抗-α-突触核蛋白单克隆抗体及其使用方法

有机化合物处理,合成应用技术抗-α-突触核蛋白单克隆抗体及其使用方法1.相关申请的交叉引用2.根据35u.s.c.§119(e)，本技术要求2019年11月19日提交的美国临时专利申请号62/937,636的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。3.关于联邦资助的研究或开发的声明4.本发明是在美国国立卫生研究院(nih)授予的资助号t32-ag000255、p30-ag10124、p50-ns053488和r01-ns088322下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。背景技术：：：5.帕金森氏病(pd)是一种影响全球1％的人口的进行性神经退行性疾病，但是没有改善疾病的治疗方法。即使是最有效的多巴胺替代疗法也不能阻止疾病进展，包括在高达80％的病例中发生的痴呆症的发展。作为疾病特征的运动症状通常先于包括便秘、睡眠障碍和嗅觉功能障碍的非运动症状，并且通常随后出现认知能力下降，这可能导致诊断为pd痴呆(pdd)。路易体痴呆(dlb)的症状和病理与pd和pdd重叠，这表明这三种疾病属于一系列神经退行性疾病，统称为α-突触核蛋白病，由于正常突触的α-突触核蛋白在神经元路易体(lb)和轴突路易神经突(ln)内的异常积累引起的。因为α-突触核蛋白的罕见突变、重复和三重化会导致家族性pd，α-突触核蛋白不仅仅是这些疾病的无关者(bystander)。6.症状从可控到衰弱的进展与大脑较高皮质区域的α-突触核蛋白病理负担相对应。在有或没有家族突变的小鼠中，α-突触核蛋白的过表达足以驱动lb样包涵体和神经退行性变的形成。此外，α-突触核蛋白水平的降低对神经毒素诱导的pd模型具有有益作用。总之，这些研究表明减少α-突触核蛋白，尤其是错误折叠形式，可能是治疗pd和相关α-突触核蛋白病的治疗策略。由于α-突触核蛋白主要位于神经元细胞质中，因此假设治疗分子不仅需要穿过血脑屏障(bbb)，而且还需要穿过神经元质膜，才能与α-突触核蛋白相互作用。然而，最近的一些体外和体内研究表明，错误折叠的α-突触核蛋白种类由神经元释放，并可以被附近的神经元吸收，诱导致病性α-突触核蛋白的跨细胞传递。因此，最大限度地减少这种细胞外致病性α-突触核蛋白库的影响为治疗pd提供了独特且更容易获得的治疗机会，特别是如果病理性α-突触核蛋白也存在于外周区域，例如肠神经系统中。7.有许多潜在的方法可以抑制α-突触核蛋白病理特征(pathology)的传递。例如，细胞外α-突触核蛋白可以作为血管或淋巴清除的目标，可以阻断其摄取，或者可以修饰神经胶质细胞以促进细胞外α-突触核蛋白的清除。通过抗体介导的免疫疗法可能会促进至少一些可能的机制。例如，抗体可能会阻断神经元α-突触核蛋白的摄取，同时还可以通过与表面fc受体结合来促进外周的淋巴清除或神经胶质的清除。被动免疫疗法(直接用抗体治疗，而不是注射免疫原)是一种特别有吸引力的选择，因为治疗性抗体已被证明是相对安全的，并且免疫疗法已显示可以促进细胞外靶标的清除。所施用的抗体必须达到足够的脑水平来影响疾病生物学，但是已知抗体具有较差的bbb渗透性。8.需要开发可用于研究pd和相关疾病的神经病理特征的抗α-syn抗体。在某些实施方式中，这些抗体可用于治疗这些疾病。本公开内容解决并满足了这些需求。技术实现要素：9.本公开内容提供了某些单克隆抗体，其包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，如本文其他地方所定义的。本公开内容进一步提供了一种药物组合物，其包括至少一种本文所考虑的单克隆抗体和至少一种药物赋形剂。本公开内容进一步提供了某种分离的多核苷酸，其包括本文所考虑的核酸序列中的至少一种。10.本公开内容进一步提供自主复制或整合的哺乳动物细胞载体，其包括至少一种重组核酸，该重组核酸编码至少一种抗体，该抗体包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，如本文其他地方所定义的。本公开内容进一步提供了分离的宿主细胞，其包括本文所考虑的任一种载体。11.本公开内容进一步提供了治疗、改善和/或预防受试者中突触核疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种本文所考虑的分离的单克隆抗体。12.本公开内容进一步提供了一种检测受试者中的突触核疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用至少一种本文所考虑的标记的分离的单克隆抗体。在某些实施方式中，该方法包括检测标记的分离的单克隆抗体与受试者中存在的任何α-syn原纤维、寡聚物和/或其他错误折叠的α-syn种类的复合物的存在或不存在。在某些实施方式中，如果检测到该复合物，则受试者患有突触核疾病。13.本公开内容进一步提供了检测样品中总α-syn、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类的方法。在某些实施方式中，该方法包括使样品与至少一种本文所考虑的标记的分离的单克隆抗体接触。在某些实施方式中，该方法包括检测标记的分离的单克隆抗体与样品存在的总α-syn、α-syn单体、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类的复合物的存在或不存在。在某些实施方式中，如果检测到该复合物，则样品中存在总α-syn、α-syn单体、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类。附图说明14.当结合附图阅读时，将更好地理解以下对本公开内容的具体实施方式的详细描述。为了说明本公开内容，附图显示了具体实施方式。然而，应当理解，本公开内容不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。15.图1a-1f包括被动免疫疗法筛选示意图。图1a：用α-突触核蛋白预制原纤维(pff)对小鼠进行免疫，以诱导免疫反应和产生针对致病性α-突触核蛋白的抗体。图1b：随后从免疫小鼠的脾脏中收获产生抗体的b细胞，并与骨髓瘤细胞融合以产生表达抗α-突触核蛋白抗体的杂交瘤克隆细胞系。图1c：将杂交瘤分离成单独的克隆群，并且将来自每个克隆的含有抗体的上清液通过初级筛选，以鉴定具有优选特性的候选物。为了确认抗体会识别致病性人类α-突触核蛋白，将抗体用于人体组织的ihc。在某些非限制性实施方式中，候选抗体还对纤维状α-突触核蛋白具有优先性，因此它们以间接elisa形式筛选单体和纤维状α-突触核蛋白。每种抗体都经过表位图分析(mapping)并测试了针对小鼠和人类α-突触核蛋白的免疫原性，因此可用于小鼠疾病模型。最后，在原代神经元免疫疗法测定中筛选降低培养神经元中α-突触核蛋白病理特征的能力的抗体。图1d：优先处理的抗体再进行两轮亚克隆以确保单克隆性。图1e：最终克隆经过确认筛选，以确保它们保持最佳特性并确定用于体内实验的最终候选物。图1f：在pd小鼠模型中测试了非限制性候选抗体降低α-突触核蛋白病理特征和毒性的能力。该候选物与igg对照和已证明治疗效果的α-突触核蛋白抗体一起进行了测试。16.图2a-2b图解了揭示优先结合lb的抗体的非限制性免疫组织化学结果。图2a：使用未稀释或1：3稀释的杂交瘤上清液对含有丰富路易体病理特征的杏仁核组织切片进行染色。显示了每个筛选的抗体上清液的代表性路易体染色。比例尺＝50μm。图2b：路易体内的光密度除以包含这些路易体的1mm2组织切片的光密度被定义为路易体鉴别指数(lewybodydiscriminationindex)。优先识别路易体的抗体在该测量中得分高。大多数抗体显示出对路易体的一些增强的识别，例外是那些得分低于1.5的抗体，这些抗体对于路易体相比于神经纤维α-突触核蛋白染色几乎没有明显的优先性。17.图3a-3c图解了确保某些抗体识别人和小鼠α-突触核蛋白的非限制性表位图分析。图3a：用于确定9000系列抗体的表位的重组α-突触核蛋白片段的示意图。全长(fl)α-突触核蛋白是具有内部非淀粉样蛋白成分(nac)结构域的140个氨基酸。用于测试表位的构建体具有截短的n端或c端人类α-突触核蛋白残基。图3b：大多数抗体在一定程度上识别人和小鼠的α-突触核蛋白。此外，所有抗体都识别具有截短的n端的α-突触核蛋白，这表明它们都识别α-突触核蛋白的c端。如果连最后10个氨基酸也不包括，则其中最端处不识别α-突触核蛋白，这表明表位在aa130-140之间。许多其他抗体识别1-130，但不识别1-120，这表明它们在120-130之间具有表位。图3c：又一大批抗体不识别1-110，这表明它们识别110-120。最后，有几种抗体可以识别除1-89之外的所有构建体，表明表位位于氨基酸90-102之间。*将肽1-110加载到这些凝胶的最后一条泳道中，从而使泳道向左移动。18.图4a-4c图解了鉴定对错误折叠的α-突触核蛋白具有优先性的抗体的非限制性夹心elisa。通过以人类α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白pff作为抗原进行平行夹心elisa，评估抗体对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。syn211也在每个板上用作非选择性对照抗体。使用这种方法，区分了三类抗体——(图4a)在该测定中不结合并且因此对单体或pff没有信号的抗体；(图4b)非选择性且与α-突触核蛋白单体和pff具有相似结合的抗体；和(图4c)pff选择性抗体，该抗体显示对α-突触核蛋白pff的优先性明显高于单体。显示的直方图代表三个类别，但是所有测试的抗体都可以归类为这些类别之一。曲线图代表3次技术重复的平均值，并且误差线代表标准误差。19.图5a-5b图解了揭示α-突触核蛋白抗体预防lb样病理特征的不同效力的非限制性神经元免疫疗法测定。图5a：用α-突触核蛋白pff和所述代表性抗体处理原代神经元后ps129α-突触核蛋白病理特征(绿色)和neun(洋红色)免疫染色的实例。比例尺＝50μm。图5b：归一化至igg处理的神经元的ps129α-突触核蛋白面积/神经元数量的量化。抗体对α-突触核蛋白病理特征有不同的影响，并且从效果最低到最有效。21种抗体显示病理特征显著降低(kruskal-wallis检验和dunn多重比较检验：*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001)。n＝6-20/条件。误差线代表标准误差。20.图6a-6b包括抗体特征的总结，显示为热图，比例尺显示在每列的顶部。抗体主要来自igg亚类。大多数抗体识别小鼠α-突触核蛋白，并且所有抗体都识别人类α-突触核蛋白。来自免疫组织化学的lb鉴别指数反映了抗体选择性结合lbα-突触核蛋白的能力。α-突触核蛋白pff优先性源自夹心elisa结果，并且跨越超过100倍的差异，以允许选择对错误折叠的α-突触核蛋白具有优先性的抗体(nb＝未结合)。最后，来自原代神经元测定的抑制％测量表明抗体能够减少细胞系统中的病理特征。在某些实施方式中，感兴趣的抗体识别小鼠和人类α-突触核蛋白这二者，将lb与周围的神经纤维网(neuropil)区分开来，对α-突触核蛋白pff比对单体具有更高的结合亲和力，并且抑制几乎所有体外神经元α-突触核蛋白病理特征。基于这些测量，选择了syn9048和syn9063进行进一步的亚克隆。21.图7a-7d图解了非限制性亚克隆，其保留了亲本克隆的特性。图7a：如前所述测定syn9063亚克隆的pff优先性以确保所有亚克隆显示与亲本克隆相同的选择性。除了一个亚克隆外，所有亚克隆都表现出对α-突触核蛋白pff的高度优先性。图7b：所有syn9048亚克隆对α-突触核蛋白pff显示出相似的选择性。图(图7a)和(图7b)中的曲线图表示来自3次技术重复的平均值，并且误差条表代表准误差。图7c：在用α-突触核蛋白pff以及所述摩尔比的纯化的syn9048克隆#3与α-突触核蛋白单体处理原代神经元后的ps129α-突触核蛋白病理特征(绿色)和neun(洋红色)免疫染色的实例。比例尺＝50μm。图7d：归一化至对照igg处理的神经元的ps129α-突触核蛋白面积/神经元数量的量化。增加syn9048的摩尔比以剂量依赖性方式降低ps129α-突触核蛋白病理特征，并通过ic50为0.006(r2＝0.9539)的s型剂量曲线拟合。n＝3/条件。误差线代表标准误差，并且阴影面积代表s形拟合的95％置信区间。22.图8a-8g图解了体内免疫疗法耐受性良好并改善多巴胺能张力。图8a：野生型小鼠在2-3个月大时在背部纹状体中注射α-突触核蛋白pff。在α-突触核蛋白pff注射一周后，给小鼠注射30mg/kg对照igg1、syn303或syn9048。此后每周给小鼠注射一次，持续6个月，之后处死小鼠并检测病理特征和运动行为。图8b：每个抗体治疗组中小鼠的平均体重，标准误差以阴影带表示。随者时间的推移体重增加，但是组间没有差异(双因素方差分析：时间p＝0.0001；治疗p＝0.7209)。n＝16/组。误差线代表标准误差。图8c：来自用对照igg1、syn303或syn9048处理的小鼠的用th染色的sn的代表性图像。比例尺＝500μm。图8d：在通过sn手动量化神经元后估计的sn中的th+神经元(c＝对侧；i＝同侧)。在所有组的注射部位同侧观察到大量神经元丢失(双因素方差分析与sidak多重比较检验，对侧相对于同侧：igg1p《0.0001；syn303p《0.0001；syn9048p《0.0001)，但在各组间没有差异(双因素方差分析与sidak多重比较检验同侧：igg1对syn303p＝0.6266，igg1对syn9048p＝0.3561)。n＝10-16/组。图8e：保留在同侧sn与对侧sn上的神经元的比率同样显示各组间没有差异(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对syn303p＝0.6323，igg1对syn9048p＝0.9084)。图8f：从注射小鼠背部纹状体测量的多巴胺水平在igg1处理的动物的注射部位同侧降低，但在syn9048处理小鼠中保留(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对初始p＝0.0283；igg1对syn303p＝0.9791；igg1对syn9048p＝0.0047)。n＝7-12/组。图8g：syn9048处理同样保留了dopac水平(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对初始p＝0.0469；igg1对syn303p＝0.9969；igg1对syn9048p＝0.0049)。n＝7-12/组。误差线代表标准误差。23.图9a-9f图解了syn9048减少sn和杏仁核中的α-突触核蛋白病理特征。图9a：注射了α-突触核蛋白pff的小鼠在同侧sn中积累了大量的α-突触核蛋白病理特征，如构象选择性抗体syn506所识别的。此时在对侧sn中也观察到罕见的病理特征。比例尺＝100μm。图9b：syn506+面积/切片在整个对侧sn中被量化，并且虽然不显著，但是基本上减少(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对syn303p＝0.0827；igg1对syn9048p＝0.0847)。n＝14-16/组。图9c：同侧sn中的免疫疗法治疗也减少了α-突触核蛋白病理特征(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对syn303p＝0.0937；igg1对syn9048p＝0.0444)。n＝14-16/组。图9d：注射了α-突触核蛋白pff的小鼠在同侧和对侧杏仁核中积累了大量的α-突触核蛋白病理特征，如构象选择性抗体syn506所识别的。比例尺＝100μm。图9e：syn506+面积/切片在整个对侧杏仁核中被量化，并且基本上减少(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对syn303p＝0.0521；igg1对syn9048p＝0.0069)。n＝14-16/组。图9f：同侧杏仁核中的α-突触核蛋白病理特征没有减少到相同的程度(单因素方差分析与dunnett多重比较检验：igg1对syn303p＝0.8694；igg1对syn9048p＝0.2464)。n＝14-16/组。所有点代表单个小鼠，并且误差条代表标准误差。24.图10图解了β-突触核蛋白的非限制性识别。通过蛋白质印迹法，大多数抗体不能识别β-突触核蛋白。syn9030和syn9066与β-突触核蛋白有轻微的反应性，表明这些抗体有一些交叉反应性。将syn7015用作阳性对照，因为该抗体与β-突触核蛋白发生交叉反应。25.图11a-11b图解鉴定未结合抗体的非限制性夹心elisa。通过以α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白pff作为抗原进行平行夹心elisa，评估抗体对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。syn211也在每个板上用作非选择性对照抗体。该图显示了在该测定中未结合的抗体。曲线图代表3次技术重复的平均值，并且误差线代表标准误差。26.图12a-12b图解鉴定非选择性抗体的非限制性夹心elisa。通过以α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白pff作为抗原进行平行夹心elisa，评估抗体对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。syn211也在每个板上用作非选择性对照抗体。该图显示了在该测定中非选择性的抗体。曲线图代表3次技术重复的平均值，并且误差线代表标准误差。27.图13a-13b图解了鉴定α-突触核蛋白pff-选择性抗体的非限制性夹心elisa。通过以α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白pff作为抗原进行平行夹心elisa，评估抗体对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。syn211也在每个板上用作非选择性对照抗体。该图显示了在该测定中对α-突触核蛋白pff显示出优先性的抗体。曲线图代表3次技术重复的平均值，并且误差线代表标准误差。28.图14图解了确认α-突触核蛋白pff-选择性抗体的非限制性第二夹心elisa。通过以α-突触核蛋白单体或α-突触核蛋白pff作为抗原以及多克隆α-突触核蛋白抗体snl4进行第二组平行夹心elisa，评估抗体对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。曲线图代表3次技术重复的平均值，并且误差线代表标准误差。29.图15图解了syn9048预防由小鼠α-突触核蛋白pff诱导的α-突触核蛋白病理特征。测定了syn9048预防神经元中由小鼠α-突触核蛋白诱导的α-突触核蛋白病理特征的能力。如前所述培养原代海马神经元，并用小鼠α-突触核蛋白pff处理，同时增加syn9048的浓度。显示了归一化至igg处理的ps129α-突触核蛋白面积/神经元数量的量化。增加syn9048的摩尔比以剂量依赖性方式减少ps129α-突触核蛋白的病理特征，并通过ic50为0.004(r2＝0.8026)的s型剂量曲线拟合。n＝3/条件。误差线代表标准误差，并且阴影面积代表s形拟合的95％置信区间。具体实施方式30.定义31.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于实践以测试本公开内容，但是本文描述了示例性材料和方法。在描述和要求保护的本公开内容中将使用以下术语。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在被限制。32.如本文中所使用的，以下每个术语在本节中具有与其相关的含义。33.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。通常，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、分析化学、免疫学、核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域众所周知和常用的。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。34.冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法对象。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。35.如本文中所使用的，术语“α-突触核蛋白”或“α-syn”或“α-syn”是指主要在脑组织中表达并且主要位于神经元的突触前末端的蛋白质。在某些实施方式中，本公开内容考虑了具有序列seqidno：245的人α-syn：[0036][0037][0038]如本文中所使用的，术语“α-syn”是指总α-syn、α-syn单体、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚物。如本文中所使用的，α-syn寡聚物是指包含两个或更多个α-syn单体的α-syn的任何多聚体组装体(assembly)。[0039]如本文中所使用的，术语“约(about)”将被本领域普通技术人员理解并且将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如本文中所使用的，当提及可测量值比如量、浓度、持续时间等时，术语“约(about)”意在包括与指定值相差±20％或±10％、更优选地±5％的变化，甚至更优选地±1％，并且还更优选地±0.1％，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。[0040]如本文中所使用的，一个分子对于另一个分子的术语“亲和力”是指两个分子之间结合的程度(或紧密度)。较高的亲和力意味着两个分子之间的结合更紧密。亲和力可以用解离常数(或kd)来量化，其中幅度较低(接近于零)的kd值表示较高的亲和力。[0041]如本文中所使用的，“氨基酸(aminoacid)”意在包括天然和合成氨基酸，以及d和l氨基酸。“标准氨基酸(standardaminoacid)”是指天然存在的肽中常见的二十种l-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸残基(nonstandardaminoacidresidue)”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是源自天然来源。如本文中所使用的，“合成氨基酸(syntheticaminoacid)”还包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(比如酰胺)和取代。肽中所含的氨基酸，特别是羧基端或氨基端的氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团取代进行修饰，这些化学基团可以改变肽的循环半衰期，而不会对肽的活性产生不利影响。此外，肽中可以存在或不存在二硫键。[0042]如本文中所使用的，术语“抗体(antibody)”是指能够特异性结合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本公开内容中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(intracellularantibody)(“胞内抗体(intrabody)”)、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体(scfv)、骆驼抗体和人源化抗体(harlow等人，1999年，usingantibodies：实验室手册，纽约冷泉港实验室出版社；harlow等人，1989年，antibodies：实验室手册，纽约冷泉港；houston等人，1988年，proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等人，1988，science242：423-426)。如本文中所使用的，“中和抗体(neutralizingantibody)”是结合并阻断抗原生物活性的免疫球蛋白分子。[0043]如本文中所使用的，术语“抗原(antigen)”或“ag”被定义为引发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或二者。技术人员将理解包括几乎所有的蛋白质或肽的任何大分子都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组dna。技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文中所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是，本公开内容包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，以及这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因(gene)”编码。容易显而易见的是，抗原可以产生或合成，或者可以来源于生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。[0044]基因的“编码区(codingregion)”由基因编码链的核苷酸残基和基因非编码链的核苷酸组成，非编码链的核苷酸分别与通过基因转录产生的mrna分子的编码区同源或互补。[0045]mrna分子的“编码区(codingregion)”也是由mrna分子的核苷酸残基组成，这些核苷酸残基在mrna分子的翻译过程中与转移rna分子的反密码子区匹配或编码终止密码子。编码区因此可以包括对应于不存在于由mrna分子编码的成熟蛋白质中的氨基酸残基的核苷酸残基(例如，蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)。[0046]如本文中所使用的，“互补性(complementary)”指的是核酸，是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特异性氢键(“碱基配对”)，如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则该残基与第一区域反平行。类似地，已知第一条核酸链的胞嘧啶残基能够与第二条核酸链的残基配对，如果该残基是鸟嘌呤，则该残基与第一条链反平行。如果当两个区域以反平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则核酸的第一区域与同一核酸或不同核酸的第二区域互补。优选地，第一区包括第一部分，和第二区包括第二部分，由此，当第一部分和第二部分以反平行方式布置时，至少约50％，并且优选地至少约75％，至少约90％或至少约95％的第一部分的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。[0047]术语“递送媒介物(deliveryvehicle)”在本文中用作对能够将化合物递送至受试者的任何递送媒介物的通用指代，包括但不限于皮肤递送媒介物和透皮递送媒介物。[0048]如本文中所使用的，术语“dna”定义为脱氧核糖核酸。[0049]“有效量(effectiveamount)”或“治疗有效量(therapeuticallyeffectiveamount)”在本文中可互换使用，是指如本文所述有效实现特定生物学结果的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于通过本领域任何合适的方式确定的疾病或病症的治疗。[0050]“编码(encoding)”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(比如基因、cdna或mrna)用作在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna转录的模板)二者都可以称为编码蛋白质或该基因或cdna的其他产物。[0051]如本文中所使用的，应用于蛋白质或肽的术语“片段(fragment)”是指较大蛋白质或肽的子序列。蛋白质或肽的“片段”长度可以是至少约20个氨基酸；例如长度至少约50个氨基酸；长度至少约100个氨基酸，长度至少约200个氨基酸，长度至少约300个氨基酸，和长度至少约400个氨基酸(以及其间的任何整数值)。如本文中所使用的，抗体片段是指其活性片段，即具有用于定义根据本公开内容的抗体的相同特征的片段，在某些实施方式中，对α-syn原纤维(由错误折叠的α-syn组成)具有高亲和力，并对α-syn单体具有低或高结合亲和力。为方便起见，当使用术语抗体时也考虑了表现出相同特征的其片段。[0052]如本文中所使用的，应用于核酸的术语“片段”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”长度可以至少约15个核苷酸；例如，至少约50个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100至约500个核苷酸，至少约500至约1000个核苷酸，至少约1000至约1500个核苷酸；或约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或约2500个核苷酸(以及介于其间的任何整数值)。[0053]本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。[0054]将核苷酸从5'到3'添加到新生rna转录物的方向称为转录方向。与mrna具有相同序列的dna链称为“编码链(codingstrand)”；dna链上位于dna参考点5'的序列称为“上游序列”；dna链上位于dna参考点3'的序列称为“下游序列”。[0055]如本文中所使用的，“个体(individual)”、“患者(patient)”或“受试者(subject)”包括任何动物物种的成员，包括但不限于鸟类、人类和其他灵长类动物，以及其他哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，比如牛、猪、马、羊、猫和狗。优选地，受试者是人。[0056]如本文中所使用的术语“说明材料(instructionalmaterial)”包括出版物、记录、图表或可用于传达试剂盒中本公开内容的组合物和/或化合物的有用性的任何其他表达媒介。试剂盒的说明材料可以例如贴附在包含本公开内容的化合物和/或组合物的容器上或与包含化合物和/或组合物的容器一起运输。可选地，说明材料可以与容器分开运输，目的是接收者协同使用说明材料和化合物。说明材料的传递可以例如通过出版物的物理传递或传达试剂盒有用性的其他表达媒介，或者可选地通过电子传输，例如通过计算机(比如通过电子邮件或从网站下载)来实现。[0057]“分离的(isolated)”是指从自然状态改变或去除。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。[0058]“分离的核酸(isolatednucleicacid)”是指已从天然存在状态的侧翼序列中分离的核酸区段或片段，即已从通常与该片段相邻的序列(即，与该片段在基因组中天然存在的片段相邻的序列)中去除的dna片段。该术语也适用于已经从天然伴随核酸的其他成分(即，在细胞中天然伴随核酸的rna或dna或蛋白质)基本上纯化的核酸。因此，该术语包括例如整合到载体中、自主复制的质粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因组dna中的重组dna，或作为独立于其他序列的单独的分子(即，作为通过pcr或限制酶消化产生的cdna或基因组或cdna片段)存在的重组dna。它还包括重组dna，它是编码附加多肽序列的杂合基因的一部分。[0059]“核酸(nucleicacid)”是指任何核酸，无论是由脱氧核糖核苷还是核糖核苷组成，也无论是由磷酸二酯键还是修饰键组成，比如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硅氧烷键、碳酸酯键、羧甲基酯键、乙酰胺酸酯键、氨基甲酸酯键、硫醚键、桥接氨基磷酸酯键、桥接亚甲基膦酸酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、二硫代磷酸酯键、桥接硫代磷酸酯键或砜键，以及这些键的组合。术语核酸还具体包括由不同于五种生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)的碱基组成的核酸。[0060]除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列(nucleotidesequenceencodinganaminoacidsequence)”包括所有核苷酸序列，它们是彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可以包括内含子，以至于编码蛋白质的核苷酸序列可以以某些形式包含内含子(一个或多个)。[0061]术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”通常是指短的多核苷酸，通常不超过约60个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由dna序列(即，a、t、g、c)表示时，这也包括其中“u”取代“t”的rna序列(即，a、u、g、c)。[0062]如本文中所使用的，术语“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指至少一种本公开内容的化合物与其他化学组分比如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。[0063]“药学上可接受的(pharmaceuticallyacceptable)”是指从药理学/毒理学角度对患者来说，以及从关于组成、配方、稳定性、患者接受性和生物利用度的物理/化学角度对制造药物化学家来说可接受的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”是指不干扰活性成分的生物活性(一种或多种)的有效性并且对其施用的宿主无毒的媒介。[0064]如本文中所使用的，术语“多核苷酸(polynucleotide)”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下一般知识：核酸是可以被水解成单体“核苷酸(nucleotide)”的多核苷酸。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文中所使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段(即从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列、使用普通克隆技术和pcrtm等)以及通过合成手段。[0065]如本文中所使用的，术语“蛋白质(protein)”、“肽(peptide)”和“多肽(polypeptide)”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。术语“肽键(peptidebond)”是指在一个氨基酸的羧基和第二个氨基酸的氨基之间失去一分子水形成的共价酰胺键。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文中所使用的，该术语指代短链和较长链，短链在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长链在本领域中通常称为蛋白质，该蛋白质有很多类型。“蛋白质(protein)”包括例如生物活性片段、基本上同源的蛋白质、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、蛋白质的变体、修饰的蛋白质、衍生物、类似物和融合蛋白等。蛋白质包括天然蛋白质、重组蛋白质、合成蛋白质或其组合。[0066]如本文中所使用的，术语“重组dna(recombinantdna)”定义为通过连接来自不同来源的dna片段产生的dna。[0067]如本文中所使用的，术语“重组多肽(recombinantpolypeptide)”定义为通过使用重组dna方法产生的多肽。[0068]如本文中所使用的，术语“rna”定义为核糖核酸。[0069]如本文中所使用的，术语“治疗性(therapeutic)”是指治疗和/或预防。[0070]如本文中所使用的，术语“治疗(treat)”是指降低受试者遭受症状的频率或施用药剂或化合物以降低遭受症状的频率和/或严重程度。如本文中所使用的，“减轻(alleviate)”与术语“治疗(treat)”可互换使用。[0071]如本文中所使用的，“治疗疾病(disease)、紊乱(disorder)或病症(condition)”是指降低受试者所遭受的疾病、紊乱或病症的症状的频率或严重程度。治疗疾病、紊乱或病症可能包括也可能不包括完全根除或消除症状。[0072]本文使用以下缩写：bbb，血脑屏障；cdr，互补决定区；dlb，路易体痴呆；fl，全长；lb，路易体；ln，路易神经突；msa，多系统萎缩；nac，非淀粉样蛋白成分；pd，帕金森氏病；pdd，帕金森氏病痴呆；pff，预成型原纤维；vh，重链可变区；vl，轻链可变区。[0073]范围：在整篇公开内容中，本公开内容的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应理解为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1到6的范围的描述应该被认为具体公开了子范围，比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。[0074]描述[0075]本公开内容一般涉及识别α-syn的某些致病形式的某些单克隆(小鼠)抗体或其片段，α-syn是一种在帕金森氏病(pd)和称为突触核蛋白病的相关神经退行性紊乱中错误折叠的蛋白质。pd和路易体痴呆(dlb)是进行性神经退行性疾病，目前尚无改善疾病的治疗。pd和dlb的特征是突触蛋白α-突触核蛋白的聚集，并且有令人信服的证据表明，这些疾病的进展与致病性α-突触核蛋白通过患病个体的大脑的跨细胞扩散有关。因此，针对细胞外致病性α-突触核蛋白的疗法可能有望减缓或阻止疾病进展。[0076]在这项研究开始时，尚不清楚治疗性α-突触核蛋白抗体的首选特性是什么。例如，用泛α-突触核蛋白抗体靶向所有α-突触核蛋白种类可能对中枢神经系统或血液产生有害影响，其中α-突触核蛋白在红细胞中含量丰富。此外，泛α-突触核蛋白抗体与非致病形式的蛋白质的结合会减少可用于结合错误折叠的种类的抗体。[0077]先前的研究已经确定了几种在pd动物模型中有效减少α-突触核蛋白聚集体的抗体。这些抗体具有不同的选择性特征(α-突触核蛋白寡聚物、c端截短的α-突触核蛋白或纤维状α-突触核蛋白)，并且目前尚不清楚针对某些表位的抗体是否比其他抗体更有效。众所周知，只有约0.1％的施用抗体通过bbb，因此使用优先结合致病种类的α-突触核蛋白抗体而不是大脑中存在的α-突触核蛋白单体可能会带来好处。这将增加可以靶向促进疾病进展的α-突触核蛋白的抗体的有效浓度，而不会在与单体的非生产性结合中损失抗体。[0078]在非限制性方面，本研究旨在鉴定对致病性错误折叠的α-突触核蛋白具有高选择性的抗体。在首先用错误折叠的α-突触核蛋白免疫小鼠并创建b细胞杂交瘤文库后，克隆杂交瘤培养物产生的抗体通过一系列筛选试验，以选择对错误折叠的α-突触核蛋白具有高选择性并能够抑制α-突触核蛋白病的原代神经元模型中的lb样结构的形成的抗体。在病理性α-突触核蛋白传递的野生型小鼠模型中测试了说明性候选抗体syn9048的功效。小鼠对慢性6个月施用的syn9048具有良好的耐受性，并且syn9048能够保持纹状体多巴胺水平并减少α-突触核蛋白的病理特征，特别是在可能由致病性α-突触核蛋白的跨细胞扩散引起的α-突触核蛋白包涵体的区域中。在所有测量中，syn9048显示出优于先前验证的α-突触核蛋白抗体的功效(tran等人，2014，cellreports7:2054-2065)，表明syn9048具有治疗、改善和/或预防本文考虑的疾病的期望特性。本研究强调了α-突触核蛋白免疫疗法在治疗pd和dlb方面的治疗潜力，并为筛选α-突触核蛋白抗体以确定具有期望特性的抗体提供了框架。[0079]在某些实施方式中，本公开内容的抗体对α-突触核蛋白的致病形式具有高度选择性，并且可以作为靶向那些致病蛋白质形式的治疗剂施用。在某些实施方式中，本公开内容的抗体识别包含氨基酸110-120和/或120-130与α-syn的另一个区域组合的构象表位。[0080]在某些实施方式中，与天然(即，单体)形式相比，本公开内容的抗体显示出对α-syn(即，原纤维和/或寡聚物)的病理形式的优先结合。在其他实施方式中，本公开内容的抗体减少了通常在暴露于重组α-syn原纤维的培养的神经元中形成的病理性α-syn包涵体/原纤维的形成。在又其他实施方式中，本公开内容的抗体检测病理性α-syn原纤维。在又其他实施方式中，本公开内容的抗体用作减少突触核蛋白病中病理性α-syn原纤维和/或寡聚物的发展/扩散的治疗剂。在其他实施方式中，本公开内容的抗体不与tau和/或β-淀粉样蛋白发生交叉反应。[0081]在某些实施方式中，本公开内容的抗体以等于或小于约10-6m、约10-7m、约10-8m、约10-9m、约10-10m或约10-11m的解离常数kd结合α-syn原纤维和/或寡聚物。在其他实施方式中，本公开内容的抗体以比抗体对α-syn原纤维的亲和力低至少约10倍、30倍、100倍、300倍或1000倍的亲和力结合α-syn单体。在又其他实施方式中，本公开内容的抗体以等于或高于约10-10m、约10-9m、约10-8m、约10-7m、约10-6m、约10-5m、约10-4m或约10-3m的解离常数kd结合α-syn单体。在又其他实施方式中，本公开内容的抗体以几乎相等的亲和力与α-syn原纤维和单体结合。在又其他实施方式中，本公开内容的抗体以几乎相等的亲和力与α-syn原纤维、寡聚物和单体结合，解离常数kd等于或小于约10-7m、约10-8m、约10-9m、约10-10m或约10-11m。抗体的结合亲和力可以通过使用本领域公认的多种方法来确定，包括本文其他地方描述的方法，例如但不限于等温量热法、表面等离子共振、免疫测定法比如elisa或ria等。[0082]包括抗体的组合物[0083]在一方面，本公开内容包括分离的单克隆抗体，其选择性地结合原纤维和/或寡聚构象的α-syn，和/或以高亲和力结合可溶性、寡聚和纤维状α-syn。在某些实施方式中，抗体包含重链。在其他实施方式中，重链包括三个互补决定区(cdr)，即cdr1、cdr2和cdr3。在又其他实施方式中，轻链包含三个互补决定区(cdr)，即cdr1、cdr2和cdr3。[0084]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9003)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0085]重链：dna序列(414bp)[0086]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0087]seqidno：1—seqidno：2—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：5—seqidno：6—seqidno：7—seqidno：8[0088][0089]重链：氨基酸序列(138aa)[0090]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0091]seqidno：9—seqidno：10—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：13—seqidno：14—seqidno：15—seqidno：16[0092][0093]轻链：dna序列(384bp)[0094]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0095]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：20—seqidno：21—seqidno：22—seqidno：23—seqidno：24[0096][0097]轻链：氨基酸序列(128aa)[0098]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0099]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：27—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：32[0100][0101]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9004)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0102]重链：dna序列(426bp)[0103]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0104]seqidno：33—seqidno：34—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：35—seqidno：36—seqidno：7—seqidno：37[0105][0106]重链：氨基酸序列(142aa)[0107]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0108]seqidno：38—seqidno：39—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：40—seqidno：41—seqidno：15—seqidno：16[0109][0110]轻链：dna序列(384bp)[0111]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0112]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：42—seqidno：43—seqidno：22—seqidno：44—seqidno：45[0113][0114]轻链：氨基酸序列(128aa)[0115]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0116]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：46—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：47[0117][0118]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9005)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0119]重链：dna序列(414bp)[0120]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0121]seqidno：48—seqidno：49—seqidno：50—seqidno：51—seqidno：52—seqidno：53—seqidno：54—seqidno：55[0122][0123]重链：氨基酸序列(138aa)[0124]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0125]seqidno：56—seqidno：57—seqidno：58—seqidno：59—seqidno：60—seqidno：61—seqidno：62—seqidno：63[0126][0127]轻链：dna序列(384bp)[0128]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0129]seqidno：64—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：65—seqidno：66—seqidno：67—seqidno：68—seqidno：24[0130][0131]轻链：氨基酸序列(128aa)[0132]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0133]seqidno：69—seqidno：26—seqidno：70—seqidno：71—seqidno：72—seqidno：73—seqidno：85—seqidno：32[0134][0135]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9009)包括具有如下所示序列的轻链idno：6—seqidno：7—seqidno：8[0156][0157]重链：氨基酸序列(138aa)[0158]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0159]seqidno：9—seqidno：10—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：13—seqidno：14—seqidno：15—seqidno：16[0160][0161]轻链：dna序列(384bp)[0162]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0163]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：20—seqidno：21—seqidno：22—seqidno：23—seqidno：24[0164][0165]轻链：氨基酸序列(128aa)[0166]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0167]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：27—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：32[0168][0169]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9018)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0170]重链：dna序列(414bp)[0171]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0172]seqidno：48—seqidno：74—seqidno：50—seqidno：51—seqidno：75—seqidno：76—seqidno：77—seqidno：78[0173][0174]重链：氨基酸序列(138aa)[0175]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0176]seqidno：56—seqidno：79—seqidno：58—seqidno：59—seqidno：60—seqidno：80—seqidno：81—seqidno：63[0177][0178]轻链：dna序列(384bp)[0179]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0180]seqidno：64—seqidno：82—seqidno：19—seqidno：65—seqidno：66—seqidno：67—seqidno：68—seqidno：83[0181][0182]轻链：氨基酸序列(128aa)[0183]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0184]seqidno：69—seqidno：84—seqidno：70—seqidno：71—seqidno：72—seqidno：73—seqidno：85—seqidno：86[0185][0186]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9021)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0187]重链：dna序列(414bp)[0188]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0189]seqidno：48—seqidno：87—seqidno：88—seqidno：51—seqidno：89—seqidno：90—seqidno：54—seqidno：55[0190][0191]重链：氨基酸序列(138aa)[0192]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0193]seqidno：56—seqidno：91—seqidno：92—seqidno：59—seqidno：93—seqidno：94—seqidno：62—seqidno：63[0194][0195]轻链：dna序列(384bp)[0196]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0197]seqidno：64—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：65—seqidno：66—seqidno：95—seqidno：96—seqidno：24[0198][0199]轻链：氨基酸序列(128aa)[0200]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0201]seqidno：69—seqidno：26—seqidno：70—seqidno：71—seqidno：72—seqidno：73—seqidno：85—seqidno：32[0202][0203]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9023)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0204]对具有正确vh和vl插入大小的单个阳性克隆进行测序。在试验中获得了一种vhdna序列和两种vldna序列。[0205]重链：dna序列(414bp)[0206]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0207]seqidno：48—seqidno：74—seqidno：97—seqidno：98—seqidno：99—seqidno：100—seqidno：54—seqidno：55[0208][0209]重链：氨基酸序列(138aa)[0210]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0211]seqidno：56—seqidno：79—seqidno：101—seqidno：59—seqidno：102—seqidno：103—seqidno：62—seqidno：63[0212][0213]轻链1：dna序列(381bp)[0214]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0215]seqidno：104—seqidno：105—seqidno：106—seqidno：107—seqidno：108—seqidno：109—seqidno：110—seqidno：111[0216][0217]轻链1：氨基酸序列(127aa)[0218]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0219]seqidno：112—seqidno：113—seqidno：114—seqidno：115—seqidno：116—seqidno：117—seqidno：118—seqidno：119[0220][0221]轻链2：dna序列(384bp)[0222]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0223]seqidno：64—seqidno：120—seqidno：121—seqidno：122—seqidno：66—seqidno：123—seqidno：68—seqidno：124[0224][0225]轻链2：氨基酸序列(128aa)[0226]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0227]seqidno：69—seqidno：125—seqidno：126—seqidno：127—seqidno：72—seqidno：128—seqidno：129—seqidno：130[0228][0229]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9060)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0230]重链：dna序列(426bp)[0231]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0232]seqidno：33—seqidno：131—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：132—seqidno：133—seqidno：7—seqidno：37[0233][0234]重链：氨基酸序列(142aa)[0235]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0236]seqidno：38—seqidno：39—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：134—seqidno：135—seqidno：15—seqidno：16[0237][0238]轻链：dna序列(384bp)[0239]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0240]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：42—seqidno：43—seqidno：22—seqidno：44—seqidno：45[0241][0242]轻链：氨基酸序列(128aa)[0243]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0244]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：46—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：47[0245][0246]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9064)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0247]重链：dna序列(426bp)[0248]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0249]seqidno：33—seqidno：131—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：132—seqidno：133—seqidno：7—seqidno：37[0250][0251]重链：氨基酸序列(142aa)[0252]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0253]seqidno：38—seqidno：39—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：134—seqidno：135—seqidno：15—seqidno：16[0254][0255]轻链：dna序列(384bp)[0256]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0257]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：42—seqidno：43—seqidno：22—seqidno：44—seqidno：45[0258][0259]轻链：氨基酸序列(128aa)[0260]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0261]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：46—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：47[0262][0263]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9071)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0264]重链：dna序列(426bp)[0265]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0266]seqidno：33—seqidno：131—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：132—seqidno：133—seqidno：7—seqidno：37[0267][0268]重链：氨基酸序列(142aa)[0269]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0270]seqidno：38—seqidno：39—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：134—seqidno：135—seqidno：15—seqidno：16[0271][0272]轻链：dna序列(384bp)[0273]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0274]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：42—seqidno：43—seqidno：22—seqidno：44—seqidno：45[0275][0276]轻链：氨基酸序列(128aa)[0277]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0278]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：46—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：47[0279][0280]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9096)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0281]重链：dna序列(414bp)[0282]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0283]seqidno：136—seqidno：137—seqidno：138—seqidno：51—seqidno：139—seqidno：140—seqidno：141—seqidno：8[0284][0285]重链：氨基酸序列(138aa)[0286]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0287]seqidno：142—seqidno：143—seqidno：144—seqidno：59—seqidno：145—seqidno：146—seqidno：147—seqidno：16[0288][0289]轻链：dna序列(384bp)[0290]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0291]seqidno：64—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：122—seqidno：148—seqidno：149—seqidno：150—seqidno：111[0292][0293]轻链：氨基酸序列(128aa)[0294]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0295]seqidno：69—seqidno：26—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：29—seqidno：151—seqidno：152—seqidno：119[0296][0297]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9110)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0298]重链：dna序列(426bp)[0299]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0300]seqidno：33—seqidno：131—seqidno：3—seqidno：4—seqidno：132—seqidno：133—seqidno：7—seqidno：37[0301][0302]重链：氨基酸序列(142aa)[0303]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0304]seqidno：38—seqidno：39—seqidno：11—seqidno：12—seqidno：134—seqidno：135—seqidno：15—seqidno：16[0305][0306]轻链：dna序列(384bp)[0307]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0308]seqidno：17—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：42—seqidno：43—seqidno：22—seqidno：44—seqidno：45[0309][0310]轻链：氨基酸序列(128aa)[0311]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0312]seqidno：25—seqidno：26—seqidno：46—seqidno：28—seqidno：29—seqidno：30—seqidno：31—seqidno：47[0313][0314]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9035)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0315]重链：dna序列(414bp)[0316]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0317]seqidno：136—seqidno：153—seqidno：50—seqidno：154—seqidno：155—seqidno：156—seqidno：157—seqidno：158[0318][0319]重链：氨基酸序列(138aa)[0320]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0321]seqidno：142—seqidno：159—seqidno：160—seqidno：59—seqidno：161—seqidno：162—seqidno：163—seqidno：164[0322][0323]轻链：dna序列(384bp)[0324]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0325]seqidno：165—seqidno：166—seqidno：167—seqidno：122—seqidno：168—seqidno：169—seqidno：170—seqidno：111[0326][0327]轻链：氨基酸序列(128aa)[0328]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0329]seqidno：69—seqidno：171—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：29—seqidno：172—seqidno：152—seqidno：119[0330][0331]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9047)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0332]重链：dna序列(414bp)[0333]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0334]seqidno：173—seqidno：153—seqidno：50—seqidno：154—seqidno：139—seqidno：174—seqidno：175—seqidno：176[0335][0336]重链：氨基酸序列(138aa)[0337]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0338]seqidno：142—seqidno：159—seqidno：160—seqidno：59—seqidno：145—seqidno：177—seqidno：163—seqidno：178[0339][0340]轻链：dna序列(384bp)[0341]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0342]seqidno：179—seqidno：166—seqidno：180—seqidno：181—seqidno：168—seqidno：182—seqidno：68—seqidno：183[0343][0344]轻链：氨基酸序列(128aa)[0345]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0346]seqidno：184—seqidno：171—seqidno：185—seqidno：186—seqidno：29—seqidno：187—seqidno：129—seqidno：188[0347][0348]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9052)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0349]重链：dna序列(414bp)[0350]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0351]seqidno：136—seqidno：189—seqidno：50—seqidno：154—seqidno：139—seqidno：190—seqidno：191—seqidno：8[0352][0353]重链：氨基酸序列(138aa)[0354]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0355]seqidno：142—seqidno：192—seqidno：160—seqidno：59—seqidno：145—seqidno：193—seqidno：194—seqidno：16[0356][0357]轻链：dna序列(384bp)[0358]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0359]seqidno：165—seqidno：166—seqidno：167—seqidno：122—seqidno：168—seqidno：169—seqidno：195—seqidno：111[0360][0361]轻链：氨基酸序列(128aa)[0362]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0363]seqidno：69—seqidno：171—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：29—seqidno：172—seqidno：152—seqidno：119[0364][0365]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9061)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0366]对具有正确vh和vl插入大小的单个阳性克隆进行测序。在试验中获得了一种vhdna序列和两种vldna序列。[0367]重链：dna序列(414bp)[0368]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0369]seqidno：136—seqidno：196—seqidno：50—seqidno：51—seqidno：197—seqidno：90—seqidno：198—seqidno：8[0370][0371]重链：氨基酸序列(138aa)[0372]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0373]seqidno：142—seqidno：199—seqidno：58—seqidno：59—seqidno：200—seqidno：94—seqidno：201—seqidno：16[0374][0375]轻链1：dna序列(384bp)[0376]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0377]seqidno：64—seqidno：18—seqidno：19—seqidno：122—seqidno：66—seqidno：202—seqidno：203—seqidno：111[0378][0379]轻链1：氨基酸序列(128aa)[0380]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0381]seqidno：69—seqidno：26—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：72—seqidno：204—seqidno：205—seqidno：119[0382][0383]轻链2：dna序列(381bp)[0384]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0385]seqidno：206—seqidno：105—seqidno：207—seqidno：208—seqidno：209—seqidno：210—seqidno：211—seqidno：24[0386][0387]轻链2：氨基酸序列(127aa)[0388]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0389]seqidno：212—seqidno：113—seqidno：213—seqidno：115—seqidno：214—seqidno：215—seqidno：216—seqidno：32[0390][0391]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9092)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0392]重链：dna序列(405bp)[0393]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0394]seqidno：217—seqidno：218—seqidno：219—seqidno：220—seqidno：221—seqidno：222—seqidno：223—seqidno：8[0395][0396]重链：氨基酸序列(135aa)[0397]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0398]seqidno：224—seqidno：225—seqidno：226—seqidno：227—seqidno：228—seqidno：229—seqidno：230—seqidno：16[0399][0400]轻链：dna序列(396bp)[0401]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0402]seqidno：231—seqidno：232—seqidno：233—seqidno：234—seqidno：235—seqidno：236—seqidno：237—seqidno：124[0403][0404]轻链：氨基酸序列(132aa)[0405]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0406]seqidno：238—seqidno：239—seqidno：240—seqidno：241—seqidno：242—seqidno：243—seqidno：244—seqidno：130[0407][0408]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9099)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0409]重链：dna序列(414bp)[0410]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0411]seqidno：136—seqidno：189—seqidno：50—seqidno：154—seqidno：139—seqidno：190—seqidno：191—seqidno：8[0412][0413]重链：氨基酸序列(138aa)[0414]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0415]seqidno：142—seqidno：192—seqidno：160—seqidno：59—seqidno：145—seqidno：193—seqidno：194—seqidno：16[0416][0417]轻链：dna序列(384bp)[0418]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0419]seqidno：165—seqidno：166—seqidno：167—seqidno：122—seqidno：168—seqidno：169—seqidno：195—seqidno：111[0420][0421]轻链：氨基酸序列(128aa)[0422]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0423]seqidno：69—seqidno：171—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：29—seqidno：172—seqidno：152—seqidno：119[0424][0425]在某些实施方式中，单克隆抗体(本文命名为9100)包括具有如下所示序列的轻链和重链可变链：[0426]重链：dna序列(414bp)[0427]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0428]seqidno：136—seqidno：189—seqidno：50—seqidno：154—seqidno：139—seqidno：190—seqidno：191—seqidno：8[0429][0430]重链：氨基酸序列(138aa)[0431]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0432]seqidno：142—seqidno：192—seqidno：160—seqidno：59—seqidno：145—seqidno：193—seqidno：194—seqidno：16[0433][0434]轻链：dna序列(384bp)[0435]信号序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0436]seqidno：165—seqidno：166—seqidno：167—seqidno：122—seqidno：168—seqidno：169—seqidno：195—seqidno：111[0437][0438]轻链：氨基酸序列(128aa)[0439]信号肽-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4[0440]seqidno：69—seqidno：171—seqidno：70—seqidno：127—seqidno：29—seqidno：172—seqidno：152—seqidno：119[0441][0442]在某些实施方式中，分离的单克隆抗体包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)。在某些实施方式中，vl包括cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114、126、185、213或240的氨基酸序列。在某些实施方式中，vl包括cdr2区，其包括seqidno：29、72、116、214或242的氨基酸序列。在某些实施方式中，vl包括cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129、152、205、216或244的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101、144、160或226的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134、145、161、200或228的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr3区，其包括seqidno：15、62、81、147、163、194、201或230的氨基酸序列。[0443]在某些实施方式中，vl包括cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114或126的氨基酸序列。[0444]在某些实施方式中，vl包括cdr2区，其包括seqidno：29、72或116的氨基酸序列。[0445]在某些实施方式中，vl包括cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129或152的氨基酸序列。[0446]在某些实施方式中，vl包括cdr1区，其包括seqidno：70、185、213或240的氨基酸序列。[0447]在某些实施方式中，vl包括cdr2区，其包括seqidno：29、72、214或242的氨基酸序列。[0448]在某些实施方式中，vl包括cdr3区，其包括seqidno：152、129、205、216或244的氨基酸序列。[0449]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：27的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：31的氨基酸序列。[0450]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：46的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：31的氨基酸序列。[0451]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：152的氨基酸序列。[0452]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：85的氨基酸序列。[0453]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：205的氨基酸序列。[0454]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：114的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：116的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：118的氨基酸序列。[0455]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：126的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：129的氨基酸序列。[0456]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：185的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：129的氨基酸序列。[0457]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：213的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：214的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：216的氨基酸序列。[0458]在某些实施方式中，vl包括：cdr1区，其包括seqidno：240的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：242的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：244的氨基酸序列。[0459]在某些实施方式中，vh包括cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101或144的氨基酸序列。[0460]在某些实施方式中，vh包括cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134或145的氨基酸序列。[0461]在某些实施方式中，vh包括cdr3区，其包括seqidno：15、62、81或147的氨基酸序列。[0462]在某些实施方式中，vh包括cdr1区，其包括seqidno：160、58或226的氨基酸序列。[0463]在某些实施方式中，vh包括cdr2区，其包括seqidno：161、145、200或228的氨基酸序列。[0464]在某些实施方式中，vh包括cdr3区，其包括seqidno：163、194、201或230的氨基酸序列。[0465]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：13的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列；[0466]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：40的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列。[0467]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：134的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列。[0468]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：60的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列。[0469]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：60的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：81的氨基酸序列。[0470]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：200的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：201的氨基酸序列。[0471]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：92的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：93的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列。[0472]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：101的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：102的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列。[0473]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：144的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：147的氨基酸序列。[0474]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：163的氨基酸序列。[0475]在某些实施方式中，vh包括cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：194的氨基酸序列。[0476]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：161的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：163的氨基酸序列。[0477]在某些实施方式中，vh包括：cdr1区，其包括seqidno：226的氨基酸序列；cdr2区，其包括seqidno：228的氨基酸序列；和cdr3区，其包括seqidno：230的氨基酸序列。[0478]在某些实施方式中，vl包括以下氨基酸序列：[0479]seqidno：27-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0480]seqidno：46-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0481]seqidno：70-seqidno：71-seqidno：72-seqidno：73-seqidno：85，[0482]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：151-seqidno：152，[0483]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：172-seqidno：152，[0484]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：204-seqidno：205，[0485]seqidno：114-seqidno：115-seqidno：116-seqidno：117-seqidno：118，[0486]seqidno：126-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：128-seqidno：129，[0487]seqidno：185-seqidno：186-seqidno：29-seqidno：187-seqidno：129，[0488]seqidno：213-seqidno：115-seqidno：214-seqidno：215-seqidno：216，或[0489]seqidno：240-seqidno：241-seqidno：242-seqidno：243-seqidno：244。[0490]在某些实施方式中，vh包括以下氨基酸序列：[0491]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：13-seqidno：14-seqidno：15，[0492]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：40-seqidno：41-seqidno：15，[0493]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：134-seqidno：135-seqidno：15，[0494]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：61-seqidno：62，[0495]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：80-seqidno：81，[0496]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：200-seqidno：94-seqidno：201，[0497]seqidno：92-seqidno：59-seqidno：93-seqidno：94-seqidno：62，[0498]seqidno：101-seqidno：59-seqidno：102-seqidno：103-seqidno：62，[0499]seqidno：144-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：146-seqidno：147，[0500]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：177-seqidno：163，[0501]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：193-seqidno：194，[0502]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：161-seqidno：162-seqidno：163，或[0503]seqidno：226-seqidno：227-seqidno：228-seqidno：229-seqidno：230。[0504]在某些实施方式中，vl包括以下氨基酸序列：[0505]seqidno：27-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0506]seqidno：46-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0507]seqidno：70-seqidno：71-seqidno：72-seqidno：73-seqidno：85，[0508]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：151-seqidno：152。[0509]seqidno：114-seqidno：115-seqidno：116-seqidno：117-seqidno：118，或[0510]seqidno：126-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：128-seqidno：129。[0511]在某些实施方式中，vh包括以下氨基酸序列：[0512]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：13-seqidno：14-seqidno：15，[0513]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：40-seqidno：41-seqidno：15，[0514]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：134-seqidno：135-seqidno：15，[0515]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：61-seqidno：62，[0516]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：80-seqidno：81，[0517]seqidno：92-seqidno：59-seqidno：93-seqidno：94-seqidno：62，[0518]seqidno：101-seqidno：59-seqidno：102-seqidno：103-seqidno：62，或[0519]seqidno：144-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：146-seqidno：147。[0520]在某些实施方式中，vl包括以下氨基酸序列：[0521]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：172-seqidno：152，[0522]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：204-seqidno：205，[0523]seqidno：185-seqidno：186-seqidno：29-seqidno：187-seqidno：129，[0524]seqidno：213-seqidno：115-seqidno：214-seqidno：215-seqidno：216，或[0525]seqidno：240-seqidno：241-seqidno：242-seqidno：243-seqidno：244。[0526]在某些实施方式中，vh包括以下氨基酸序列：[0527]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：200-seqidno：94-seqidno：201，[0528]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：177-seqidno：163，[0529]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：193-seqidno：194，[0530]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：161-seqidno：162-seqidno：163，或[0531]seqidno：226-seqidno：227-seqidno：228-seqidno：229-seqidno：230。[0532]在某些实施方式中，单克隆抗体是人源化的。[0533]在某些实施方式中，单克隆抗体是被标记的。[0534]在某些实施方式中，本公开内容的抗体能够穿过血脑屏障(bbb)。在某些实施方式中，本公开内容的抗体是双特异性的，是igg样或非igg样的。如本文其他地方所述，抗体可以结合α-突触核蛋白并使用本文所述的任何cdr序列，并且还可以结合允许抗体转运通过bbb的bbb靶受体(在一个非限制性实例中，通过受体介导的胞吞作用)。这种bbb靶受体的一个非限制性实例是转铁蛋白受体，它激活通常将铁输入大脑的分子通道。本发明所考虑的抗人转铁蛋白受体抗体包括us20160369001中所述的那些，其通过引用以其整体并入本文。这种bbb靶受体的其他非限制性实例是低密度脂蛋白(ldl)受体和胰岛素受体。在某些实施方式中，本公开内容的抗体包含单链抗bbb靶受体抗体。在某些实施方式中，本公开内容的抗体具有工程化为能够结合bbb靶受体的fc片段。在pulgar,front.neurosci.，2019年1月，第12卷，article2019和kariolis等人，sciencetranslationalmedicine12(545),eaay1359中描述了本公开内容中考虑的方法，其通过引用以其整体并入本文。[0535]本公开内容进一步提供了编码抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸(包括rna和/或dna)，例如编码本公开内容中的α-syn抗体的一个或多个cdr，或可变重链或可变轻链区的核酸。核酸包括dna和rna。[0536]在某些实施方式中，本公开内容提供了一种分离的多核苷酸，其包括seqidno：3、5、7、19、21、23、35、43、44、50、52、54、66、68、75、77、88、89、96、97、99、106、108、110、121、132、138、139、141、148、150、155、157、167、168、170、175、180、191、195、197、198、203、207、209、211、219、221、223、233、235和237的核酸序列。[0537]在某些实施方式中，本公开内容提供了一种分离的多核苷酸，其包括选自seqidno：3、5、7、35、50、52、54、75、77、88、89、97、99、132、138、139、141、155、157、175、191、197、198、219、221和223的至少一种核酸序列。[0538]在某些实施方式中，本公开内容提供了一种分离的多核苷酸，其包括选自seqidno：19、21、23、43、44、66、68、96、106、108、110、121、148、150、167、168、170、180、195、203、207、209、211、233、235和237的至少一种核酸序列。[0539]在某些实施方式中，抗体具有由核酸序列组编码的vl，该核酸序列组包括选自下列的核酸序列集：seqidno：19、21、23；seqidno：19、43、44；seqidno：19、66、68；seqidno：19、66、96；seqidno：19、66、203；seqidno：19、148、150；seqidno：106、108、110；seqidno：121、66、68；seqidno：167、168、170；seqidno：167、168、195；seqidno：180、168、68；seqidno：213、214、216；和seqidno：233、235、237。[0540]在某些实施方式中，抗体具有由核酸序列组编码的vh，该核酸序列组包括选自下列的核酸序列集：seqidno：3、5、7；seqidno：3、35、7；seqidno：3、132、7；seqidno：50、52、54；seqidno：50、75、77；seqidno：50、139、175；seqidno：50、139、191；seqidno：50、155、157；seqidno：50、197、198；seqidno：88、89、54；seqidno：97、99、54；seqidno：138、139、141；和seqidno：219、221、223。[0541]在某些实施方式中，本公开内容提供了自主复制或整合的哺乳动物细胞载体，该载体包括本公开内容的重组核酸。在其他实施方式中，本公开内容提供了包括本公开内容的重组核酸的载体。在又其他实施方式中，本公开内容的重组核酸编码包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的抗体。在某些实施方式中，vl包括cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114、126、185、213或240的氨基酸序列。在某些实施方式中，vl包括cdr2区，其包括seqidno：29、72、116、214或242的氨基酸序列。在某些实施方式中，vl包括cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129、152、205、216或244的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101、144、160或226的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134、145、161、200或228的氨基酸序列。在某些实施方式中，vh包括cdr3区，其包括seqidno：15、62、81、62、147、163、194、201或230的氨基酸序列。在又其他实施方式中，载体包括质粒或病毒。在又其他实施方式中，载体包括哺乳动物细胞表达载体。表达载体可包括引导和/或控制插入多核苷酸的表达的核酸序列。这种核酸序列可包括调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列和增强子序列。用于在多种细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域众所周知的。[0542]本发明进一步提供了一种包括本发明的表达载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是分离的。在其他实施方式中，宿主细胞是非人类细胞。在又其他实施方式中，宿主细胞是哺乳动物的。[0543]本公开的抗体可以是哺乳动物抗体，例如灵长类、人、啮齿类、兔、绵羊、猪或马的抗体。抗体可以是任何类别或同种型抗体，例如igm或igg。在某些实施方式中，抗体是igg。[0544]本公开内容进一步提供了一种包括本公开内容的抗体的试剂盒。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，比如fab、f(ab)2或fv片段。抗体可以如本文其他地方所述进行标记。该试剂盒可用于确定受试者是否患有神经退行性疾病，和/或用于治疗、改善和/或预防患有或被认为患有神经退行性疾病的受试者的方法。该试剂盒可进一步用于实施本公开内容的方法所需的任何其他试剂或仪器，比如缓冲液、涂药器等。[0545]下表说明了优先权文件(美国临时专利申请号62/937,636)中使用的seqidno：与本公开中使用的seqidno：之间的关系。[0546][0547][0548][0549][0550][0551][0552][0553]这些抗体的非限制性产生在本文提供的实施例和附图中进行了说明。在某些实施方式中，本公开内容包括药物组合物，其包括这些抗体中的每一种与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。在一些实施方式中，药物组合物被配制用于肠胃外递送。在其他实施方式中，抗体是人源化的。[0554]治疗、改善和/或预防突触核疾病的方法[0555]在一方面，本公开内容提供了一种治疗、改善和/或预防突触核疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的本公开内容的分离的单克隆抗体。在另一方面，本公开内容提供了本公开内容的分离的单克隆抗体，其用作用于治疗、改善和/或预防突触核疾病的药物。在又另一方面，本公开内容提供了本公开内容的分离的单克隆抗体在制备用于治疗、改善和/或预防突触核疾病的药物中的用途。在又另一方面，本公开内容提供了本公开内容的分离的单克隆抗体，其用于治疗、改善和/或预防突触核疾病的方法中。[0556]在某些实施方式中，抗体是人源化的。在其他实施方式中，抗体作为药物组合物施用。[0557]上述单克隆抗体可用于通过减少由α-syn原纤维和/或寡聚物诱导的神经元中的α-syn病理特征来治疗、改善和/或预防突触核疾病。在某些实施方式中，与α-syn相关的神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病、痴呆(比如帕金森氏病伴痴呆和/或路易体痴呆)、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、多系统萎缩、朊病毒疾病和其他与α-syn相关的神经退行性疾病。抗体可以全身或直接施用于观察到或认为存在α-syn原纤维例如路易体的部位。在一个非限制性实例中，抗体可以通过注射到供应大脑的血管中或注射到大脑本身中来施用。受试者可以是哺乳动物，例如人类或非人类哺乳动物。[0558]检测突触核疾病的方法[0559]在又另一方面，本公开内容提供了检测患者中的突触核疾病的方法。在其他实施方式中，本公开内容的抗体可以用作与α-syn相关的神经退行性疾病的诊断工具，包括但不限于帕金森氏病、痴呆(比如帕金森氏病伴痴呆和/或路易体痴呆)、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、多系统萎缩、朊病毒疾病和其他与α-syn相关的神经退行性疾病。在某些实施方式中，该方法在体外进行。在某些实施方式中，这些方法是离体进行的。[0560]在某些实施方式中，检测受试者中的突触核疾病的方法包括以下步骤：向受试者施用本公开内容的标记的、分离的单克隆抗体，并检测受试者中的任何α-syn原纤维和/或寡聚物和抗体之间的复合物的存在/不存在。如果存在复合物，则表明受试者中存在α-syn原纤维和/或寡聚物。在某些实施方式中，如果受试者中存在α-syn原纤维和/或寡聚物，则受试者患有神经退行性疾病。在其他实施方式中，如果受试者中不存在α-syn原纤维或寡聚物，则受试者未患有神经退行性疾病。在又其他实施方式中，如果受试者患有神经退行性疾病，则建议个体接受神经退行性疾病的疗法和/或药物治疗。在又其他实施方式中，如果受试者患有神经退行性疾病，则向个体提供针对神经退行性疾病的疗法和/或药物治疗。[0561]在某些实施方式中，该方法进一步包括将受试者中形成的抗体/α-syn原纤维和/或寡聚物复合物的水平与对照受试者中形成的抗体/α-syn原纤维和/或寡聚物复合物的水平进行比较。对照受试者可以是已知不具有α-syn原纤维和/或寡聚物的受试者、已知具有可检测的α-syn原纤维和/或寡聚物的受试者和/或已知具有一定水平的α-syn原纤维和/或寡聚物的受试者。对照受试者还可以是被治疗或评估的同一受试者，但对应于较早的α-syn原纤维和/或寡聚物检测实验，作为评估受试者疾病进展和/或治疗功效的一种方式。[0562]在又另一方面，本公开内容提供了检测样品中的α-syn原纤维的方法。在某些实施方式中，本公开内容的抗体可用作检测样品中存在的α-syn原纤维、寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的诊断工具。[0563]在某些实施方式中，检测样品(例如，来自受试者)中的α-syn原纤维、寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的方法包括以下步骤：使样品与本公开内容的标记的、分离的单克隆抗体接触；和检测样品中的任何α-syn原纤维、寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类与抗体之间是否存在复合物。如果检测到复合物，则表明样品中存在α-syn原纤维、寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类。在非限制性实例中，样品可以是脑脊液(csf)、血液、尿液、唾液或来自脑、肠、结肠、皮肤或唾液腺的组织。在某些实施方式中，样品是csf样品和/或脑组织样品。在其他实施方式中，样品在从受试者中取出后按原样使用。在其他实施方式中，样品被预处理以用于本方法中。[0564]在某些实施方式中，该方法进一步包括将样品中形成的抗体-α-syn原纤维/寡聚物或其他抗体错误折叠的α-syn复合物的水平与对照样品中形成的抗体-α-syn原纤维/寡聚物或其他抗体错误折叠的α-syn复合物的水平进行比较。对照样品可以来自已知不具有α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的受试者、已知具有可检测的α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的受试者和/或已知具有一定水平的α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的受试者。对照样品可以进一步来自被治疗或评估的同一受试者，但对应于较早的α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类检测，作为评估受试者疾病进展和/或治疗功效的方式。[0565]在某些实施方式中，在受试者中或来自受试者的样品中检测到的α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类的水平与受试者中神经退行性疾病的严重程度或进展相关。在其他实施方式中，本公开内容的方法可用于监测受试者中的神经退行性疾病的严重程度或进展。在其他实施方式中，本公开内容的方法可用于监测疗法和/或药物干预在患有或被认为患有神经退行性疾病的受试者中的有效性。[0566]在某些实施方式中，样品包括或是体外样品。在某些实施方式中，样品包括或者是离体样品。[0567]用于检测抗体与α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类之间形成复合物的方法包括但不限于放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、夹心免疫测定、荧光免疫测定、沉淀反应、凝胶免疫扩散测定、凝集测定、蛋白a免疫测定、免疫电泳测定、电泳、蛋白质印迹或本领域已知的任何其他技术。[0568]在某些实施方式中，本公开内容的抗体可以与标记组合并用于检测患者或样品中的α-syn水平。在其他实施方式中，本公开内容的抗体可以与标记组合并用于检测患者或样品中的α-syn原纤维/寡聚物或其他错误折叠的α-syn种类。标记抗体的方法是本领域已知的并且可以采用多种方法。在某些实施方式中，标记是放射性标记的，比如但不限于f18、i123、in111、i131、c14、h3、tc99m、p32、i125、ga68等。在其他实施方式中，标记是荧光标记，比如但不限于荧光素、罗丹明等。在又一些实施方式中，标签是造影剂，比如但不限于钆(gd)、镝和铁、磁剂等。其他标记包括核磁共振活性标记、可通过pet扫描仪检测的正电子发射同位素、化学发光和酶标记。非限制性成像技术包括电子显微术、共焦显微术、光学显微术、正电子发射断层扫描(pet)、γ-闪烁扫描、磁共振成像(mri)、功能磁共振成像(fmri)、脑磁图(meg)和单光子发射计算机断层扫描(spect)。在又其他实施方式中，标记位于结合包括上述序列的一级抗体的二级抗体上。[0569]施用/剂量/制剂[0570]可以使用已知程序，以有效执行本公开内容中考虑的治疗和/或成像方法的剂量和时间段，将本公开内容的化合物和/或组合物施用至患者，优选地哺乳动物，更优选地人。充分治疗和/或成像信号所必需的化合物的有效量可以根据诸如患者的疾病或病症的状态；患者的年龄、性别和体重；和/或用于检测本公开内容的化合物的设备的因素而变化。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并确定治疗和/或成像化合物的有效量而无需过度实验。[0571]可以改变本公开内容的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现成功治疗和/或成像的活性成分的量，而不会对患者产生毒性。[0572]在某些实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制本公开内容的组合物。在某些实施方式中，本公开内容的药物组合物包含有效量的本公开内容的化合物和药学上可接受的载体。[0573]载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇如甘露醇和山梨糖醇。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来延长可注射组合物的吸收。[0574]制剂可以与常规赋形剂混合使用，即适用于口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮下、肠内或本领域已知的任何其他合适的施用方式的药学上可接受的有机或无机载体物质。药物制剂可以灭菌，并且如果需要，可以与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。[0575]本公开内容的任何组合物的施用途径包括口服、鼻腔、直肠、阴道内、肠胃外、口腔、舌下或局部。可将用于本公开内容的化合物配制成通过任何合适的途径施用，比如口服或肠胃外，例如经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)口腔、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。[0576]合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、凝胶胶囊、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液、糖浆剂、颗粒剂、珠粒、透皮贴剂、凝胶、粉剂、丸剂、浆液、锭剂、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、圆片、栓剂、用于鼻腔或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉剂或雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。应当理解，可用于本公开内容的制剂和组合物不限于本文所述的特定制剂和组合物。[0577]肠胃外施用[0578]如本文中所使用的，药物组合物的“肠胃外施用(parenteraladministration)”包括任何施用途径，其特征在于受试者组织的物理破裂和通过组织中的破裂施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等。特别地，考虑肠胃外施用包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射和肾透析输注技术。comm.6:45)。将解离的海马神经元以17,500个细胞/孔(96孔板)铺板在补充有b27(thermofisher17504044)、2mmglutamax(thermofisher35050061)和100u/ml青霉素/链霉素(thermofisher15140122)的神经元培养基(neurobasal培养基(thermofisher21103049)中。[0590]α-突触核蛋白pff[0591]如其他地方所述，进行重组α-突触核蛋白的纯化和α-突触核蛋白pff的产生(luk等人，2009，procnatlacadsciusa106:20051-20056；volpicelli-daley等人，2014，natureprotocols9:2135-2146)。将含有感兴趣的基因的prk172质粒转化到bl21(de3)ril-感受态大肠埃希杆菌(agilenttechnologiescat#230245)中。来自这种转化的单个菌落在含有氨苄西林的terrificbroth(12g/l细菌胰蛋白胨、24g/l酵母提取物4％(vol/vol)甘油、17mmkh2po4和72mmk2hpo4)中扩增。对来自生长的细菌颗粒进行超声处理，并将样品煮沸以沉淀不需要的蛋白质。将上清液用10mmtris(ph7.6)、50mmnacl、1mmedta透析过夜。用0.22μm过滤器过滤蛋白质，并使用amiconultra-15离心过滤器单元(milliporesigmacat#ufc901008)浓缩。然后将蛋白质加载到superdex200柱上并收集1ml级分。在sds-page上运行级分并用考马斯蓝(coomassieblue)染色以选择高度富含α-突触核蛋白的级分。将这些级分合并并在10mmtris(ph7.6)、50mmnacl、1mmedta中透析过夜。将透析的级分应用于monoq柱(gehealth，hitrapqhp645932)并使用从25mmnacl到1mnacl的线性梯度运行。将收集的级分在sds-page上运行并用考马斯蓝染色。收集高度富含α-突触核蛋白的级分并透析到dpbs中。通过0.22μm过滤器过滤蛋白质，并使用amiconultra-15离心过滤单元(milliporesigmacat#ufc901008)浓缩至5mg/ml。将单体等分并在-80℃下冷冻。为了制备α-突触核蛋白pff，将α-突触核蛋白单体以1,000rpm振荡7天。通过以100,000xg沉降60分钟和硫黄素t荧光来验证向pff的转化。[0592]α-突触核蛋白pff处理[0593]原代神经元[0594]对于神经元的处理，将以5mg/ml的浓度产生的小鼠α-突触核蛋白pff涡旋并用dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs，corningcat#21-031-cv)稀释至100μg/ml。然后对它们进行高超声处理，打开30秒、关闭30秒，循环10次(diagenodebiorupterucd-300浴超声仪)。然后将α-突触核蛋白pff在神经元培养基中稀释至5μg/ml，并以所述浓度加入神经元培养物中。[0595]小鼠[0596]将以5mg/ml的浓度产生的小鼠α-突触核蛋白pff涡旋并用dpbs稀释至2mg/ml。然后对它们进行高超声处理，打开30秒、关闭30秒，循环10次(diagenodebiorupterucd-300浴超声仪)。小鼠在3个月大时注射。通过将单个针插入右前脑(坐标：相对于前囟门+0.2毫米，距中线+2.0毫米)用5μgα-突触核蛋白pff(2.5μl)靶向背部纹状体(在硬脑膜下方2.6mm)来单侧注射小鼠。使用10μl注射器(hamilton，nv)以0.4μl/分钟进行注射。6个月后，用pbs经心脏灌注小鼠，除去大脑并在70％乙醇在150mmnacl中的溶液(ph7.4)中过夜固定。[0597]抗体产生[0598]如前所述，针对用完全弗氏佐剂(0.05mgα-突触核蛋白/小鼠)乳化的超声处理的人类α-突触核蛋白pff产生鼠单克隆抗体(gibbons等人，2018年，neuropatholexpneurol77:216-228)，然后在初始注射后3周和6周用不完全弗氏佐剂乳化的0.025mgα-突触核蛋白随后加强注射(boost)2次。在初始抗原注射后九周，小鼠接受0.025mg/小鼠的静脉加强注射。在静脉注射4天后，将脾脏解离成单细胞悬液，并通过用50％聚乙二醇和5％dmso的混合物处理1分钟使脾脏与sp2细胞融合。在含有5.7μm氮丝氨酸-10；100μm次黄嘌呤(sigmacat#a9666)的培养基中选择杂交瘤细胞7天，并在补充有20％胎牛血清(fbs；atlantabiologicalcat#e0118)、100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素(gibcocat#15140-122)；2mml-谷氨酰胺(corningcat#25-005-cl)和opi培养基补充剂(1mmoxoloacetate、0.45mm丙酮酸、0.2u/ml胰岛素；sigmacat#05003)的kennett'shy(90％dmem、10％nctc135、4.15g/l葡萄糖、3.55g/lnahco3)中培养。通过在96孔板中限制稀释至0.3个细胞/孔来分离单克隆群。如下所述进一步表征抗体。扩增对病理性错误折叠的α-syn具有选择性的杂交瘤并亚克隆至少两次。[0599]表位图分析[0600]如先前所确立的，在大肠埃希杆菌中产生重组α-突触核蛋白构建体(volpicelli-daley等人，2014，natureprotocols9:2135-2146)。使用牛血清白蛋白作为标准品(thermofishercat#23210)，通过二辛可宁酸比色测定(fishercat#23223和23224)来确定每个样品中的总蛋白质浓度。在5-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶上使用相等的蛋白质负载(250ngα-突触核蛋白/孔)来分离蛋白质。将蛋白质转移到0.2μm硝酸纤维素膜上，并用一级抗体(1:1000)检测。使用irdye800(li-cor925-32210)或irdye680(li-cor925-68071)二级抗体来检测一级抗体，在li-corodyssey成像系统上扫描并使用imagestudio软件进行分析。[0601]原发性神经元免疫疗法测定[0602]使用先前描述的步骤的修改版本处理神经元(tran等人，2014，cellreports7:2054-2065)。在铺板后每三天喂食(feed)一次神经元，直到10div。此时，从每个孔中除去125μl培养基，并将无菌α-突触核蛋白抗体加入20μl新鲜神经元培养基中，在37℃下温育30分钟。将125μg新鲜的超声处理的pff加入另外的20μl神经元培养基中。如前所述(tran，等人，2014，cellreports7:2054-2065)，在1和4dpt喂食神经元并在转导后7天固定和染色。数据报告为归一化的ps129α-突触核蛋白面积除以neun计数。对于初始克隆选择，包括与α-突触核蛋白pff的摩尔比为1:1的抗体。为了更详细地表征高优先级克隆，包括摩尔比范围为2:1到0.0003:1(抗体：pff)的抗体。[0603]免疫细胞化学[0604]将原代神经元或细胞系培养物用4％多聚甲醛、4％蔗糖在磷酸盐缓冲盐水中固定，并在pbs中洗涤五次。如前所述进行神经元培养物的免疫染色(henderson等人，2018，actaneuropathologicacomm.6:45)。在室温下，将细胞在pbs中的3％bsa+0.3％tx-100中透化15分钟。在pbs洗涤后，用pbs中的3％bsa封闭细胞50分钟，然后在室温下与一级抗体一起温育2小时。使用的一级抗体靶向ps129α-突触核蛋白(81a，cndr，1:5,000)和neun(milliporecat#mab377，1:1,500)。将细胞用pbs洗涤5次，并在室温下与二级抗体一起温育1小时。在用pbs洗涤5次后，将细胞在pbs中的dapi(thermofishercat#d21490，1:10,000)中温育。96孔板在incellanalyzer2200(gehealthcare)上成像，并在随附的软件中进行分析。将基于强度的标准阈值应用于均等地跨过板的ps129α-突触核蛋白通道，并对阳性面积进行量化。对于neun量化，应用基于目标的分析来识别指定大小和强度的目标。所有量化都经过优化，并在所有条件下均等地应用。[0605]夹心elisa[0606]将384孔maxisorp透明板(thermofisherscientific，cat#12565347)用每孔30μl(50ng)抗体在taked包被缓冲液中的溶液包被，然后将板以1000xg旋转(spun)1分钟并在4℃下温育过夜。将板用pbst(含0.05％tween的pbs)洗涤4次，并使用blockace封闭溶液(每孔95μl)(abdserotec)在4℃下封闭过夜。从256μg/ml单体和25.6μg/ml原纤维开始，在缓冲液c(0.02m磷酸钠缓冲液、2mmedta、0.4mnacl、1％bsa、0.005％硫柳汞)中制备人野生型α-突触核蛋白原纤维和单体的连续双重稀释液。然后在稀释前对原纤维进行高超声处理，打开30秒、关闭30秒，循环10次(diagenodebiorupterucd-300浴超声仪)。将稀释液加入每个孔中(每孔30μl)并在4℃下温育过夜。将该板用pbst洗涤4次。将缓冲液c中的30μlmjf-r1(1:3,000，abcamcat#ab138501)加入每个孔中，并将板在37℃下温育4小时。在用pbst洗涤4次后，将1:10k稀释的山羊-抗兔igg-hrp缀合物(cellsignalingtechnology)加入板中，并将板在37℃下温育1小时。在用pbst洗涤4次后，使用每孔30μl室温1-stepultratmb-elisa底物溶液(thermofisherscientific，cat#34029)将板显色10-15分钟，并使用10％磷酸(每孔30μl)淬灭反应物。在spectramaxm5读板器(moleculardevices)上以384-450nm读取板。[0607]抗体纯化(少量制备)[0608]使用dynabead磁性系统(invitrogen，cat#10003d)纯化用于体外实验的少量抗体，每50ml上清液使用1ml蛋白a和1ml蛋白g珠子。珠子首先用pbs洗涤3次，在旋转器上洗涤10分钟。加入上清液并与珠子在室温下一起温育4小时或在4℃下过夜。除去上清液并将珠子用pbs洗涤3次。在30秒内将洗脱缓冲液(100mm甘氨酸，ph2.8)加入珠子中，并立即用1.5mtris-碱中和。除去缓冲溶液并放入50kd过滤eppendorf管中，并根据制造商的方案完成3次旋转的缓冲液交换。抗体以1mg/ml储存。[0609]抗体纯化(大量制备)[0610]对于杂交瘤上清液的大量制备，在aktapurefplc系统(gehealthcarelifesciences)上使用hitrapmabselectsure柱(gehealthcarelifesciences，cat#11003494)来纯化抗体。用0.2μm过滤器对上清液进行无菌过滤并加载到柱上。在洗涤后，用100mm甘氨酸、150mmnacl(ph3.0)洗脱抗体。将洗脱液立即用1mtris-碱(ph9.0)中和。uv迹线用于选择和汇集含有抗体的级分。使用amiconultra-1550k离心过滤器单元(milliporesigma，cat#ufc905024)浓缩抗体并透析到磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)中。然后用0.2μm过滤器对抗体进行无菌过滤，使用牛血清白蛋白作为标准品(thermofishercat#23210)，通过二辛可宁酸比色法测定(fishercat#23223和23224)来确定每个样品中的蛋白质浓度。将样品在15％sds-page凝胶上运行并进行考马斯染色，以确保存在重度和轻度变化以及蛋白质纯度。在从杂交瘤上清液中纯化后，将抗体冷冻在1ml等分试样中并储存在-20℃。[0611]体内抗体施用[0612]在临用前，将抗体解冻并保持在冰上直至施用。将小鼠称重并腹膜内施用抗体至终浓度为30mg/kg体重。在注射之间交替注射侧，并监测小鼠与注射有关的不良事件。[0613]纹状体多巴胺/dopac检测[0614]在经心灌注后，从大约前囟门和前囟门+1毫米之间的头端脑(rostralbrain)中取出1毫米冠状切片。从大脑的右侧(同侧)和左侧(对侧)手动解剖背部纹状体，并在干冰上快速冷冻，用于多巴胺(da)和二羟基苯乙酸(dopac)的液相色谱-质谱(lc-ms)分析。将冷冻组织悬浮在10μlmilli-q水/mg组织中，并使用15-20个短脉冲(qsonicamicrosontmxl-2000)在功率水平1.5下进行超声处理，直至溶液均匀。将裂解液短暂向下旋转(spundown)，并将30μl转移到含有30μl0.4m高氯酸的新试管中。将剩余的裂解物悬浮在含有蛋白酶抑制剂的2xripa缓冲液中，以测定蛋白质水平。将高氯酸盐样品在3000xg和4℃下旋转15分钟。将两体积的0.4m乙酸钠加入上清液中，并通过0.65μm过滤器进行旋转过滤。随后使用watersacquityuplc-tqdlc-ms系统对da和dopac进行定量。在35℃和0.4ml/min下，将10微升的每个样品注射到watersacquityhsst3，c18，1.8μm，2.1×100mm柱上。在注射后流动相b在0％b下保持1分钟，并在2到3分钟内从0％b梯度分离到25％b，然后进行洗涤和平衡步骤(a：0.1％(v/v)甲酸的水溶液；b：含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液)。使用多反应监测的特定碰撞诱导的离子跃迁(多巴胺，es+154》137；3,4-二氢苯乙酸，es-167》123)来检测化合物。使用watersqualynx软件针对同时分析的标准曲线(盐酸多巴胺(da)、sigmacat#h8502-5g；3,4-二氢苯乙酸(dopac)、sigmacat#850217-1g)对峰面积进行定量，并归一化至总蛋白水平。[0615]免疫组织化学[0616]在灌注和固定后，将大脑嵌入石蜡块中，切成6μm切片，并安装在载玻片上。然后使用如本文其他地方所述的标准免疫组织化学对载玻片进行染色。载玻片在二甲苯中连续洗涤2次，各5分钟，然后在递减的乙醇系列中洗涤1分钟：100％、100％、95％、80％、70％。然后将载玻片在去离子水中温育1分钟，然后如所述进行抗原修复。在抗原修复后，将载玻片在5％过氧化氢的甲醇溶液中温育，以淬灭内源性过氧化物酶活性。载玻片在自来水中洗涤10分钟，在0.1mtris中洗涤5分钟，然后在0.1mtris/2％胎牛血清(fbs)中封闭。载玻片在一级抗体中温育过夜。使用了以下一级抗体。对于错误折叠的α-突触核蛋白，使用最终浓度0.4ug/ml的syn506以及微波抗原修复(95℃15分钟，使用基于柠檬酸的抗原暴露溶液(载体h-3300)。为了对中脑多巴胺能神经元进行染色，酪氨酸羟化酶(th-16；sigma-aldricht2928，rrid:ab_477569)以1：5,000的比例用于甲酸抗原修复。[0617]将一级抗体用0.1mtris洗涤5分钟，然后与山羊抗兔(载体ba1000，rrid:ab_2313606)或马抗小鼠(载体ba2000，rrid:ab_2313581)生物素化的igg在0.1mtris/2％fbs1:1000中的溶液中一起温育1小时。用0.1mtris洗涤生物素化的抗体5分钟，然后与抗生物素蛋白-生物素溶液(载体pk-6100，rrid:ab_2336819)一起温育1小时。然后用0.1mtris洗涤载玻片5分钟，然后用immpactdab过氧化物酶底物(载体sk-4105，rrid:ab_2336520)显色，并用harrishematoxylin(fisher67-650-01)短暂复染。将载玻片在自来水中洗涤5分钟，在递增的乙醇中分别脱水1分钟：70％、80％、95％、100％、100％，然后在二甲苯中洗涤两次，各5分钟，并且然后在cytosealmountingmedia(fisher23-244-256)中盖上盖玻片。然后将数字化载玻片用于定量病理特征。[0618]定量组织学[0619]为了测定与路易体α-突触核蛋白结合的抗体，将未稀释的杂交瘤上清液或在pbs中1：3稀释的上清液直接加入具有丰富路易体的人杏仁核组织切片中。组织在dab试剂中平行处理和显影。然后使用来自每片组织的类似的1mm2切片来测定抗体优先结合路易体的能力。染色强度被手动阈值化以仅突出对抗体治疗视而不见的路易体并分析平均光密度。然后使用标准化截止值测定整个切片的平均光密度。计算路易体染色的平均光密度除以组织片的平均光密度，并以路易体鉴别指数报告。[0620]对于小鼠，所有切片选择、注释和量化都是在对治疗组不知情的情况下进行的。所有定量均在halo定量病理特征软件(indicalabs)中进行。将每10个通过中脑的载玻片用酪氨酸羟化酶(th)染色。th染色切片用于注释sn，并所有切片均以盲法手动进行细胞计数。所有切片的总和乘以10以估计通过计算每个切片获得的总计数。然后将绘制在th染色切片上的sn注释转移到已针对错误折叠的α-突触核蛋白(syn506)染色的连续切片。杏仁核区域也在通过杏仁核长度的每10个切片上进行注释。然后将单一分析算法同等地应用于所有染色切片，以量化syn506染色所占面积的百分比。具体来说，分析包括所有高于0.157光密度阈值的dab信号，根据经验确定该dab信号不包括任何背景信号。然后将该信号归一化至总组织面积。使用0.02的最小组织光密度来排除组织分裂的任何区域。[0621]抗体测序[0622]按照reagent的技术手册从杂交瘤细胞中分离总rna。然后按照primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总rna逆转录为cdna。重链和轻链抗体片段按照genscript的cdna末端快速扩增(race)标准操作程序(sop)进行扩增。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落pcr以筛选具有正确大小插入片段(insert)的克隆。共有序列在本文其他地方提供。[0623]统计分析[0624]所有统计分析均在graphpadprism7中完成。用于每个数据集的分析在图例中进行了描述。每个图例中都注明了样本数(n)。对于原代神经元实验，n代表被分析的独立孔的数量。对于体内实验，n代表小鼠的数量。[0625]实施例1：[0626]考虑泛α-突触核蛋白抗体可具有作为pd治疗方法的责任。例如，关于降低大脑中的整体α-突触核蛋白水平是否会对神经元功能有害，存在相互矛盾的数据。红细胞中丰富的α-突触核蛋白也增加了泛α-突触核蛋白抗体可能在血液中引起靶向副作用的可能性，因为血液中的抗体浓度大约是大脑中的1000倍。此外，血清α-突触核蛋白可以作为泛α-突触核蛋白抗体的汇点(sink)，从而减少与大脑中预期靶标的接触。[0627]因此，本研究部分涉及对致病性错误折叠的α-突触核蛋白具有高度选择性的e抗体的鉴定。为了开发这些抗体，首先用由重组人类α-突触核蛋白形成的错误折叠的α-突触核蛋白预制原纤维(pff)免疫小鼠(图1a)。小鼠对α-突触核蛋白pff免疫原产生免疫反应，并收获产生抗体的b细胞并与骨髓瘤细胞融合以生成产生抗体的杂交瘤细胞(图1b)。通过有限稀释来分离单克隆杂交瘤，并在若干测定中测试来自这些克隆的含有抗体的上清液以确定哪些杂交瘤克隆产生具有优选特性的抗体(图1c)。候选抗体被进一步亚克隆以确保单克隆性(图1d)，通过筛选确认抗体特性以确保特性保留(图1e)。在检查来自不同筛选测定的结果后，选择非限制性候选抗体用于在pd的体内模型中进行功效测试(图1f)，在该模型中将其与先前表征的免疫疗法抗体进行比较。[0628]实施例2：免疫组织化学显示优先结合lb的抗体[0629]在非限制性方面，某些感兴趣的抗体对错误折叠的lbα-突触核蛋白比对单体α-突触核蛋白具有更高的结合优先性。为了快速筛选对病理性α-突触核蛋白的抗体选择性，对具有丰富lb病理的pd患者的杏仁核切片进行免疫染色。在筛选载玻片上使用未稀释的或以1:3稀释的杂交瘤上清液，平行处理以允许直接比较免疫染色。大多数测试的抗体显示出与神经细胞中的正常突触α-突触核蛋白结合的优先性(图2a)。获得了lb鉴别指数(lb的光密度/所有组织的光密度)以更好地比较抗体与lb在神经纤维池上的相对结合(图2b)。值为1表示lb与正常突触神经细胞染色没有区别。虽然大多数抗体对lb具有优先性，但建立了1.5的截止值，以除去对lb显示相对非选择性染色的抗体，无需进一步考虑。[0630]实施例3：表位图分析确保优选抗体识别人和小鼠α-突触核蛋白[0631]虽然选定的免疫治疗抗体原则上可用于人类，但本研究在某些非限制性实施方式中鉴定了可识别小鼠和人类α-突触核蛋白的抗体，以允许在小鼠原代神经元和野生型pd小鼠模型中进一步表征。通过蛋白质印迹分析抗体以确定它们是否与人和小鼠α-突触核蛋白结合(图3a-3c)。还平行分析了多种截短形式的人类α-突触核蛋白(图3a)以确定α-突触核蛋白内被每种抗体识别的表位。所有抗体都识别α-突触核蛋白的免疫原性c端的某些部分，其中大部分识别远处的c端氨基酸(120-140；图3b)。另一大组抗体识别稍多的内部表位(110-120)，并且只有少数抗体识别更接近于α-突触核蛋白的易聚集nac(阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白结构域(残基61-95)的非aβ成分)的区域(图3c)。尽管每个表位类别中的抗体实例显示优先结合人类α-突触核蛋白，但是大多数抗体识别小鼠和人类α-突触核蛋白。只有两种抗体显示与β-突触核蛋白的交叉反应性(图10)。[0632]实施例4：夹心elisa鉴定对错误折叠的α-突触核蛋白具有优先性的抗体[0633]通过以夹心elisa形式评估抗体与单体人类α-突触核蛋白和α-突触核蛋白pff结合的能力，对抗体的选择性进行了进一步的测试，该抗体通过免疫组织化学显示对人体组织中lb的选择性并识别人和小鼠α-突触核蛋白二者。该测定通过允许溶液中的α-突触核蛋白与固定化抗体结合来保留α-突触核蛋白的构象，并允许进行广泛的亲和力检测。将感兴趣的抗体包被在elisa板上，并将α-突触核蛋白单体或pff与抗体以增加的α-突触核蛋白浓度温育以确定抗体对每种形式的α-突触核蛋白的相对亲和力。先前表征的syn211抗体(giasson等人，2000，j.neurosci.res.59:528-533)也包被在每个板上作为非选择性抗体对照。使用单克隆抗体(mjf-r1、abcam、cat#138501)和山羊抗兔igg-hrp缀合物检测结合的α-突触核蛋白。[0634]捕获抗体可以几乎均匀地分为三类：17种未结合的(图4a和11)、18种非选择性的(图4b和12)、19种pff选择性的(图4c和13)。不希望受到任何理论的限制，因为几乎所有的未结合抗体都与lb病理特征结合并通过免疫印迹检测到α-突触核蛋白，夹心elisa中缺乏活性可能表明固定在elisa板孔上影响了它们捕获α-突触核蛋白的能力。[0635]通过用s型剂量曲线拟合吸光度值来计算每种抗体的ec50值。然后使用以下等式计算每种抗体的pff优先性值，syn211作为非选择性对照：[0636][0637]值总结在表1中。为了证实表观构象选择性不是由于导致α-突触核蛋白单体的检测减少的捕获抗体和检测抗体之间的共享表位引起的，使用替代的多克隆检测抗体snl4通过夹心elisa评估了四种最具选择性的抗体(图14)。该测定证实了α-突触核蛋白抗体的构象选择性。[0638]实施例5：原发性神经元免疫治疗测定揭示了α-突触核蛋白抗体预防lb样病理特征的不同功效[0639]虽然抗体的内在特性很重要，但是研究了抗体预防诱导α-突触核蛋白病理特征的能力，这是治疗成功的关键特性。为了实现这一点，开发了一种神经元免疫疗法测定法，以允许以高含量形式与α-突触核蛋白pff共同治疗抗体。在培养10天后，用纯化的感兴趣抗体处理神经元。30分钟后，用人类α-突触核蛋白pff处理神经元，将内源性小鼠α-突触核蛋白募集到lb和ln样包涵体中。7天后固定神经元并测定病理性ps129α-突触核蛋白和神经元数量(neun；图5a)。抗体在该测定中显示出广泛的功效，其中41种抗体中的22种导致病理特征减少超过75％(图5b)。性能最高的抗体syn9048可显著减少97％的病理特征。[0640]在多种测定中对α-突触核蛋白抗体的透彻表征允许人们定量比较抗体并选择有利的抗体用于亚克隆和进一步筛选(图6a-6b)。在某些实施方式中，某些感兴趣的抗体识别小鼠和人类α-突触核蛋白两者，优先结合人体组织中的lb，对错误折叠的α-突触核蛋白表现出比对单体α-突触核蛋白更大的亲和力，并减少原代神经元中的pff接种的α-突触核蛋白病理特征。基于这些标准，选择了两种抗体(syn9063和syn9048)用于亚克隆、大规模生产和体内测试。[0641]实施例6：亚克隆保留亲本克隆的特性[0642]所选抗体的关键特征之一是它们对错误折叠的α-突触核蛋白的优先性。因此，在夹心elisa平台中分析来自syn9063和syn9048杂交瘤的另外的亚克隆期间衍生的克隆的上清液，以鉴定产生所需抗体的克隆。除了一个syn9063亚克隆外，所有亚克隆都显示出与亲本克隆相似的对α-突触核蛋白pff的优先性(图7a)。然而，在克隆扩增后，syn9063亚克隆具有非常低的抗体产量，无法在体内使用，在体内需要更多的抗体量。所有syn9048克隆都显示出对α-突触核蛋白pff的高选择性(图7b)，并且由于从滚培养(rollerculture)中获得的高抗体产量，克隆#3被用于进一步研究。[0643]为了进一步了解有效抑制α-突触核蛋白病理诱导所必需的抗体浓度，将纯化的syn9048稀释到几个对数浓度，并在如上所述的人类α-突触核蛋白pff接种的原代海马神经元测定中进行评估。syn9048以剂量依赖性方式降低神经元α-突触核蛋白病理特征，抗体：α-突触核蛋白摩尔比ic50为0.006(1：166)(图7c-7d)。syn9048在0.03或更高的摩尔比下显示出几乎完全抑制α-突触核蛋白病理特征，这表明每33个α-突触核蛋白单体单元中只有一种抗体足以完全抑制神经元中的α-突触核蛋白接种。syn9048还能够减少由小鼠α-突触核蛋白pff诱导的α-突触核蛋白病理，具有相似的ic50(图15)，表明它适用于在pd的非转基因小鼠模型中进行测试。[0644]实施例7：体内免疫疗法耐受性良好并改善多巴胺能张力[0645]已经在动物模型中测试了几种α-突触核蛋白抗体预防pd样病理特征的能力。然而，在没有前驱疾病生物标志物的情况下，患有神经退行性疾病的患者不太可能在脑部病理特征已经确定的疾病症状阶段之前接受免疫治疗。[0646]因此，测试了syn9048在病理特征开始后减轻病理特征和挽救神经元功能的功效。采用了先前建立的α-突触核蛋白病理诱导和传递模型(luk等人，2012，science338:949-953)，其中在背部纹状体中向2-3个月大的非转基因小鼠注射5μgα-突触核蛋白pff。在用抗体治疗之前，允许小鼠1周以使bbb恢复，并让神经元吸收致病性α-突触核蛋白并诱导病理特征。然后小鼠接受syn9048或同种型对照抗体治疗(30mg/kg，腹膜内)，每周一次，持续6个月(图8a，16只小鼠/组)。另一组小鼠用比较抗体syn303治疗，该抗体之前已针对体内免疫治疗模型进行了验证(tran等人，2014，cellreports7:2054-2065)。在纹状体内pff注射后抗体给药延迟一周旨在最大限度地减少对神经元中初始pff接种的抑制。在某些实施方式中，由病理特征扩散引起的继发性α-突触核蛋白病理特征形成位点受抗体治疗的影响最大。在研究过程中，所有三组小鼠的体重都稳步增加，这表明被动免疫疗法耐受性良好(图8b)。[0647]黑质(sn)中的多巴胺能神经元损失是pd的主要特征，并在pff注射小鼠模型中得到概括(henderson等人，2019，natureneuroscience22:1248-1257；luk等人，2012，science338:949-953)(图8c)。igg1处理的小鼠在注射部位同侧具有显著的酪氨酸羟化酶(th)阳性神经元损失，并且该神经元损失未被syn303或syn9048治疗消除(图8d-8e)。多巴胺能神经元损失与这些细胞与注射部位有直接联系是一致的，使得在pff注射后一周的抗体治疗预期不会阻止这些神经元中病理特征的开始。响应于pff注射，背部纹状体中的多巴胺能张力也降低(图8f)。有点令人惊讶的是，syn9048而非syn303能够挽救纹状体多巴胺和dopac的损失(图8f-8g)。因此，虽然神经元仍然丢失，但syn9048治疗可改善剩余神经元的功能，这可能是由于α-突触核蛋白病理特征的减少。[0648]实施例8：syn9048减少sn和杏仁核中的α-突触核蛋白病理特征[0649]为了更好地理解被动免疫疗法后小鼠中α-突触核蛋白的病理特征如何改变，对sn(图9a-9c)和杏仁核(图9d-9f)中错误折叠的α-突触核蛋白(syn506)进行定量病理特征。尽管只有syn9048在同侧sn中的减少是统计学显著的，但是syn303和syn9048减少了注射部位sn对侧(图9b)和同侧(图9c)中的平均病理特征。与同侧杏仁核(图9f)相比，对侧杏仁核(图9e)的病理特征减少也更明显，并且在syn9048治疗的动物中比用syn303治疗的动物更明显。只有syn9048在对侧杏仁核中的减少具有统计学意义。虽然syn9048对同侧sn病理特征的减少适度，但是可以解释纹状体多巴胺和dopac水平的改善。此外，抗体治疗对对侧α-突触核蛋白病理特征的更大影响表明在细胞外α-突触核蛋白扩散负责病理诱导的部位疗效更高。[0650]表1：测量值汇总[0651][0652][0653][0654]nb＝未结合[0655]列举的实施方式[0656]提供了以下示例性实施方式，其编号不应被解释为指定重要性级别：[0657]实施方式1提供了一种分离的单克隆抗体，其包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，[0658]其中所述vl包括：[0659]cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114、126、185、213或240的氨基酸序列；[0660]cdr2区，其包括seqidno：29、72、116、214或242的氨基酸序列；和[0661]cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129、152、205、216或244的氨基酸序列；[0662]并且其中所述vh包括：[0663]cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101、144、160或226的氨基酸序列；[0664]cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134、145、161、200或228的氨基酸序列；和[0665]cdr3区，其包括seqidno：15、62、81、147、163、194、201或230的氨基酸序列。[0666]实施方式2提供了实施方式1所述的单克隆抗体，[0667]其中所述vl包括：[0668]cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114或126的氨基酸序列；[0669]cdr2区，其包括seqidno：29、72或116的氨基酸序列；和[0670]cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129或152的氨基酸序列；[0671]并且其中所述vh包括：[0672]cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101或144的氨基酸序列；[0673]cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134或145的氨基酸序列；和[0674]cdr3区，其包括seqidno：15、62、81或147的氨基酸序列。[0675]实施方式3提供了实施方式1所述的单克隆抗体，[0676]其中所述vl包括：[0677]cdr1区，其包括seqidno：70、185、213或240的氨基酸序列；[0678]cdr2区，其包括seqidno：29、72、214或242的氨基酸序列；和[0679]cdr3区，其包括seqidno：152、129、205、216或244的氨基酸序列；[0680]并且其中所述vh包括：[0681]cdr1区，其包括seqidno：160、58或226的氨基酸序列；[0682]cdr2区，其包括seqidno：161、145、200或228的氨基酸序列；和[0683]cdr3区，其包括seqidno：163、194、201或230的氨基酸序列。[0684]实施方式4提供了实施方式1-3中任一项所述的单克隆抗体，其中至少一种适用：[0685](a)所述vl包括：[0686]cdr1区，其包括seqidno：27的氨基酸序列；[0687]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0688]cdr3区，其包括seqidno：31的氨基酸序列；[0689]并且所述vh包括：[0690]cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；[0691]cdr2区，其包括seqidno：13的氨基酸序列；和[0692]cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列；[0693](b)所述vl包括：[0694]cdr1区，其包括seqidno：46的氨基酸序列；[0695]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0696]cdr3区，其包括seqidno：31的氨基酸序列；[0697]并且所述vh包括：[0698]cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；[0699]cdr2区，其包括seqidno：40的氨基酸序列；和[0700]cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列；[0701](c)所述vl包括：[0702]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0703]cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和[0704]cdr3区，其包括seqidno：85的氨基酸序列；[0705]并且所述vh包括：[0706]cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；[0707]cdr2区，其包括seqidno：60的氨基酸序列；和[0708]cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列；[0709](d)所述vl包括：[0710]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0711]cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和[0712]cdr3区，其包括seqidno：85的氨基酸序列；[0713]并且所述vh包括：[0714]cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；[0715]cdr2区，其包括seqidno：60的氨基酸序列；和[0716]cdr3区，其包括seqidno：81的氨基酸序列；[0717](e)所述vl包括：[0718]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0719]cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和[0720]cdr3区，其包括seqidno：85的氨基酸序列；[0721]并且所述vh包括：[0722]cdr1区，其包括seqidno：92的氨基酸序列；[0723]cdr2区，其包括seqidno：93的氨基酸序列；和[0724]cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列；[0725](f)所述vl包括：[0726]cdr1区，其包括seqidno：114的氨基酸序列；[0727]cdr2区，其包括seqidno：116的氨基酸序列；和[0728]cdr3区，其包括seqidno：118的氨基酸序列；[0729]并且所述vh包括：[0730]cdr1区，其包括seqidno：101的氨基酸序列；[0731]cdr2区，其包括seqidno：102的氨基酸序列；和[0732]cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列；[0733](g)所述vl包括：[0734]cdr1区，其包括seqidno：126的氨基酸序列；[0735]cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和[0736]cdr3区，其包括seqidno：129的氨基酸序列；[0737]并且所述vh包括：[0738]cdr1区，其包括seqidno：101的氨基酸序列；[0739]cdr2区，其包括seqidno：102的氨基酸序列；和[0740]cdr3区，其包括seqidno：62的氨基酸序列；[0741](h)所述vl包括：[0742]cdr1区，其包括seqidno：46的氨基酸序列；[0743]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0744]cdr3区，其包括seqidno：31的氨基酸序列；[0745]并且所述vh包括：[0746]cdr1区，其包括seqidno：11的氨基酸序列；[0747]cdr2区，其包括seqidno：134的氨基酸序列；和[0748]cdr3区，其包括seqidno：15的氨基酸序列；[0749](i)所述vl包括：[0750]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0751]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0752]cdr3区，其包括seqidno：152的氨基酸序列；[0753]并且所述vh包括：[0754]cdr1区，其包括seqidno：144的氨基酸序列；[0755]cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和[0756]cdr3区，其包括seqidno：147的氨基酸序列；[0757](j)所述vl包括：[0758]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0759]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0760]cdr3区，其包括seqidno：152的氨基酸序列；[0761]并且所述vh包括：[0762]cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；[0763]cdr2区，其包括seqidno：161的氨基酸序列；和[0764]cdr3区，其包括seqidno：163的氨基酸序列；[0765](k)所述vl包括：[0766]cdr1区，其包括seqidno：185的氨基酸序列；[0767]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0768]cdr3区，其包括seqidno：129的氨基酸序列；[0769]并且所述vh包括：[0770]cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；[0771]cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和[0772]cdr3区，其包括seqidno：163的氨基酸序列；[0773](l)所述vl包括：[0774]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0775]cdr2区，其包括seqidno：29的氨基酸序列；和[0776]cdr3区，其包括seqidno：152的氨基酸序列；[0777]并且所述vh包括：[0778]cdr1区，其包括seqidno：160的氨基酸序列；[0779]cdr2区，其包括seqidno：145的氨基酸序列；和[0780]cdr3区，其包括seqidno：194的氨基酸序列；[0781](m)所述vl包括：[0782]cdr1区，其包括seqidno：70的氨基酸序列；[0783]cdr2区，其包括seqidno：72的氨基酸序列；和[0784]cdr3区，其包括seqidno：205的氨基酸序列；[0785]并且所述vh包括：[0786]cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；[0787]cdr2区，其包括seqidno：200的氨基酸序列；和[0788]cdr3区，其包括seqidno：201的氨基酸序列；[0789](n)所述vl包括：[0790]cdr1区，其包括seqidno：213的氨基酸序列；[0791]cdr2区，其包括seqidno：214的氨基酸序列；和[0792]cdr3区，其包括seqidno：216的氨基酸序列；[0793]并且所述vh包括：[0794]cdr1区，其包括seqidno：58的氨基酸序列；[0795]cdr2区，其包括seqidno：200的氨基酸序列；和[0796]cdr3区，其包括seqidno：201的氨基酸序列；[0797](o)所述vl包括：[0798]cdr1区，其包括seqidno：240的氨基酸序列；[0799]cdr2区，其包括seqidno：242的氨基酸序列；和[0800]cdr3区，其包括seqidno：244的氨基酸序列；[0801]并且所述vh包括：[0802]cdr1区，其包括seqidno：226的氨基酸序列；[0803]cdr2区，其包括seqidno：228的氨基酸序列；和[0804]cdr3区，其包括seqidno：230的氨基酸序列。[0805]实施方式5提供了实施方式1-4中任一项所述的单克隆抗体，[0806]其中所述vl包括以下氨基酸序列：[0807]seqidno：27-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0808]seqidno：46-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0809]seqidno：70-seqidno：71-seqidno：72-seqidno：73-seqidno：85，[0810]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：151-seqidno：152，[0811]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：172-seqidno：152，[0812]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：204-seqidno：205，[0813]seqidno：114-seqidno：115-seqidno：116-seqidno：117-seqidno：118，[0814]seqidno：126-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：128-seqidno：129，[0815]seqidno：185-seqidno：186-seqidno：29-seqidno：187-seqidno：129，[0816]seqidno：213-seqidno：115-seqidno：214-seqidno：215-seqidno：216，或[0817]seqidno：240-seqidno：241-seqidno：242-seqidno：243-seqidno：244，[0818]并且其中所述vh包括以下氨基酸序列：[0819]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：13-seqidno：14-seqidno：15，[0820]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：40-seqidno：41-seqidno：15，[0821]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：134-seqidno：135-seqidno：15，[0822]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：61-seqidno：62，[0823]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：80-seqidno：81，[0824]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：200-seqidno：94-seqidno：201，[0825]seqidno：92-seqidno：59-seqidno：93-seqidno：94-seqidno：62，[0826]seqidno：101-seqidno：59-seqidno：102-seqidno：103-seqidno：62，[0827]seqidno：144-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：146-seqidno：147，[0828]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：177-seqidno：163，[0829]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：193-seqidno：194，[0830]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：161-seqidno：162-seqidno：163，或[0831]seqidno：226-seqidno：227-seqidno：228-seqidno：229-seqidno：230。[0832]实施方式6提供了实施方式1-5中任一项所述的单克隆抗体，[0833]其中所述vl包括以下氨基酸序列：[0834]seqidno：27-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0835]seqidno：46-seqidno：28-seqidno：29-seqidno：30-seqidno：31，[0836]seqidno：70-seqidno：71-seqidno：72-seqidno：73-seqidno：85，[0837]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：151-seqidno：152，[0838]seqidno：114-seqidno：115-seqidno：116-seqidno：117-seqidno：118，或[0839]seqidno：126-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：128-seqidno：129；[0840]并且其中所述vh包括以下氨基酸序列：[0841]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：13-seqidno：14-seqidno：15，[0842]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：40-seqidno：41-seqidno：15，[0843]seqidno：11-seqidno：12-seqidno：134-seqidno：135-seqidno：15，[0844]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：61-seqidno：62，[0845]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：60-seqidno：80-seqidno：81，[0846]seqidno：92-seqidno：59-seqidno：93-seqidno：94-seqidno：62，[0847]seqidno：101-seqidno：59-seqidno：102-seqidno：103-seqidno：62，或[0848]seqidno：144-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：146-seqidno：147。[0849]实施方式7提供了实施方式1-5中任一项所述的单克隆抗体，[0850]其中所述vl包括以下氨基酸序列：[0851]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：29-seqidno：172-seqidno：152，[0852]seqidno：70-seqidno：127-seqidno：72-seqidno：204-seqidno：205，[0853]seqidno：185-seqidno：186-seqidno：29-seqidno：187-seqidno：129，[0854]seqidno：213-seqidno：115-seqidno：214-seqidno：215-seqidno：216，或[0855]seqidno：240-seqidno：241-seqidno：242-seqidno：243-seqidno：244。[0856]并且其中所述vh包括以下氨基酸序列：[0857]seqidno：58-seqidno：59-seqidno：200-seqidno：94-seqidno：201，[0858]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：177-seqidno：163，[0859]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：145-seqidno：193-seqidno：194，[0860]seqidno：160-seqidno：59-seqidno：161-seqidno：162-seqidno：163，或[0861]seqidno：226-seqidno：227-seqidno：228-seqidno：229-seqidno：230。[0862]实施方式8提供了实施方式1-7中任一项所述的单克隆抗体，其是人源化的。[0863]实施方式9提供了实施方式1-8中任一项所述的单克隆抗体，其是被标记的。[0864]实施方式10提供了一种药物组合物，其包括实施方式1-9中任一项所述的单克隆抗体和至少一种药物赋形剂。[0865]实施方式11提供了一种分离的多核苷酸，其包括seqidno：3、5、7、19、21、23、35、43、44、50、52、54、66、68、75、77、88、89、96、97、99、106、108、110、121、132、138、139、141、148、150、155、157、167、168、170、175、180、191、195、197、198、203、207、209、211、219、221、223、233、235和237中的核酸序列中的至少一个。[0866]实施方式12提供了实施方式11所述的分离的多核苷酸，其包括：[0867]选自seqidno：3、5、7、35、50、52、54、75、77、88、89、97、99、132、138、139、141、155、157、175、191、197、198、219、221和223至少一种核酸序列；和[0868]选自seqidno：19、21、23、43、44、66、68、96、106、108、110、121、148、150、167、168、170、180、195、203、207、209、211、233、235和237的至少一种核酸序列。[0869]实施方式13提供了实施方式11-12中任一项所述的分离的多核苷酸，其包括：[0870]选自下列的至少一个核酸序列组：[0871]seqidno：3、5、7；seqidno：3、35、7；seqidno：3、132、7；seqidno：50、52、54；seqidno：50、75、77；seqidno：50、139、175；seqidno：50、139、191；seqidno：50、155、157；seqidno：50、197、198；seqidno：88、89、54；seqidno：97、99、54；seqidno：138、139、141；和seqidno：219、221、223；和[0872]选自下列的至少一个核酸序列组：[0873]seqidno：19、21、23；seqidno：19、43、44；seqidno：19、66、68；seqidno：19、66、96；seqidno：19、66、203；seqidno：19、148、150；seqidno：106、108、110；seqidno：121、66、68；seqidno：167、168、170；seqidno：167、168、195；seqidno：180、168、68；seqidno：213、214、216；和seqidno：233、235、237。[0874]实施方式14提供了一种在有需要的受试者中治疗、改善和/或预防突触核疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种的实施方式1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体。[0875]实施方式15提供了实施方式14所述的方法，其中所述突触核疾病是选自下列的至少一种：帕金森氏病、帕金森氏病伴痴呆、路易体痴呆、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、多系统萎缩、朊病毒疾病和其他α-syn相关的神经退行性疾病。[0876]实施方式16提供了实施方式14-15中任一项所述的方法，其中所述抗体作为药物组合物提供给所述受试者。[0877]实施方式17提供了实施方式14-16中任一项所述的方法，其中所述抗体经肠胃外施用至所述受试者。[0878]实施方式18提供一种检测受试者中的突触核疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种标记的实施方式1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体，并检测所述标记的分离的单克隆抗体与受试者中存在的任何α-syn原纤维、寡聚物和/或其他错误折叠的α-syn种类的复合物的存在或不存在，其中，如果检测到所述复合物，则所述受试者患有突触核疾病。[0879]实施方式19提供了一种检测样品中总α-syn、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类的方法，所述方法包括使所述样品与至少一种标记的实施方式1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体接触，并检测所述标记的分离的单克隆抗体与所述样品中存在的总α-syn、α-syn单体、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类的复合物的存在或不存在，其中，如果检测到该复合物，则所述样品中存在总α-syn、α-syn单体、α-syn原纤维和/或α-syn寡聚种类。[0880]实施方式20提供了实施方式19所述的方法，其中所述样品包括体外和/或离体样品。[0881]实施方式21提供了一种自主复制或整合的哺乳动物细胞载体，其包括编码抗体的重组核酸，所述抗体包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，[0882]其中所述vl包括：[0883]cdr1区，其包括seqidno：27、46、70、114、126、185、213或240的氨基酸序列；[0884]cdr2区，其包括seqidno：29、72、116、214或242的氨基酸序列；和[0885]cdr3区，其包括seqidno：31、85、118、129、152、205、216或244的氨基酸序列；[0886]并且其中所述vh包括：[0887]cdr1区，其包括seqidno：11、58、92、101、144、160或226的氨基酸序列；[0888]cdr2区，其包括seqidno：13、40、60、93、102、134、145、161、200或228的氨基酸序列；和[0889]cdr3区，其包括seqidno：15、62、81、147、163、194、201或230的氨基酸序列。[0890]实施方式22提供了实施方式21所述的细胞载体，其包括质粒或病毒。[0891]实施方式23提供了实施方式21-22中任一项所述的细胞载体，其包括哺乳动物细胞表达载体。[0892]实施方式24提供了实施方式21-23中任一项所述的细胞载体，进一步包括至少一种指导和/或控制所述抗体的表达的核酸序列。[0893]实施方式25提供了一种分离的宿主细胞，其包括至少一种实施方式21-24中任一项所述的载体。[0894]实施方式26提供了实施方式25所述的宿主细胞，其是非人类细胞。[0895]实施方式27提供了实施方式25-26中任一项所述的细胞载体，其是哺乳动物的。[0896]本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用以其整体并入本文。[0897]尽管已经参考具体实施方式公开了本公开内容，但显然本领域的其他技术人员可以设计出本公开内容的其他实施方式和变型而不背离本公开内容的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等效变型。当前第1页12当前第1页12









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