50,29.44,29.32,29.10,28.72,26.83,26.23,25.99,23.47,23.14,22.66,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3314w,br(νnh),1643m(酰胺i)和1638w(酰胺ii),2954s(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855s(νs ch2),1467m,sh和1457m,sh(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3)；-cooh二聚体：2591w,vbr(νoh),1715w(νc＝o),1411vw和1283w,br(δcoh和νcco)。hrms(maldi):m/z c104h203n6o5[m+h]+的计算值1616.5810；实测值1616.58014。[0212]n1,n3,n5-三(6-(双十二烷基氨基)己基)金刚烷-1,3,5,7-四羧酰胺23[0213]将dmf(2μl)和亚硫酰氯(24μl，0.349mmol，14eq.)添加至酸22(27mg，0.017mmol)于dcm(3.5ml)中的溶液，并将悬浮液在室温下在密封小瓶中搅拌2小时。然后将溶液用温和的无水nh3流鼓泡5分钟；白色沉淀立即形成。10分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，将滤液吸附到二氧化硅(10g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速二氧化硅色谱(用d1于dcm中的线性梯度洗脱，30-70％)纯化，得到呈浓稠的浅黄色油状物的目标化合物23(15mg，55.6％；rf 0.57于d2/3中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝6.69,6.49,3.21,2.67,1.99,1.96,1.57,1.51,1.33,1.285,1.245,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝178.41,175.71,53.42,53.07,42.38,39.52,39.40,39.18,31.88,29.62,29.60,29.58,29.55,29.37,29.32,29.02,27.24,26.56,26.21,22.66,14.09ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3330w,br(νnh),1649m(酰胺i)和1536w(酰胺ii),2953m(νas ch3),2927vs(νas ch2),2875m,sh(νs ch3),2855s and 2805vw(νs ch2),1467m,和1457w,1438w,sh(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3)；伯酰胺:3199w,br(νnh2 váz.),1697vw,sh(νc＝o),1605w,sh(βsnh2)。hrms(maldi):m/z c104h204n7o4[m+h]+的计算值1615.5969；实测值1615.5998。[0214]实施例12[0215]n1,n3,n5-三(6-(双十二烷基氨基)己基)-n7-(2-羟乙基)金刚烷-1,3,5,7-四羧酰胺24[0216]将dmf(2μl)和亚硫酰氯(20μl，0.286mmol，14eq.)添加至酸22(33mg，0.020mmol)于dcm(1.5ml)中的溶液，并将悬浮液在室温下在密封小瓶中搅拌1小时。然后加入乙醇胺(50μl，0.816mmol，40eq.)，并且白色沉淀立即形成。20分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，将滤液吸附到二氧化硅(10g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速硅胶色谱(用d1于dcm中的线性梯度洗脱，35-85％)纯化，得到呈浓稠的浅黄色油状物的目标化合物24(31mg，91.5％；rf 0.59于d2/3中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.39,6.92,3.69,3.37,3.22,3.00,2.02,1.96,1.76,1.53,1.40-1.22,0.86ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.76,176.16,61.73,61.38,52.73,52.16,43.13,42.55,42.41,39.54,39.43,38.74,31.86,29.56,29.45,29.40,29.28,29.06,28.64,26.78,25.92,25.64,23.38,23.08,22.64,14.07ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3324w,br(νnh),1646m(酰胺i)和1538w(酰胺ii),2955s(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855s和2876m,sh(νs ch3),1467m,1457m和1435w,sh(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3),1060w,vbr,1036w,br(νc-oh)。hrms(maldi):m/z c106h208n7o5[m+h]+的计算值1659.6231；实测值1659.62718。[0217]实施例13[0218]n1,n3,n5-三(6-(双十二烷基氨基)己基)-n7-(1.3-二氢丙烷-2-基)金刚烷-1,3,5,7-四羧酰胺25[0219]按照针对24概述的程序，由酸22(51mg，0.031mmol)和丝氨醇(115mg，1.26mmol，40eq.)制备目标化合物25，得到呈浓稠的浅黄色油状物的类脂质25(19mg，35.6％；rf 0.59于d2/3中)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.79,7.21,7.17,7.08,3.26,3.01,2.03,1.92,1.775,1.57,1.385,1.33,1.28-1.24ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.14,175.04,52.74,52.66,52.32,52.17,39.28-38.65,31.89,29.68,29.59,29.49,29.43,29.32,29.09,28.47,26.83,26.80,25.98-25.40,23.05,22.67,14.10ppm。ir(ccl4):νmax/cm-1＝3324w,br(νnh),1646m(酰胺i)和1538w(酰胺ii),2955s(νas ch3),2927vs(νas ch2),2855s和2876m,sh(νs ch3),1467m,1457m和1435w,sh(βs ch2和δas ch3),1378w(δs ch3),1060w,vbr,1036w,br(νc-oh)。hrms(maldi):m/z c107h210n7o6[m+h]+的计算值1689.6337；实测值1616.63235。[0220]实施例14[0221]n1,n1-二((庚基氧基羰基)丙基)己-1,6-二胺28a[0222]将二异丙基碳二亚胺(3.17ml，20.24mmol，1.3eq.)和dmap(57.1mg，0.467mmol，0.03eq.)添加至4-溴丁酸(2.60g，15.57mmol)和1-庚醇(2.64ml，18.68mmol，1.2eq.)于dcm(60ml)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌1小时。然后将反应混合物吸附到二氧化硅(16g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速硅胶色谱(80g，用乙酸乙酯于环己烷中的线性梯度洗脱，0-10％)纯化，得到呈无色油状物的目标化合物26a(3.916g，94.8％；rf0.36于ce5中，通过kmno4可视化)。[0223]将溴酯26a(1.53g，5.78mmol，2.5eq.)和碳酸钾(3.19g，23.11mmol，10eq.)添加至n-boc-1,6-二氨基己烷(0.50g，2.31mmol)于acn(10ml)中的溶液，并将混合物在35℃下搅拌3天。然后将反应混合物吸附到二氧化硅(16g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速硅胶色谱(40g，用乙酸乙酯于环己烷中的线性梯度洗脱，0-100％)纯化，得到呈浅黄色油状物的目标化合物27a(1.093g，80.9％；rf0.35于nh3-预处理的tlc板上的ce50中，通过茚三酮可视化)。[0224]根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行胺27a的脱保护；获得呈淡黄色油状物形式的二胺28a(0.817g，90.2％；rf 0.27于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,3.63,3.21,3.15,2.91,2.85,2.67,2.53–2.41,2.32,1.86,1.76,1.61,nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.72,4.05,3.21,2.38,2.35,2.30,2.01,1.83,1.80,1.61,1.44,1.40,1.35-1.27,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝175.96,173.77,64.44,53.98,53.63,41.64,39.73,39.55,37.92,34.27,31.42,29.59,28.60,27.22,26.89,26.63,25.58,23.01,22.52,13.99ppm。hrms(maldi):m/z c97h179n6o15[m+h]+的计算值1668.3428；实测值1668.3418。[0234]实施例16[0235]n1,n1-二((壬基氧基羰基)丙基)己-1,6-二胺28c[0236]按照针对26a概述的程序，溴酯26c由4-溴丁酸(2.60g，15.57mmol)、1-壬醇(3.26ml，18.68mmol，1.2eq.)、dic(3.17ml，20.24mmol，1.3eq.)和dmap(57mg，0.467mmol，0.03eq.)制备，以产生呈无色油状物的26c(4.025g，88.2％，rf0.32于ce5中，通过kmno4可视化)。[0237]按照针对27a概述的程序，boc-衍生物27c由溴酯26c(1.25g，4.28mmol，2.5eq.)、n-boc-1,6-二氨基己烷(0.370g，1.71mmol)和碳酸钾(2.36g，17.10mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的27c(0.848g，77.3％，rf0.45于nh3-预处理的tlc板上的ce50中，通过茚三酮可视化)。[0238]胺27c的脱保护根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行；获得呈淡黄色油状物的形式的二胺28c(0.631g，88.2％；rf 0.29于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.66,4.05,3.16,2.91,2.63,2.59,2.53,2.48,2.34,1.81,1.70,1.61,1.54,1.47,1.42,1.35–1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.39,64.72,64.66,52.53,31.84,31.59,29.46,29.25,29.22,28.61,28.60,25.91,25.90,22.64,14.08ppm。hrms(esi):m/z c32h65n2o4[m+h]+的计算值541.49388；实测值541.49303。[0239]n1,n3,n5-三(6-(双((壬基氧基羰基)丙基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺29c[0240]按照实施例14中针对29a概述的程序，类脂质29c由金刚烷-1,3,5-三羧酸(42mg，0.157mmol)、胺28c(339mg，0.626mmol，4eq.)和dipea(273μl，1.57mmol，10eq.)制备，以产生呈浓稠的浅黄色油状物的29c(134mg，46.6％，rf 0.56于d2中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.72,4.05,3.21,2.40,2.36,2.31,2.01,1.83,1.80,1.72,1.61,1.47,1.38,1.33–1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝175.96,173.84,64.48,53.80,53.12,41.65,39.74,39.54,37.92,32.06,31.84,29.47,29.26,29.22,28.64,25.92,22.64,14.09ppm。hrms(maldi):m/z c109h203n6o15[m+h]+的计算值1836.5306；实测值836.5319。[0241]实施例17[0242]n1,n1-二((辛基氧基羰基)丁基)己-1,6-二胺28d[0243]按照针对26a概述的程序，溴酯26d由5-溴戊酸(3.0g，16.57mmol)、1-辛醇(3.13ml，19.89mmol，1.2eq.)、dic(3.37ml，21.54mmol，1.3eq.)和dmap(61mg，0.497mmol，0.03eq.)制备，以产生呈无色油状物的26d(4.327g，89.0％，rf0.32于ce5中，通过kmno4可视化)。[0244]按照针对27a概述的程序，boc-衍生物27d由溴酯26d(1.73g，5.89mmol，2.5eq.)、n-boc-1,6-二氨基己烷(0.510g，2.36mmol)和碳酸钾(3.26g，23.58mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的27d(1.241g，82.1％，rf0.18于nh3-预处理的tlc板上的ce50中，通过茚三酮可视化)。[0245]胺27d的脱保护根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行；获得呈淡黄色油状物的形式的二胺28d(1.09g，定量；rf 0.22于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝8.22,4.86,4.05,3.04,2.37,1.75,1.67,1.61,1.48,1.40,1.32-1.25,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝172.99,64.85,52.44,51.90,39.41,33.13,31.75,29.18,29.14,28.54,26.54,25.86,25.49,24.88,22.60,21.83,14.05ppm。hrms(esi):m/z c32h65n2o4[m+h]+的计算值541.49388；实测值541.49297。[0246]n1,n3,n5-三(6-(双((辛基氧基羰基)丁基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺29d[0247]按照实施例14中针对29a概述的程序，类脂质29d由金刚烷-1,3,5-三羧酸(70mg，0.261mmol)、胺28d(565mg，1.04mmol，4eq.)和dipea(455μl，2.61mmol，10eq.)制备，以产生呈浓稠的浅黄色油状物的29d(229mg，47.8％，rf 0.58于d2中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.79,4.05,3.21,2.44,2.31,2.01,1.84,1.80,1.61,1.47,1.34-1.24,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.03,173.63,64.50,53.54,41.65,39.77,39.45,37.88,34.12,31.76,29.48,29.20,29.16,28.63,25.91,22.87,22.61,14.07ppm。hrms(esi):m/z c109h203n6o15[m+h]+的计算值1836.53010；实测值1836.52959。[0248]实施例18[0249]n1,n1-二((庚基氧基羰基)戊基)己-1,6-二胺28e[0250]按照针对26a概述的程序，溴酯26e由6-溴己酸(3.0g，15.38mmol)、1-庚醇(2.61ml，18.46mmol，1.2eq.)、dic(3.13ml，19.99mmol，1.3eq.)和dmap(56mg，0.461mmol，0.03eq.)制备，以产生呈无色油状物的26e(4.177g，92.6％，rf0.27于ce5中，通过kmno4可视化)。[0251]按照针对27a概述的程序，boc-衍生物27e由溴酯26e(1.49g，5.08mmol，2.5eq.)、n-boc-1,6-二氨基己烷(0.440g，2.03mmol)和碳酸钾(2.81g，20.34mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的27e(1.076g，82.5％，rf0.15于nh3-预处理的tlc板上的ce50中，通过茚三酮可视化)。[0252]胺27e的脱保护根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行；获得呈淡黄色油状物的形式的二胺28e(0.895g，98.6％；rf 0.17于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝8.40,4.04,3.04,2.99,2.31,2.05,1.72,1.66,1.61,1.48,1.39,1.33–1.26,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.38,64.64,52.02,33.78,31.68,28.88,28.58,26.70,26.25,26.13,25.83,25.68,24.93,24.20,22.99,22.55,22.48,14.03ppm。hrms(esi):m/z c32h65n2o4[m+h]+的计算值541.49388；实测值541.49303。[0253]n1,n3,n5-三(6-(双((庚基氧基羰基)戊基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺29e[0254]按照实施例14中针对29a概述的程序，类脂质29e由金刚烷-1,3,5-三羧酸(55mg，0.205mmol)、胺28e(444mg，0.820mmol，4eq.)和dipea(357μl，2.05mmol，10eq.)制备，以产生呈浓稠的浅黄色油状物的29e(150mg，39.8％，rf 0.37于d2中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝5.72,4.05,3.21,2.37,2.29,2.01,1.83,1.80,1.62,1.47,1.42,1.33-1.25,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝175.97,173.84,64.42,53.96,41.64,39.74,39.53,37.91,34.35,31.70,29.59,28.89,28.63,27.14,25.87,24.97,22.56,14.05ppm。hrms(esi):m/z c109h203n6o15[m+h]+的计算值1836.53010；实测值1836.52930。[0255]实施例19[0256]n1,n1-二(((壬-3-基)氧基羰基)丙基)己-1,6-二胺28f[0257]按照针对26a概述的程序，溴酯26f由6-溴己酸(3.2g，16.41mmol)、3-壬醇(2.60g，18.05mmol，1.1eq.)、dic(3.27ml，21.33mmol，1.3eq.)和dmap(60mg，0.492mmol，0.03eq.)制备，以产生呈无色油状物的26f(2.88g，54.5％，rf 0.42于ce5中，通过kmno4可视化)。[0258]按照针对27a概述的程序，boc-衍生物27f由溴酯26f(2.82g,8.78mmol,2.5eq.)、n-boc-1,6-二氨基己烷(0.760g,3.51mmol)和碳酸钾(4.86g,35.13mmol,10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的27f(1.72g,70.19％,rf 0.56于nh3-预处理的tlc板上的ce50中，通过茚三酮可视化)。[0259]胺27f的脱保护根据实施例1中的对化合物2a所述的程序进行；获得呈淡黄色油状物的形式的二胺28f(1.84g,定量；rf 0.25于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝8.29,4.80,2.99,2.305,1.69–1.66,1.55–1.51,1.445,1.38,1.28–1.24,0.87,0.86ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.14,75.61,52.10,39.27,34.08,33.56,31.71,29.15,26.90,26.74,26.14,25.69,25.27,24.86,24.33,22.97,22.56,22.51,14.03,9.57ppm。hrms(esi):m/z c36h73n2o4[m+h]+的计算值597.55649；实测值597.55631。[0260]n1,n3,n5-三(6-(双(((壬-3基)氧基羰基)丙基)氨基)己基)金刚烷-1,3,5-三羧酰胺29f[0261]按照实施例14中针对29a概述的程序，类脂质29f由金刚烷-1,3,5-三羧酸(50mg，0.186mmol)、胺28f(334mg，746mmol，4eq.)和dipea(325μl，1.86mmol，10eq.)制备，以产生呈浓稠的浅黄色油状物的29f(237mg，63.4％，rf 0.44于d2中，通过茚三酮可视化)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝6.385,4.79,3.21,2.99,2.305,2.015,1.88,1.80,1.73,1.66,1.55–1.50,1.38–1.35,1.27–1.24,0.865,0.855ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.57,173.02,76.58,52.43,51.98,41.69,39.89,38.89,37.64,34.09,33.55,31.70,29.14,28.84,26.90,26.28,26.01,25.78,24.39,23.13,22.96,22.55,14.04,9.59ppm。hrms(maldi):m/z c121h227n6o15[m+h]+的计算值2004.7179；实测值2004.7187。[0262]实施例20[0263]6-(二((庚基氧基羰基)丙基)氨基)己-1-醇30a[0264]将溴酯26a(1.13g，4.27mmol，2.5eq.)和碳酸钾(2.36g，17.07mmol，10eq.)添加至6-氨基己-1-醇(0.20g，1.71mmol)于acn(10ml)中的溶液，并将混合物在50℃下搅拌20小时。然后将反应混合物吸附到二氧化硅(16g)上，并真空蒸发溶剂。将粗产物通过快速硅胶色谱(40g，用d1于dcm中的线性梯度洗脱，0-50％)纯化，得到呈浅黄色油状物的目标化合物30a(0.552g，63.0％；rf0.56于d2中，通过kmno4可视化)。[0265]1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,3.63,2.52,2.33,1.80,1.61,1.565,1.50,1.375,1.32–1.27,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.54,64.63,53.45,52.82,32.59,31.78,31.69,28.89,28.60,26.95,25.86,25.45,22.55,21.78,14.03ppm。hrms(esi):m/z c28h56no5[m+h]+的计算值486.41530；实测值486.41467。[0266]三(6-(二((庚基氧基羰基)丙基))己基)金刚烷-1,3,5-三羧酸酯31a[0267]将四甲基氟代六氟磷酸甲脒鎓(tffh，169mg，0.640mmol，3.3eq.)和dipea(0.506ml，2.91mmol，15eq.)添加至金刚烷-1,3,5-三羧酸(52mg，0.194mmol)于无水dmf(5ml)中的溶液，并将溶液在0℃下搅拌30分钟。然后加入醇30a(311mg，0.640mmol，3.3eq.)和dmap(7mg，0.058mmol，0.3eq.)于dmf(2.0ml)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将溶液倒入250ml分液烧瓶中，用饱和水性nahco3(50ml)稀释，并将产物用二乙醚(100ml，2x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，通过s2玻璃料过滤，并将溶剂在rve中蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱使用d1于dcm(0-65％)中的线性梯度纯化。获得呈粘稠淡黄色油状物的形式的类脂质31a(33mg，10.3％；rf 0.57于流动相d4中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,2.40,2.05–1.94,1.83,1.61,1.35–1.25,0.886ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.02,64.95,64.45,41.35,39.14,37.14,31.67,28.87,28.55,25.83,22.54,14.03ppm。hrms(maldi):m/z c97h176n3o18[m+h]+的计算值1671.2943；实测值1671.2973。[0268]实施例21[0269]6-(二((己基氧基羰基)丁基)氨基)己-1-醇30b[0270]按照针对30a概述的程序，醇30b由6-氨基己-1-醇(0.20g，1.71mmol)、溴酯26b(1.13g，4.27mmol，2.5eq.)和k2co3(2.36g，17.07mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的30b(0.599g，72.3％，rf0.55于d2中，通过kmno4可视化)。[0271]1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.04,3.63,2.46,2.32,1.76,1.60,1.56,1.45,1.37–1.25,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.69,64.56,62.79,53.57,52.96,32.64,31.90,31.82,29.45,29.24,29.21,28.61,27.02,25.91,25.51,22.63,14.07ppm。[0272]三(6-(二((己基氧基羰基)丁基))己基)金刚烷-1,3,5-三羧酸酯31b[0273]类脂质31b根据实施例20中的对化合物31a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(84mg，0.313mmol)、tffh(273mg，1.03mmol，3.3eq.)、dipea(0.818ml，4.179mmol，15eq.)、dmap(11mg，0.093mmol，0.3eq.)和醇30b(608mg，1.25mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠黄色油状物的类脂质31b(55mg，10.4％；rf 0.74于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,2.96,2.37,2.33,2.01,1.94,1.85–1.78,1.66,1.60,1.38,1.34–1.28,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.01,172.90,64.76–64.34,52.16,47.81,46.61,41.35,39.14,37.12,33.22,31.38,28.53,25.54,22.50,22.09,13.97ppm。hrms(maldi):m/z c97h176n3o18[m+h]+计算值1671.2943；实测值1671.2910。[0274]实施例22[0275]6-(二((壬基氧基羰基)丙基)氨基)己-1-醇30c[0276]按照针对30a概述的程序，醇30c由6-氨基己-1-醇(0.20g，1.71mmol)、溴酯26c(1.25g，4.27mmol，2.5eq.)和k2co3(2.36g，17.07mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的30c(0.651g，70.4％，rf0.59于d2中，通过kmno4可视化)。[0277]1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.07,3.65,3.09,3.03,2.45,2.16,1.89,1.61,1.56,1.45,1.34-1.25,0.88ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝172.24,65.25,62.39,52.41,51.55,32.11,31.84,30.65,29.45,29.22,28.54,26.29,25.87,22.65,18.39,14.09ppm。[0278]三(6-(二((壬基氧基羰基)丙基))己基)金刚烷-1,3,5-三羧酸酯31c[0279]类脂质31c根据实施例20中的对化合物31a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(86mg，0.320mmol)、tffh(279mg，1.06mmol，3.3eq.)、dipea(0.838ml，4.81mmol，15eq.)、dmap(12mg，0.096mmol，0.3eq.)和醇30c(695mg，1.28mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠黄色油状物的类脂质31c(23mg，3.9％；rf 0.91于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,2.37,2.01,1.95,1.83,1.61,1.35–1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.02,64.70,41.35,39.15,37.15,31.82,29.44,29.23,29.20,28.58,28.47,25.88,22.63,14.07ppm。hrms(maldi):m/z c109h200n3o18[m]+的计算值1839.4821；实测值1839.4799。[0280]实施例23[0281]6-(二((辛基氧基羰基)丁基)氨基)己-1-醇30d[0282]按照针对30a概述的程序，醇30d由6-氨基己-1-醇(0.20g，1.71mmol)、溴酯26d(1.25g，4.27mmol，2.5eq.)和k2co3(2.36g，17.07mmol，10eq.)制备，以产生呈浅黄色油状物的30d(0.623g，67.4％，rf 0.50于d2中，通过kmno4可视化)。[0283]1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,3.63,2.47,2.31,1.61,1.56,1.50,1.37–1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝173.65,64.52,62.78,53.69,53.42,34.07,32.60,31.75,29.19,29.15,28.61,27.05,25.90,25.49,22.85,22.61,14.06ppm。[0284]三(6-(二((辛基氧基羰基)丁基))己基)金刚烷-1,3,5-三羧酸酯31d[0285]类脂质31d根据实施例20中的对化合物31a所述的程序从金刚烷-1,3,5-三羧酸(83mg，0.309mmol)、tffh(270mg，1.02mmol，3.3eq.)、dipea(0.808ml，4.64mmol，15eq.)、dmap(11mg，0.093mmol，0.3eq.)和醇30d(671mg，1.24mmol，4eq.)制备；获得呈粘稠黄色油状物的类脂质31d(147mg，25.8％；rf 0.82于流动相d2中，用茚三酮检测)。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ＝4.05,2.34,2.01,1.95,1.83,1.78–1.56,1.36–1.24,0.87ppm。13c nmr(150.9mhz,cdcl3):δ＝176.04,64.76–64.46,41.36,39.16,37.15,31.75,29.19,29.15,28.60,25.90,22.61,14.06ppm。hrms(maldi):m/z c109h200n3o18[m]+的计算值1839.4821；实测值1839.4792。[0286]实施例24[0287]转染试剂的制备[0288]通过混合表1至表4中列出的各个组分来生成试剂。所有表都包含转染试剂中的最终摩尔浓度。使用99.7％乙醇中各组分的5mm储备溶液进行制备。只有dope-cy5储备溶液的浓度为0.79mm，并在氯仿中制备。[0289]表1.转染试剂a01-a10的组成.[0290][0291]表2.转染试剂a11-a13的组成.[0292][0293]表3.转染试剂a14-a23的组成.[0294][0295]表4.转染试剂a24-a29(a26和a27是比较例)的组成.[0296][0297]实施例25[0298]含mrna的脂质纳米颗粒(lnp)的制备[0299]将编码荧光蛋白mkate2的dna从质粒pmkate2-c(evrogen)使用引物(5’‑cgccaccatggtgagcgagctg-3’(seq id no.1)；5’‑cctcctccacctctgtgccccag-3’(seq id no.2))扩增，并在t7启动子下克隆至pet24a载体(invitrogen)。根据制造商的方案，使用ampliscribe t7-flash转录试剂盒(lucigen)在体外转录编码mkate2的信使rna(mrna)。将rna帽类似物arca(jena bioscience)添加到体外转录反应中，并根据标准方案使用聚(a)聚合酶(new england biolabs)合成聚(a)末端。[0300]含mrna的lnp(mrna-lnp)如下制备：使用具有两个输入和一个输入用于采样的“y”微流体设备，将实施例24中制备的a01-a27转染试剂中的每一者的300μl溶液与120μg mrna于300μl 10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0)中的溶液混合。脂质混合物和mrna溶液通过线性泵以300μl/min的恒定流速分别注入每个入口。收集所得的600μl纳米颗粒溶液并立即通过添加600μl pbs稀释；因此，由转染试剂a01-a27形成了指定为b01-b27的相应纳米颗粒样品。一式三份地制备mrna-lnp样品(b01-b27)中的每一者。使用动态光散射(nanozs zetasizer,英国伍斯特莫尔文)在25℃下以173°的散射角测量新鲜形成的mrna-lnp的流体动力学直径。mrna-lnp的流体动力学直径范围为72至135nm，直径为265nm的b18除外(表5)。以这种形式，该颗粒用于随后的生物测试。[0301]表5.通过动态光散射测量的包括标准偏差的mrna-lnp的流体动力学直径。[0302][0303]实施例26[0304]使用脂质混合物中的各种辅助脂质在体外使用新lnp比较mrna转染[0305]在人细胞系hek293的细胞上测试了实施例25中一式三份制备的含有编码荧光蛋白mkate2的mrna的lnp b05、b24和b25。将细胞在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的imdm培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl的mrna-lnp(所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，随后孵育24小时。一式三份地进行转染。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表明lnp进入细胞的cy5荧光强度和表明细胞转染后从lnp释放的mrna的翻译的mkate2荧光强度。[0306]其脂质混合物含有dope、dopc或dspc辅助脂质的新mrna-lnp能够有效地将mrna转染到hek293细胞系中，其中最有效的转染是使用含有dope辅助脂质的mrna-lnp实现的(表6)。[0307]表6.含有辅助脂质dope(b05)、dopc(b24)或dspc(b25)的新mrna-lnp的转染效率.将cy5和mkate2的荧光强度的指示值标准化至用含有dope(b05)的lnp转染的对照变体。[0308][0309]实施例27[0310]使用新lnp和由已知转染试剂形成的mrna-lnp比较mrna转染[0311]将mrna-lnp b05的转染效率与选定的已知高效转染试剂进行比较，即在实施例25中配制为b26-b27的d-lin-mc3-dma(medchemexpress europe)和可离子化类脂质tt3(li,b.:nano lett.2015,15,8099-8107)，并且还与2000试剂(invitrogen，根据制造商提供的标准方案使用，指定为lip2000)。将人细胞系hek293t的细胞在96孔板(每孔100μl培养基中的5x104)在补充有10％fbs的dmem培养基中于37℃和5％co2下培养。将细胞用2μl的mrna-lnp(所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，随后孵育24小时。一式三份地进行转染。在bd lsr fortessa细胞仪中分析mkate2的荧光强度和表达mkate2的细胞的百分比。mrna-lnp(孔中所有脂质组分的最终总浓度为100μm)转染并随后孵育24小时。在celltiterglo 2.0细胞存活力测定(promega，usa)中分析lnp的细胞毒性。将细胞存活力归一化至未转染的细胞(对照)。将结果概述于表9a、b和10a、b中。[0323]当使用所有脂质组分总浓度为20μm的mrna-lnp时，在hek293细胞系中测得的最大细胞毒性为对b02和b03测量的16％。颗粒b01和b05-b23没有显示出明显的毒性。在比所有脂质组分的总浓度(100μm)的高5倍的情况下，趋势相似，其中b03中的毒性最高，为38％；颗粒b04-b08表现出大约20％的细胞毒性，b09和b10没有表现出毒性。颗粒b11-b23还表现出无毒性。在hek293t系中，在b02和b03中再次测量了最高的细胞毒性；在其他颗粒中，毒性非常低。所有脂质组分总浓度为20μm的颗粒对u2os细胞系表现出几乎没有毒性，在浓度为100μm时，b10颗粒的最高毒性为35％。由类脂质4a、4b、4d和4e形成的颗粒是无毒性，由类脂质4f、4g、9和13形成的颗粒是非常轻微有毒(表9a，表10b)。[0324]表9a.mrna-lnp的细胞毒性，表示为在添加20μm转染混合物与单个细胞系类型的mrna后的细胞存活率(％)。[0325][0326]表9b.mrna-lnp的细胞毒性，表示为在添加20μm转染混合物与单个细胞系类型的mrna后的细胞存活率(％)。[0327][0328]表10a.mrna-lnp的细胞毒性，表示为在添加100μm转染混合物与单个细胞系类型的mrna后的细胞存活率(％)。[0329][0330]表10b.mrna-lnp的细胞毒性，表示为在添加100μm转染混合物与单个细胞系类型的mrna后的细胞存活率(％)。[0331][0332]实施例30[0333]使用新lnp在体外转染mrna[0334]将来源于胚胎肾细胞的人细胞系(hek293)、表达sv40大t抗原的同一细胞系(hek293t)、肝癌细胞(hepg2、huh7)和人骨肉瘤来源的细胞系(u2os)在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)中的杜尔贝科氏改良培养基(dmem)或补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基内在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl的实施例25中制备的携带编码荧光蛋白mkate2的mrna的mrna-lnp b01至b05(孔中所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，随后孵育24小时。2000用作对照转染试剂。转染在三个生物学重复实验中进行，其中每个生物重复实验具有三个技术重复实验。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表达mkate2荧光蛋白的细胞的百分比和mkate2的荧光强度。对于荧光强度，将数据归一化至商购转染试剂2000。[0335]对于hek293系，表达mkate2蛋白的细胞的百分比对于所有使用的类脂质来说是可商购获得的转染试剂的2倍以上。对于所有使用的类脂质，荧光强度都高出2倍以上，由类脂质4d形成的b02颗粒比可商购获得的2000高3倍。在所有情况下，用新类脂质形成的mrna-lnp转染的hepg2细胞系是商购2000的至少2.5倍，与类脂质4c形成的mrna-lnp b03的荧光强度是2000的4.5倍。与商购2000相比，用新mrna-lnp转染的类似改进在其他细胞系中实现(表11、表12)。[0336]表11.新mrna-lnp对不同细胞系的转染效率，表示为从利用用于hek293、hepg2、hek293t、huh7和u2os系的颗粒转染的mrna表达荧光mkate2蛋白的细胞的百分比。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值始终与相应细胞系中lip2000转染的对照变体相关；p值《0.001用字母“a”指示。[0337][0338]表12.新mrna-lnp对不同细胞系的转染效率，表示为来自利用用于hek293、hepg2、hek293t、huh7和u2os系的颗粒转染的mrna的mkate2的相对荧光强度。对于荧光强度，将数据归一化至商购转染试剂2000。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值始终相对于相应细胞系中lip2000转染的对照变体；值p《0.001用字母“a”标记，p《0.01用“b”标记。[0339][0340]实施例31[0341]使用由以“z”修饰的类脂质形成的新lnp转染mrna[0342]将人细胞系hepg2在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的imdm培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl的实施例25中制备的mrna-lnp b11-b13(孔中所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，并随后孵育24小时。2000用作对照转染试剂。转染在三个生物学重复实验中进行，其中每个生物重复实验具有三个技术重复实验。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表达mkate2荧光蛋白的细胞的百分比和mkate2的荧光强度。在所有情况下，具有z修饰的类脂质取代基的新mrna-lnp能够有效地转染mrna至hepg2细胞系(表13)中，优于对照转染试剂2000。[0343]表13.新mrna-lnp的转染效率，表示为从利用用于hepg2细胞系的颗粒转染的mrna表达荧光mkate2蛋白的细胞的百分比，和表示为来自用用于hepg2细胞系的颗粒转染的mrna的mkate2的相对荧光强度。对于荧光强度，将数据归一化至商购转染试剂2000(lip2000)。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值始终与相应细胞系中lip2000转染的对照变体相关；p值《0.001用字母“a”指示。[0344][0345]实施例32[0346]使用由可生物降解的类脂质形成的新lnp转染mrna[0347]将人细胞系hek293、hek293t和u2os在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的dmem或imdm培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl的实施例25中制备的mrna-lnp b05、b08–b10和b14–b23(孔中所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，并随后孵育24小时。2000用作对照转染试剂。转染在三个生物学重复实验中进行，其中每个生物重复实验具有三个技术重复实验。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表达mkate2荧光蛋白的细胞的百分比和mkate2的荧光强度。[0348]与商购2000相比，新mrna-lnp对细胞系的转染显著更好。类脂质4e、9、13和21对转染细胞的百分比具有相当的影响。与商购2000相比，在hek293和hek293t系中，编码mkate2蛋白的经翻译的mrna的荧光强度则总是显著增加。在u2os系中，类脂质13与类脂质4e类似地转染(表14，表15)。[0349]表14.新mrna-lnp对各种细胞系的转染效率，表示为从用颗粒转染的mrna表达mkate2荧光蛋白的细胞的百分比。列出了hek293、hek293t和u2os系。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值始终与相应细胞系中lip2000转染的对照变体相关；p《0.001值用字母“a”标记。[0350][0351][0352]表15.新mrna-lnp对各种细胞系的转染效率，表示为与lip2000转染对照变体相关的mkate2的相对荧光强度。列出了hek293、hek293t和u2os系。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值始终与相应细胞系中lip2000转染的对照变体相关；值p《0.001用字母“a”标记，p《0.01用“b”标记。[0353][0354]实施例33[0355]使用新lnp在体外转染sirna[0356]如下制备含有导致编码绿色荧光蛋白(gfp)的mrna降解的小干扰rna(sirna，目录号am4626，ambion)的lnp：使用类似于实施例25的微流体设备，将300μl实施例24中制备的a28转染试剂溶液与1.20nmol sirna在300μl 10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0)中的溶液混合。将所得的sirna-lnp立即在600μl pbs中稀释；相应的标记为b28的纳米颗粒因此由转染试剂a28形成。类似地制备携带不靶向任何内源性细胞转录的mrna的对照sirna(乱序；4390843，ambion)的lnp(b29)。根据制造商的标准方案，lipofectamine rnaimax(invitrogen)用作专门用于sirna转染的对照转染试剂。稳定表达绿色荧光蛋白(gfp)的人细胞系u2os用于sirna-lnp敲低。将细胞在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的dmem培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl sirna-lnp转染，孔中所有脂质组分的最终总浓度为20μm；最终sirna浓度为16nm)，随后孵育24小时。转染在三个生物学重复中进行。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表达绿色荧光蛋白gfp的细胞的百分比和gfp的荧光强度。[0357]使用新sirna-lnp(b28)，观察到gfp表达下降至1％的gfp表达细胞；使用商购rnaimax，仍然在13.6％的细胞中检测到gfp表达。与商购rnaimax试剂相比，当使用新sirna-lnp(b28)时gfp的荧光强度降低了1.25倍(表16)。[0358]表16.与商购转染试剂rnaimax和携带对照sirna的sirna-lnp(b29)相比，sirna-lnp(b28)对u2os细胞系中编码gfp的mrna的减少，表示为gfp表达细胞的百分比和gfp荧光强度。通过学生非配对t检验评价统计数据。p值与测试的b28转染混合物有关；值p《0.001的值用字母“a”标记，p《0.01用“b”标记。[0359][0360]含有导致编码酪氨酰-dna磷酸二酯酶2(tdp2)的mrna降解的小干扰rna(sirna，目录号4392420，ambion)的sirna-lnp以与b28颗粒相同的方式在本实施例中制备。因此由转染试剂a28形成了指定为b30的相应纳米颗粒。携带不靶向任何内源性细胞转录的mrna的对照sirna(乱序；4390843，ambion)的lnp(b29)还用作对照。lipofectamine rnaimax(invitrogen)用作专门用于sirna转染的对照转染试剂。人细胞系hek293和两种来源于人多发性骨髓瘤的细胞系(很难用可获得的转染试剂转染)，用于sirna-lnp敲低(brito j.l.r.,brown n.,morgan g.j.(2010)transfection of sirnas in multiple myeloma cell lines.in:min wp.,ichim t.(eds)rna interference.methods in molecular biology(methods and protocols),第623卷.humana press)。将细胞在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的dmem培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl sirna-lnp(所有脂质组分的最终总浓度为20μm并且sirna的最终浓度是16nm)转染，并随后孵育24小时。转染在三个生物学重复中进行。rna用rnaeasy plus micro kit(qiagen)分离。根据制造商的建议，用tataa grandscript cdna supermix(tataabiocenter)制备cdna。定量rt-pcr在lightcycler 480(roche life science)中进行。用于扩增编码tdp2的mrna的引物如下：5‘‑cgagaggagggtctcaaagag-3‘(seq id no.3)和5‘‑atttcgggaaggctgctgtc-3‘(seq id no.4)。编码gapdh的mrna用于归一化数据(引物：5‘‑aatcccatcaccatcttcca-3‘(seq id no.5)和5‘‑tggactccacgacgtactca-3‘(seq id no.6))。[0361]在所有这些情况下，与商购转染试剂rnaimax相比，新sirna-lnp显著降低了细胞中tdp2 mrna的水平。与用于sirna转染的商购试剂相比，在hek293细胞系中为2.86倍，在opm-2骨髓瘤系中为4.3倍，并且在rpmi8226骨髓瘤系中为6.7倍(表17)。[0362]表17.在hek293、opm-2和rpmi8226细胞系中，与商购转染试剂rnaimax相比和与对照sirna-lnp(b29)相比，新sirna-lnp(b30)降低了细胞中内源性表达的tdp2 mrna水平.[0363]通过学生非配对t检验评价统计数据。p值《0.001与测试的b30转染混合物有关；p值《0.001用字母“a”表示。[0364][0365]实施例34[0366]使用新lnp在体外转染质粒dna[0367]如下制备含编码mkate2荧光蛋白的4706bp质粒dna(evrogen，目录号fp181)的lnp：使用类似于实施例25的微流体设备，将300μl实施例24中制备的a28转染试剂溶液与120μg质粒dna在300μl 10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0)中的溶液混合。将所得的dna-lnp立即在600μl pbs中稀释；相应的指定为b31的纳米颗粒因此由转染试剂a28形成。对人细胞系hek293t进行转染。将细胞在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的dmem培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl dna-lnp(所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，随后孵育24小时。2000(lip2000，invitrogen)用作对照转染试剂。转染在三个生物学重复实验中进行，其中每个生物重复实验具有三个技术重复实验。在bd lsr fortessa细胞仪中分析表达mkate2荧光蛋白的细胞的百分比和mkate2的荧光强度。[0368]在使用新dna-lnp下，表达荧光蛋白mkate2的细胞的百分比比商购转染试剂高3.8倍。荧光强度比商购试剂高2.9倍(表18)。[0369]表18.在hek293t细胞系中，新dna-lnp(b31)与商购2000(lip2000)相比的转染效率，表示为mkate2表达细胞的百分比和mkate2荧光强度。对于荧光强度，将数据归一化至商购转染试剂2000。通过学生非配对t检验评价统计数据。值为p《0.001用字母“a”指示。scientific)和1％青霉素-链霉素(biowest)的含有葡萄糖的dmem培养基(含l-谷氨酰胺；biowest)内。在37℃下在5％co2中孵育过夜后，将连续稀释的化合物添加到细胞中持续7小时。同时，将hek293t细胞与测试化合物单独孵育30分钟，用新鲜培养基洗涤两次，然后再培养额外的6.5小时。最后，将50μl细胞培养基与30μl bright-glo萤光素酶测定系统试剂(bright-glo luciferase assay system reagent，promega)在白色96孔板中混合，并在分光光度计(tecan,)中读取发光。如novotná等人(novotná,b.:j.med.chem.2019,62(23),10676-10690)所述，使用graphpad prism(la jolla)计算50％有效浓度(ec50)的值(表20)。[0380]环状二核苷酸2′,3′cgamp表现出sting激活的ec50值±30μm。由可电离类脂质4a-4f形成的所有新cgamp-lnp均能有效转染hek293t细胞并在纳摩尔区激活sting，从而将转染效率提高约2000-15000倍。最有效的是类脂质4d，展现出ec50为2.00±0.36 nm。[0381]表20.用由可电离类脂质4a-4f形成的新cgamp-lnp(b33-b38)转染的2′,3′‑cgamp的sting激活的ec50值.[0382][0383]实施例37[0384]新mrna-lnp的体内毒性[0385]与实施例35类似，制备编码nanoluc蛋白的信使rna(mrna)并包装成颗粒。将所得的mrna-lnp(b32)以0.5mg mrna/kg的浓度腹膜内施用给三只c57b1/6小鼠(biocev，vestec)，其中向三只对照c57b1/6小鼠腹膜内施用pbs。向另外三只c57b1/6小鼠以相同的方式以高5倍的浓度(2.5mg mrna/kg)施用mrna-lnp。同样，同样剂量的mrna-lnp再次静脉内施用给3只c57b1/6小鼠(0.5mg mrna/kg)和3只c57b1/6小鼠(2.5mg mrna/kg)，并将动物在施用前麻醉(2.5mg//小鼠的他命(ketaminum)，0.4mg/小鼠的二甲苯胺噻嗪(xylazinum)，bioveta)。然后观察小鼠48小时，与对照动物相比，没有小鼠表现出任何毒性或表型变化的迹象。[0386]实施例38[0387]新mrna-lnp的体内生物分布[0388]使用以下引物从质粒pcag-cre-ires2-gfp(addgene，目录号26646，由anjen chenn捐赠)中扩增编码cre重组酶蛋白的基因：(5’‑taatacgactcactatagaatttact‑‘3(seq id no.9)；[0389]5‘‑ctaatcgccatcttccagca-3‘(seq id no.10))。信使rna(mrna)与实施例25类似地在体外制备并如下包装到lnp中：使用类似于实施例25的微流体设备将300μl转染试剂a28样品和120μg mrna于300μl 10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0)中组装成lnp。将所得的mrna-lnp立即在600μl pbs中稀释；相应的标记为b39的纳米颗粒因此由转染试剂a28形成。将mrna-lnp(b39)以0.5mg mrna/kg至2.5mg mrna/kg的浓度在每种情况下静脉内施用给3只具有全局双cre报告子的小鼠(mazumdar,m.d.:genesis 2007,45:593-605)(饲养biocev，vestec)，使得能够分析成功的重组。在携带cre重组酶mrna的mrna-lnp被成功递送到的细胞中，发生了染色体重组和随后切除膜红蛋白基因(所谓的红番茄)和“开启”膜绿色蛋白(gfp)基因的转录。小鼠(包括非颗粒对照小鼠)在颗粒施加后3天处死，并且所有器官根据标准化方案进行组织学分析。组织学图像显示颗粒完全分布到肝脏中，这导致施加后3天，表达红色膜蛋白的细胞30-50％转化为表达绿色膜蛋白的细胞(图7)。在图7中，肝脏的组织学图像显示，在施加编码cre重组酶的mrna-lnp[2.5mg/kg of mrna](标记为“3dpi mrna-lnp”)后3天，表达红色膜蛋白的细胞转化为表达绿色膜蛋白的细胞。“pbs对照”–仅注射pbs缓冲液。[0390]实施例39[0391]新mrna-lnp和sirna-lnp在4℃下的稳定性[0392]将人细胞系hek293t在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的imdm培养基中(在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl的实施例25中制备的mrna-lnp b05(孔中所有脂质组分的最终总浓度为20μm)转染，并随后孵育24小时。b05 mrna-lnp储存在4℃下，并且在组装后1、3和5周类似地重复转染。一式三份地进行转染。在bd lsr fortessa细胞仪中分析mkate2的荧光强度。[0393]新mrna-lnp(标记为b05)的转染效率在至少三周内保持不变，并且与第1天相比降低至81％，同时储存在4℃(表21)。[0394]表21.储存在4℃下的b05 mrna-lnp对hek293细胞的转染效率，表示为mkate2的相对荧光强度。数据归一化至组装后第1天测量的荧光强度。五周后，b05 mrna-lnp在4℃下储存时仍保持81％的转染效率。[0395][0396]含有导致编码酪氨酰-dna磷酸二酯酶2(tdp2)的mrna降解的小干扰rna(sirna，目录号4392420，ambion)的sirna-lnp(标记为b30和b40)以与实施例33中所述相同的方式制备并储存在4℃下。sirna-lnp b40由实施例24中制备的转染试剂a29形成。将hek293t细胞在96孔板(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)内的补充有10％fbs的dmem培养基中在37℃下于5％co2中培养。将细胞用2μl sirna-lnp(所有脂质组分的最终总浓度为20μm并且sirna的最终浓度是16nm)转染，并随后孵育24小时。一式三份地进行转染。如实施例33中所述进行rna分离、cdna制备和qrt-pcr。在lnp组装后一、二和三个月重复整个程序。[0397]新sirna-lnp(标记为b30和b40)的转染效率，表示为它们降低细胞中tdp2 mrna水平的能力，在4℃下储存三个月时几乎保持不变(表22)。[0398]表22.在各个时间点在4℃下储存的sirna-lnp转染之后，hek293t细胞中tdp2 mrna的相对水平.[0399][0400]实施例40[0401]由预成型的空lnpt转染sirna[0402]来自实施例24的转染试剂a28和a29用于在不包括核酸的柠檬酸盐缓冲液中组装空纳米颗粒b41和b42，类似于实施例25但没有后稀释。将1μl lnp在转染前10分钟类似于对lipofectamine rnaimax推荐那样与1pmol靶向tdp2的sirna混合，并在室温下孵育。将hek293t和hepg2细胞(每孔5x104个细胞于100μl培养基中)用预组装的lnp和sirna的混合物转染并孵育24小时。一式三份地进行转染。lipofectamine rnaimax用作对照转染试剂。随后与1pmol sirna混合的预组装的lnp能够将tdp2 mrna表达敲低90-97％，两者都明显优于商购转染试剂lipofectamine rnaimax(表23)。[0403]表23.与商购转染试剂rnaimax相比，由与靶向tdp2的sirna混合的预组装的空lnp降低细胞中的tdp2 mrna水平。通过学生非配对t检验测定统计数据。p值与使用lipofectamine rnaimax的对照转染有关，值p《0.001用字母“a”表示，值p《0.01用字母“b”表示。[0404][0405]实施例41[0406]由sirna-lnp转染外周血单核细胞(pbmc)并评价细胞因子响应[0407]来自实施例24的转染试剂a28用于形成含有引起编码聚(u)-结合剪接因子(puf60)的mrna降解的sirna的指定为b43的sirna-lnp。与实施例33类似地制备sirna-lnp。lipofectanime rnaimax用作对照转染试剂。来自3名匿名供体的外周血单核细胞(pbmc)(其协议号为捷克共和国布拉格血液学和输血研究所伦理委员会(ethical committee of the institute of hematology and blood transfusion，捷克布拉格)13/06/2012)通过(paque plus,17-1440-02,ge healthcare)梯度分离并于补充有10％fbs和50u/ml青霉素/链霉素的rpmi培养基中培养。将细胞以105个细胞/100ul(总共200ul)接种在96孔板中，并在37℃下孵育。靶向puf60的中靶加smartpool sirna购自dharmacon(目录号l-012505-01-0005；法国llkirch)并以20pmol/ul重悬在水中。使用1pmol或10pmol的最终浓度。每个条件一式三份进行。转染后24小时收获细胞，包括上清液。按照制造商的说明书，使用nucleospin rna提取试剂盒(macherey nagel)提取总rna。用500ng rna进行逆转录。使用sybergreen混合物在lightcycler 480(roche life science)中一式两份地进行定量rt-pcr。用于扩增puf60的引物如下：5-ccttcaaccgcatctacgtg-3(seq id no.7)和5-ctgggccttctcgtactcaa-3(seq id no.8)。rplp0用于归一化数据(引物：5-caccattgaaatcctgagtgatg-3(seq no.9)和5-tgaccagcccaaaggagaag-3(seq no.10))。使用人elisa试剂盒(human ifn-αelisabasic试剂盒(hrp)，3425-1h-20，mabtech和human ifn-λ1elisabasic试剂盒，3570-1h-20，mabtech)在无细胞上清液中测量由pbmc产生的总ifn-α和ifn-γ的量。用1μm cpg odn 2216类别a(invivogen)对pbmc进行24小时处理用作阳性对照。[0408]在所有情况下，与rnaimax相反，sirna-lnp降低了pbmc细胞中puf60mrna的水平(表24)而不上调细胞因子响应(表25和表26)。[0409]表24.与转染试剂rnaimax相比和与未处理的细胞相比，新sirna-lnp(b43)降低了pbmc中内源性表达的puf60 mrna水平.[0410][0411]表25.与rnaimax相比，sirna-lnp处理后pbmc的ifn-α响应。[0412][0413]表26.与rnaimax相比，sirna-lnp处理后pbmc的ifn-λ响应。[0414][0415]实施例42[0416]sirna-lnp在体内的有效性[0417]使用来自实施例24的转染试剂a29与靶向小鼠载脂蛋白b(apob)基因(一种参与胆固醇转运的肝细胞表达基因(apob)(目录号238055apob小鼠sipool-40试剂盒，sitools biotech gmbh))的sirna形成称为b44的sirna-lnp，和替选地含对照非靶向的sirna-lnp(包含在238055apob小鼠sipool-40试剂盒，sitools biotech gmbh)的sirna-lnp(b45)中，如实施例33中所述组装。将sirna-lnp透析至pbs。内毒素水平《2eu/ml。小鼠禁食4小时，然后通过眶后取血收集血浆。将靶向apob的sirna-lnp分别以32μg的sirna和16μg的sirna的浓度静脉内施用给5只c57b1/6小鼠(biocev，czech center of phenogenomics，vestec)，其中向对照5只小鼠施用32μg非靶向sirna-lnp和向另外5只小鼠施用pbs对照。在lnp施加后2天处死所有小鼠。根据标准化方案，使用捷克表型基因组学中心(czech center of phenogenomics)的自动化系统测量胆固醇、甘油三酯和ldl-c的血浆水平。[0418]与对照动物相比，受apob敲低影响的血浆标志物(诸如总胆固醇、甘油三酯和ldl-c)的临床生化显著降低，从而证明新lnp将apob sirna有效递送到肝脏中(表27)。[0419]表27.血浆标志物的临床生化表明肝脏中有效的apob敲低。通过学生非配对t检验评价统计数据。p1值总是相对于注射pbs的对照小鼠；p2值总是相对于注射含对照非靶向sirna的b45 lnp的小鼠；值p《0.001用字母“a”标记，p《0.01用“b”标记。[0420][0421]实施例43[0422]核苷修饰的mrna-lnp在体内的有效性[0423]使用以下引物从质粒pcag-cre-ires2-gfp(addgene，目录号26646，由anjen chenn捐赠)中扩增编码cre重组酶蛋白的基因：(5’‑taatacgactcactatagaatttact‑‘3(seq id no.9)；[0424]5‘‑ctaatcgccatcttccagca-3‘(seq id no.10))。信使rna(mrna)与实施例25类似地在体外制备，不同之处在于ctp 100％更换为5-甲基-ctp(nu-1138l，biogen praha s.r.o.)并且utp 100％更换为n1-甲基假-utp(nu-890l，biogen praha s.r.o.)，并如下包装到lnp中：使用类似于实施例25的微流体设备将300μl转染试剂a28样品和120μg mrna于300μl 10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0)中组装成lnp。将所得的mrna-lnp立即在600μl pbs中稀释；相应的标记为b46的纳米颗粒因此由转染试剂a28形成。将mrna-lnp(b46)以0.5mg mrna/kg至2.5mg mrna/kg的浓度在每种情况下静脉内施用给3只具有全局双cre报告子的小鼠(mazumdar,m.d.:genesis 2007,45:593-605)(饲养biocev，vestec)，使得能够分析成功的重组。在携带cre重组酶mrna的mrna-lnp被成功递送到的细胞中，发生了染色体重组和随后切除膜红蛋白基因(所谓的红番茄)和“开启”膜绿色蛋白(gfp)基因的转录。小鼠(包括非颗粒对照小鼠)在颗粒施加后3天处死，并且所有器官根据标准化方案进行组织学分析。组织学图像显示颗粒完全分布到肝脏中，这导致施加后3天，表达红色膜蛋白的细胞35-75％转化为表达绿色膜蛋白的细胞。









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