核酸扩增方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一种核酸扩增方法。背景技术：：：2.多重pcr是通过同时使用多个引物对的pcr反应而从1个dna样本同时扩增多个区域的方法。将从rna向cdna的逆转录(rt)反应与多重pcr组合而成的多重rt－pcr已被利用于基因表达分析和基因分型等。3.rna通常从组织样本中提取。另外，作为更简便且非侵入的rna提取方法，最近公开了从皮肤表面脂质(skinsurfacelipids；ssl)中提取rna的方法(专利文献1)。ssl所含的rna作为用于基因表达分析等的rna样本是有用的。然而，能够从1个被检测体中回收的ssl的量不多，并且其中所含的rna的量也不多，因此利用1个被检测体的ssl能够制备的rna的量是微量的。4.在非专利文献1中记载了bsa和t4gene32protein(t4gp32)改善了在抑制物质存在下的pcr反应。在非专利文献2中记载了dmso和甜菜碱提高了pcr的特异性和产量。在非专利文献3、4中记载了在rt－pcr时，通过向rt体系添加t4gp32，rt－pcr产物的产量显著增加了，但即使向rt后的pcr体系添加t4gp32，也观察不到明显的产量增加。在专利文献2中记载了在以rna为模板扩增cdna的扩增逆转录法(rt－ramda法)中，通过使t4gp32与从模板rna剥离的单链cdna结合，保护该cdna不被核酸酶分解，从而增加cdna的产量。5.(专利文献1)国际公开公报第2018/008319号6.(专利文献2)国际公开公报第2016/052619号7.(非专利文献1)applenvironmicrobiol,1996,62(3):1102－11068.(非专利文献2)plosone,2010,5(6):e110249.(非专利文献3)applenvironmicrobiol,1998,64(2):669－67710.(非专利文献4)biotechniques,2001,31(1):81－86技术实现要素：11.本发明提供一种核酸扩增方法，其包括：通过逆转录由样本rna合成cdna的步骤；和利用多重pcr扩增该cdna的步骤，该逆转录和该多重pcr在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体。12.本发明还提供一种改善剂，其是以单链核酸结合蛋白为有效成分的多重rt－pcr的产量改善剂，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体，并且添加在逆转录和多重pcr双方的反应液中。具体实施方式13.关于本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其他出版物，其全部在本说明书中作为参考而被引用。14.在本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选98％以上、进一步优选99％以上的同一性。15.在本说明书中，核苷酸序列和氨基酸序列的同一性可以利用lipman－pearson法(science，1985，227：1435－41)进行计算。具体而言，可以利用遗传信息处理软件genetyx－win(ver.5.1.1；软件开发)的同源性分析(searchhomology)程序，将unitsizetocompare(ktup)设为2进行分析而算出。16.因为期待提高多重rt－pcr的灵敏度和产量。本发明涉及一种高灵敏度且高产量的利用rna的核酸扩增方法。17.本发明的发明人发现，通过在t4gp32的存在下进行多重rt－pcr中的rt和pcr双方的反应，即使利用微量的rna样本，也能够实现高产量。18.本发明能够提高多重rt－pcr的灵敏度和产量。本发明的方法能够进行对来自ssl的rna这样的微量rna样本进行高效扩增和分析。本发明能够提高使用rna试样的分析(例如基因分析、诊断等)的灵敏度和精度以及效率。19.本发明提供一种利用rna的核酸扩增方法。该方法包括通过逆转录由样本rna合成cdna的步骤和利用多重pcr扩增该cdna的步骤。20.本发明的方法所使用的样本rna可以为任何种类的rna，例如可以列举来自动物、植物、微生物、病毒等的rna。该样本rna可以包含mrna、trna、rrna、小分子rna(smallrna)(例如微rna(microrna(mirna))、小干扰rna(smallinterferingrna(sirna))、piwi相互作用rna(piwi－interactingrna(pirna))等)、长链基因间非编码rna(longintergenicnon－coding(linc)rna)等。该样本rna可以包含上述rna的1种或2种以上。21.该样本rna可以利用通常的方法从动物、植物、微生物、病毒等中提取。例如，该rna的提取可以使用酚－氯仿(phenol/chloroform)法、酸性硫氰酸胍－酚－氯仿提取(agpc、acidguanidiniumthiocyanate－phenol－chloroformextraction)法或它们的变形方法、使用涂布有二氧化硅的特殊的磁体颗粒的方法、使用固相载体可逆化固定(solidphasereversibleimmobilization)磁体颗粒的方法、或者市售的rna精制用试剂(例如trizol(注册商标)reagent、rneasy(注册商标)、qiazol(注册商标)、isogen等)等。22.在优选的一个实施方式中，该样本rna为来自皮肤表面脂质的rna。在本说明书中，“皮肤表面脂质(skinsurfacelipids；ssl)”是指存在于皮肤表面上的脂溶性成分，有时也称为皮脂。一般而言，ssl主要含有由位于皮肤的皮脂腺等外分泌腺分泌的分泌物，以覆盖皮肤表面的薄层的形式存在于皮肤表面上。ssl中含有来自被检测体的皮肤细胞的rna，能够利用其对生物体进行分析(专利文献1)。23.提取来自该ssl的rna的被检测体只要是皮肤上具有ssl的生物即可。作为被检测体的例子，可以列举包括人和非人哺乳动物在内的哺乳动物，优选为人。例如，该被检测体可以为需要进行自身的核酸分析的人或非人哺乳动物。或者，该被检测体可以为需要或希望进行皮肤的基因表达分析、或者使用核酸的皮肤或皮肤以外的部位的状态分析的人或非人哺乳动物。24.作为采集被检测体的ssl的皮肤的部位，可以列举头、脸、颈、躯干、手足等身体的任意部位的皮肤、患有特应性炎症、痤疮、干燥症、炎症(发红)、肿瘤等疾病的皮肤、有创伤的皮肤等，但没有特别限定。在本说明书中，只要没有特别限定，“皮肤”是包括体表的表皮、真皮、毛囊，以及汗腺、皮脂腺和其他腺体等组织在内的区域的总称。25.被检测体的ssl含有在该被检测体的皮肤细胞中表达的rna，优选含有在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺和真皮的任意部位表达的rna，更优选含有在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺的任意部位表达的rna(参照专利文献1)。因此，利用本发明的方法制备的来自ssl的rna优选为来自被检测体的选自表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺和真皮中的至少1个部位的rna，更优选为来自选自表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺中的至少1个部位的rna。26.从被检测体的皮肤采集ssl时，可以采用用于从皮肤回收或除去ssl的所有方法。优选可以使用后述的ssl吸收性材料、ssl粘附性材料或者从皮肤刮下ssl的器械。作为ssl吸收性材料或ssl粘附性材料，只要是对ssl具有亲和性的材料，就没有特别限定，例如可以列举聚丙烯、纸浆等。作为从皮肤采集ssl的过程的更详细的例子，可以列举：利用吸油纸、吸油膜等片状材料吸收ssl的方法；利用玻璃板、胶带等粘附ssl的方法；利用刮铲、刮刀等刮下ssl并回收的方法等。为了提高ssl的吸附性，也可以使用预先含有脂溶性高的溶剂的ssl吸收性材料。另一方面，ssl吸收性材料含有水溶性高的溶剂或水分时，会阻碍ssl的吸附，因此不优选。ssl吸收性材料优选以干燥的状态使用。27.从被检测体采集的含有rna的ssl可以保存至用于后述的rna制备之前。该ssl能够以被ssl吸收性材料或ssl粘附性材料吸收或粘附的状态原样保存。该ssl可以在目前一般的rna保存条件(例如－80℃)下保存，但能够在更温和的条件下保存(国际申请号pct/jp2019/043040)。例如，保存该含有rna的ssl的温度条件只要为0℃以下即可，优选为－10℃以下，更优选为－20℃以下。该保存的时间没有特别限定，优选为12个月以下，更优选为6个月以下，进一步优选为3个月以下。28.从ssl提取rna时，可以使用上述的通常的rna提取方法，例如酚－氯仿法、agpc法和市售的rna精制用的试剂、层析柱或磁性颗粒。29.在本发明的方法中，通过逆转录(rt)由该样本rna合成cdna，接着，利用多重pcr(mpcr)扩增该cdna。这些rt反应和mpcr均在单链核酸结合蛋白的存在下进行。30.除了向反应体系中添加单链核酸结合蛋白以外，该样本rna的逆转录可以按照通常的步骤进行。例如只要对含有该样本rna、引物、逆转录酶和底物的反应液进行培养，使逆转录酶作用于该样本rna，合成cdna即可。作为该引物，可以使用以所要分析的特定的rna为靶标的引物，为了更全面地进行核酸的保存和分析，优选使用低聚dt引物、随机引物或它们的混合物。作为该逆转录酶，可以使用一般的逆转录酶，优选使用逆转录的准确性和效率性高的逆转录酶(例如m－mlv逆转录酶(reversetranscriptase)及其变异体、或后述的市售的逆转录反应用酶)。该底物为该逆转录酶的底物，优选使用脱氧核糖核苷酸，例如datp、dctp、dgtp和dttp以及它们的混合物。该脱氧核糖核苷酸也可以被修饰。在本发明中，作为用于rt的酶和其他试剂，可以列举市售的逆转录反应用酶和逆转录试剂试剂盒，例如primescript(注册商标)reversetranscriptase系列(takarabio公司)、superscript(注册商标)reversetranscriptase系列(lifetechnologiesjapanltd.)等，优选使用superscript(注册商标)iiireversetranscriptase、superscript(注册商标)vilocdna合成试剂盒(vilocdnasynthesiskit)(均为lifetechnologiesjapanltd.)。rt反应的温度和时间可以根据所使用的酶或试剂的种类、样本rna、所要合成的cdna等适当设定。例如只要使用市售的逆转录反应用试剂，按照其手册制备反应液后，向该反应液中添加单japanltd.)所附带的5×vilortreactionmix、和ionampliseqtranscriptomehumangeneexpressionkit(lifetechnologiesjapanltd.)所附带的5×ionampliseqhifimix、和ionampliseqtranscriptomehumangeneexpressioncorepanel，基于各试剂盒所附带的操作规程进行这些操作。36.本发明的核酸扩增方法能够应用于使用rna的各种分析或诊断。优选本发明的方法能够用于能够应用多重pcr的所有分析，例如基因表达分析、转录组分析、被检测体的功能分析、疾病的诊断、向被检测体给药的药物的疗效评价等的基因的全面分析或以特定的基因为靶标的表达分析。37.作为本发明的例示的实施方式，本说明书进一步公开以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明并不限定于这些实施方式。38.〔1〕一种核酸扩增方法，包括：39.通过逆转录由样本rna合成cdna的步骤；和40.利用多重pcr扩增该cdna的步骤，41.该逆转录和该多重pcr在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体。42.〔2〕如〔1〕所述的方法，其中，优选上述t4gp32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨基酸序列构成并且与单链核酸结合的蛋白质。43.〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，上述逆转录优选在含有低聚dt引物、随机引物或它们的混合物的反应液中进行，更优选在含有随机引物的反应液中进行。44.〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，优选上述样本rna为来自皮肤表面脂质的rna。45.〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，上述逆转录和上述多重pcr的反应液中的上述单链核酸结合蛋白的初始浓度优选为1μg/ml以上，更优选为5μg/ml以上，进一步优选为7μg/ml以上，另一方面，优选为100μg/ml以下，更优选为20μg/ml以下，进一步优选为15μg/ml以下，或者优选为1～100μg/ml，更优选为5～20μg/ml，进一步优选为7～15μg/ml。46.〔6〕一种改善剂，其是以单链核酸结合蛋白为有效成分的多重rt－pcr的产量改善剂，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体，并且添加在逆转录和多重pcr双方的反应液中。47.〔7〕如〔6〕所述的改善剂，其中，优选上述t4gp32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨基酸序列构成并且与单链核酸结合的蛋白质。48.〔8〕如〔6〕或〔7〕所述的改善剂，其中，上述逆转录优选在含有低聚dt引物、随机引物或它们的混合物的反应液中进行，更优选在含有随机引物的反应液中进行。49.〔9〕如〔6〕～〔8〕中任一项所述的改善剂，其优选改善使用来自皮肤表面脂质的rna的多重rt－pcr的产量。50.〔10〕如〔6〕～〔9〕中任一项所述的改善剂，其中，上述逆转录和多重pcr的反应液中的上述单链核酸结合蛋白的初始浓度优选为1μg/ml以上，更优选为5μg/ml以上，进一步优选为7μg/ml以上，另一方面，优选为100μg/ml以下，更优选为20μg/ml以下，进一步优选为15μg/ml以下，或者优选为1～100μg/ml，更优选为5～20μg/ml，进一步优选为7～15μg/ml。51.〔11〕如〔6〕～〔10〕中任一项所述的改善剂，其优选改善多重rt－pcr的灵敏度和产量。52.〔12〕单链核酸结合蛋白在改善多重rt－pcr的产量中的用途，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体，并且添加在逆转录和多重pcr双方的反应液中。53.〔13〕如〔12〕所述的用途，其中，优选上述t4gp32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨基酸序列构成并且与单链核酸结合的蛋白质。54.〔14〕如〔12〕或〔13〕所述的用途，其中，上述逆转录优选在含有低聚dt引物、随机引物或它们的混合物的反应液中进行，更优选在含有随机引物的反应液中进行。55.〔15〕如〔12〕～〔14〕中任一项所述的用途，其中，优选上述单链核酸结合蛋白用于改善使用来自皮肤表面脂质的rna的多重rt－pcr的产量。56.〔16〕如〔12〕～〔15〕中任一项所述的用途，其中，上述逆转录和多重pcr的反应液中的上述单链核酸结合蛋白的初始浓度优选为1μg/ml以上，更优选为5μg/ml以上，进一步优选为7μg/ml以上，另一方面，优选为100μg/ml以下，更优选为20μg/ml以下，进一步优选为15μg/ml以下，或者优选为1～100μg/ml，更优选为5～20μg/ml，进一步优选为7～15μg/ml。57.〔17〕如〔12〕～〔16〕中任一项所述的用途，其中，优选上述单链核酸结合蛋白用于改善多重rt－pcr的灵敏度和产量。58.〔18〕单链核酸结合蛋白在制造多重rt－pcr的产量改善剂中的用途，该单链核酸结合蛋白为t4gp32或其变异体，在逆转录和多重pcr双方的反应液中添加该改善剂。59.〔19〕如〔18〕所述的用途，其中，优选上述t4gp32或其变异体为由序列号1的氨基酸序列或与该序列至少90％序列相同的氨基酸序列构成并且与单链核酸结合的蛋白质。60.〔20〕如〔18〕或〔19〕所述的用途，上述逆转录优选在含有低聚dt引物、随机引物或它们的混合物的反应液中进行，更优选在含有随机引物的反应液中进行。61.〔21〕如〔18〕～〔20〕中任一项所述的用途，其中，优选上述单链核酸结合蛋白用于改善使用来自皮肤表面脂质的rna的多重rt－pcr的产量。62.〔22〕如〔18〕～〔21〕中任一项所述的用途，其中，上述逆转录和多重pcr的反应液中的上述单链核酸结合蛋白的初始浓度优选为1μg/ml以上，更优选为5μg/ml以上，进一步优选为7μg/ml以上，另一方面，优选为100μg/ml以下，更优选为20μg/ml以下，进一步优选为15μg/ml以下，或者优选为1～100μg/ml，更优选为5～20μg/ml，进一步优选为7～15μg/ml。63.〔23〕如〔18〕～〔22〕中任一项所述的用途，其中，优选上述单链核酸结合蛋白用于改善多重rt－pcr的灵敏度和产量。64.实施例65.以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，本发明并不限定于此。66.实施例1t4gp32对多重pcr的效果67.1)从ssl中提取rna68.将健康的成人女性或男性各1名作为被检验者。使用吸油膜(5×8cm、聚丙烯制、3mjapan)，从被检验者的整个脸部回收皮脂。含有皮脂的该吸油膜被收集在一起后移至玻璃瓶中，以－80℃保存至rna精制之前。对该吸油膜所含的ssl中的rna进行精制。将该吸油膜切成合适的大小，使用qiazol(注册商标)裂解试剂(lysisreagent)(qiagen)，从该膜回收含有rna的水相。利用所回收的水相，基于rneasy(注册商标)(qiagen)所附带的操作规程提取rna。69.2)逆转录和多重pcr70.利用所提取的rna，使用superscript(注册商标)vilocdnasynthesiskit(lifetechnologiesjapanltd.)，以42℃进行30分钟逆转录，合成cdna。逆转录反应的引物使用试剂盒所附带的随机引物。利用所得到的cdna，通过多重pcr，制作含有来自20802基因的dna的文库。使用ionampliseqtranscriptomehumangeneexpressionkit(lifetechnologiesjapanltd.)，与pcr改善剂一起在[99℃、2分钟→(99℃、15秒→60℃、16分钟)×20次循环→4℃、保持(hold)]的条件下进行多重pcr。作为pcr改善剂，基于现有报告(非专利文献1、2)，以表1所记载的浓度使用bsa(冻干粉(lyophilizedpowder)，基本不含igg(essentiallyigg－free)，低内毒素(lowendotoxin)，生物试剂(bioreagent)，适于细胞培养(suitablefworsellculture))(sigmaaldrich、目录号：a2058)、甜菜碱盐酸盐(富士胶片和光纯药株式会社)和t4gp32(newenglandbiolabsinc.)。使用tapestation(agilenttechnologies株式会社)和高灵敏度(highsensitivity)d1000screentape(agilenttechnologies株式会社)，测定所制作的文库的pcr产物浓度。求出pcr产物相对于对照(未添加pcr改善剂)的相对产量。[0071]3)结果[0072]将pcr产物在pcr改善剂存在下的相对产量示于表1。其中，在表1中，bsa和甜菜碱的结果是使用来自女性被检验者的ssl中rna时的结果，t4gp32的结果是使用来自男性被检验者的ssl中rna时的结果。在添加t4gp32的情况下，pcr产物相对于对照的相对产量增加至1.41。另一方面，在添加bsa或甜菜碱的情况下，在对照中检出了pcr产物，与之相对，pcr产物减少至检测极限以下。在现有技术(非专利文献3、4)中报告了，即使向rt后的pcr体系中添加t4gp32，也没有观察到明显的产量增加，但本发明推测，在本发明这样的以多个区域为对象的多重pcr的情况下，t4gp32的添加对反应灵敏度和产量产生了显著的效果。[0073][表1][0074][0075]实施例2t4gp32对逆转录和多重pcr的效果[0076]1)逆转录和多重pcr[0077]将健康的成人男性1名作为被检验者。使用吸油膜(5×8cm、聚丙烯制、3mjapan)，从被检验者的整个脸部回收皮脂。利用该吸油膜，按照与实施例1相同的步骤提取rna。逆转录在添加了t4gp32(0.0010w/v％)或未添加的条件下与实施例1同样实施。关于多重pcr，也在添加了t4gp32(0.0010w/v％)或未添加的条件下与实施例1同样实施，并测定pcr产物浓度。求出pcr产物相对于对照(在逆转录和pcr中未添加t4gp32)的相对产量。[0078]2)结果[0079]将结果示于表2。在只在逆转录中添加t4gp32的情况下，以及在只在多重pcr中添加t4gp32的情况下，相对于对照的相对产量分别为1.06和1.41。与之相对，在逆转录和多重pcr双方的过程中都添加t4gp32的情况下，相对产量显著增加至2.19。[0080][表2][0081]当前第1页12当前第1页12









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