包含固有无序区域的生化反应方法和试剂与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及实施生化反应的方法，如在水性体外(in vitro)反应系统中。所述方法涉及包含一个或多个功能性固有无序区域(functional intrinsically disordered region，idr)的大分子，特别是多肽。本发明还涉及idr-大分子，包括idr-多肽，包括包含标记的氨基酸序列的大分子或多肽，所述标记的氨基酸序列包含一个或多个功能性idr或由一个或多个功能性idr组成。此类功能性idr能够提高生化反应的效率。本发明涉及包含任何此类大分子和多肽的试剂盒。本发明还涉及使用任何此类大分子和多肽来促进或增强溶液中液-液分层的方法，包括结合多价金属离子，从而提供能够提高生化反应的效率的试剂。背景技术：2.生化反应的性能，并且特别是体外生化反应，在生物科学中具有根本重要性。许多生化反应可能需要在实验室外实施，如在护理点或现场。在这些环境中，可能无法以由实验室环境提供的精确方式控制生化反应。提高在这些环境中实施的生化反应的效率将是有价值的。实际上，无论精确设置如何，都可能需要提高生化反应(包括体外和体内生化反应)的效率。本发明解决了这些问题。3.许多生化反应需要使用辅助因子以帮助驱动实施效率。此类辅因子的一个具体示例为大分子拥挤剂(macromolecular crowding agent)。拥挤剂(crowding agent)对于许多生化反应的性能是必需的。一个值得注意的示例是用于核酸的扩增的重组酶聚合酶扩增(rpa)系统。拥挤剂的使用被认为是驱动rpa实施效率的关键。然而，拥挤剂可能具有缺点。因此，用于驱动生化反应(包括rpa)的实施效率并且避免对添加的/外源性拥挤剂的需求的可替代方式，将是有用的。此外，增添或协同拥挤剂的功能性效果的试剂在提高生化反应的实施效率方面将是有用的。本发明也解决了这些问题。技术实现要素：4.本发明提供了一种在水性体外反应系统中实施生化反应的方法，其中，所述生化反应取决于至少一种反应大分子的功能，任选地至少一种反应多肽的功能，所述方法包括：在适于实施所述反应的条件下将至少一种idr-大分子引入所述体外反应系统，其中，所述至少一种idr-大分子包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)，其中，在将所述至少一种idr-大分子引入所述体外反应系统后，所述生化反应的效率通过所述至少一种idr-大分子而提高；优选地其中，所述至少一种idr-大分子为至少一种idr-多肽。5.在上述方法中，所述生化反应可以取决于所述至少一种idr-大分子的功能，任选地所述至少一种idr-多肽的功能，其中，在将其引入体外反应系统后，所述至少一种idr-大分子或所述至少一种idr-多肽在所述生化反应中实施其反应功能并且提高反应的效率。6.本文描述的任何方法还可以包括：维持所述系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽以使液-液分层并且通过所述idr-大分子或所述idr-多肽在所述系统内形成多个相分离的水性隔室(aqueous compartment)，从而提高所述系统中生化反应的效率。7.本文描述的任何方法还可以包括：维持所述系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽以使实施所述反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，或者进一步促进或增强实施所述反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽的共定位，从而提高所述系统中生化反应的效率。8.在本文描述的任何方法中，所述多个相分离的水性隔室可以是多个可检测的相分离的水性颗粒。9.在另一个方面，本发明提供了一种在水性体外反应系统中实施生化反应的方法，其中，所述生化反应取决于至少一种反应大分子的功能，任选地至少一种反应多肽的功能，所述方法包括：在适于实施反应的条件下将至少一种用氨基酸序列标记的多肽(idr-多肽)引入所述体外反应系统，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成；并且维持所述系统中的所述idr-多肽以导致液-液分层并且通过所述idr-多肽在所述系统内形成多个相分离的水性隔室，优选可检测的(detectible)相分离的水性颗粒，并且使实施所述反应所必需的分子与所述隔室中的所述idr-多肽共定位，从而提高所述系统中生化反应的效率。10.任选地，在根据该另一个方面的方法中，所述生化反应取决于至少一种反应多肽的功能，其中，所述反应多肽为所述至少一种idr-多肽，其中，在引入所述系统后，所述至少一种idr-多肽在所述生化反应中实施其反应功能并且提高所述系统中反应的效率。11.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强所述液-液分层以及由所述idr-多肽引起的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。12.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的idr-多肽提供atp，从而进一步促进(simulating)或增强所述液-液分层以及由所述idr-多肽引起的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。13.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施所述反应所必需的分子与多个相分离的水性隔室中的idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。14.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。15.在根据该另一个方面的任何方法中，与在相同反应条件下(除了至少一种多肽尚未用包含一个或多个功能性idr或由一个或多个功能性idr组成的氨基酸序列标记之外)引入所述至少一种多肽后的所述系统中反应的效率相比，所述系统中反应的效率可以通过所述idr-多肽而提高。16.本发明还提供了一种在水性体外反应系统中实施生化反应的方法，其中，所述生化反应取决于至少一种反应大分子的功能，任选地至少一种反应多肽的功能，所述方法包括：17.i.在适于实施所述反应的条件下将包含至少一种idr-大分子的分子引入所述系统，其中，所述至少一种idr-大分子包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)，优选地其中，所述至少一种idr-大分子为至少一种idr-多肽；18.ii.维持所述系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽以导致所述系统中的液-液分层，其中，所述液-液分层由所述idr-大分子或所述idr-多肽引起，并且在所述系统内形成多个相分离的水性隔室；19.iii.维持所述系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽以使实施所述反应所必需的分子与所述隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位；并且20.iv.允许所述生化反应在所述隔室中继续进行；其中，所述至少一种idr-大分子的存在提高了所述系统中生化反应的效率。21.在上述方法中，所述生化反应可以取决于所述至少一种idr-大分子的功能，任选地所述至少一种idr-多肽的功能，其中，在将其引入体外反应系统后，所述至少一种idr-大分子或所述至少一种idr-多肽在所述生化反应中实施其反应功能并且提高反应的效率。所述多个相分离的水性隔室可以是多个可检测的相分离的水性颗粒。22.在另一个方面，本发明提供了一种在水性体外反应系统中实施生化反应的方法，其中，所述生化反应取决于至少一种反应大分子的功能，任选地至少一种反应多肽的功能，所述方法包括：23.i.在适于实施反应的条件下将包含至少一种用氨基酸序列标记的多肽(idr-多肽)的分子引入系统，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成；24.ii.维持所述系统中的所述idr-多肽以导致液-液分层并且在所述系统内形成多个相分离的水性隔室，优选可检测的相分离的水性颗粒，其中，所述液-液分层由所述idr-多肽导致；25.iii.维持所述系统中的所述idr-多肽以使实施所述反应所必需的分子与所述隔室中的idr-多肽共定位；并且26.iv.允许所述生化反应在所述隔室中进行；其中，所述至少一种idr-多肽的存在提高了所述系统中生化反应的效率。27.任选地，在根据该另一个方面的方法中，所述生化反应取决于至少一种反应多肽的功能，其中，所述反应多肽为至少一种idr-多肽，其中，在引入所述系统后，所述至少一种idr-多肽在所述生化反应中实施其反应功能并且提高所述系统中反应的效率。28.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强所述液-液分层以及由所述idr-多肽导致的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。29.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的idr-多肽提供atp，从而进一步促进(simulating)或增强所述液-液分层以及由所述idr-多肽导致的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。30.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。31.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的idr-大分子或idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。32.在根据该另一个方面的任何方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。33.在根据该另一个方面的任何方法中，与在相同反应条件下(除了所述至少一种多肽尚未被包含所述一个或多个功能性idr或由所述一个或多个功能性idr组成的氨基酸序列标记之外)引入所述至少一种多肽后的所述系统中反应的效率相比，所述系统中反应的效率可以通过所述idr-多肽而提高。34.在上述任何方法中，所述方法可以是用于在体外反应系统中合成核酸分子的生化反应，包括：35.(a)提供至少一个核酸引物；36.(b)提供包含至少一条靶链的靶核酸分子，并且使所述至少一个核酸引物与所述靶链接触，从而形成双链结构；37.(c)提供所述idr-大分子作为idr-多肽，其中，所述idr-多肽为聚合酶或一种或多种多肽辅助因子；并且38.(d)允许所述反应继续进行，从而用聚合酶和dntp延伸所述至少一个核酸引物的3'端，任选地在一种或多种多肽辅助因子的存在下，以生成双链核酸，其中，第一链包含所述靶链的序列，并且第二链包含与所述靶链的序列互补的序列。39.可替代地，在任何上述方法中，所述方法可以是用于在体外反应系统中扩增单链靶核酸分子或双链靶核酸分子的生化反应，优选地其中，所述靶核酸分子为dna分子。40.所述方法可以是用于在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的生化反应，包括：41.(a)提供第一核酸引物和第二核酸引物；42.(b)提供包含第一链和第二链的双链靶核酸分子，并且使所述第一核酸引物和所述第二核酸引物与所述靶核酸分子接触，从而与所述第一链形成第一双链结构并与所述第二链形成第二双链结构；43.(c)提供所述idr-大分子作为idr-多肽，其中，所述idr-多肽为聚合酶或一种或多种蛋白质辅助因子；并且44.(d)允许所述反应继续进行，从而用聚合酶和dntp延伸所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3'端，任选地在一种或多种蛋白质辅助因子的存在下，以生成第一双链核酸和第二双链核酸；并且45.(e)重复步骤(b)至(d)直到达到所需的扩增程度。46.在用于在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述方法中，所述方法可以是在所述体外反应系统中扩增所述双链靶核酸分子的重组酶聚合酶扩增(rpa)方法，包括：47.(a)提供重组酶剂、任选的重组酶负载蛋白、单链稳定剂、聚合酶、第一核酸引物和第二核酸引物、包含第一链和第二链的双链靶核酸，以及任选的核酸外切酶，如核酸外切酶iii；48.(b)使所述重组酶剂与所述第一核酸引物和所述第二核酸引物接触并且任选地与所述重组酶负载蛋白接触，以形成第一核蛋白引物和第二核蛋白引物，其在它们的3'端包含单链区域；49.(c)使所述第一核蛋白引物和所述第二核蛋白引物与所述靶核酸分子接触，从而与所述第一链形成第一双链结构并与所述第二链形成第二双链结构；50.(d)允许所述反应继续进行，从而用聚合酶和dntp延伸所述第一核蛋白引物和所述第二核蛋白引物的3'端，以生成第一双链核酸和第二双链核酸以及第一置换核酸链和第二置换核酸链，其中，所述单链稳定剂稳定所述第一置换链和所述第二置换链；并且51.(e)通过重复步骤(b)至(d)继续所述反应，直到达到所需的扩增程度；52.其中，所述重组酶剂、和/或所述重组酶负载蛋白、和/或所述单链稳定剂、和/或所述聚合酶作为所述idr-多肽提供。53.在上述用于在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的rpa方法中，所述重组酶剂可以选自由以下组成的组：uvsx、t4 uvsx、t6 uvsx、rb18 uvsx、大肠杆菌(e.coli)噬菌体wv7uvsx、志贺氏菌(shigella)噬菌体cb8 uvsx、志贺氏菌噬菌体shfl2 uvsx、大肠杆菌噬菌体ar1 uvsx、噬菌体vb_ecom_g4507 uvsx、志贺氏菌噬菌体shfml-11uvsx、埃希氏菌(escherichia)噬菌体vb_ecom_dalca uvsx、大肠杆菌reca、大肠杆菌rada、大肠杆菌radb、大肠杆菌rad 51或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合；优选地其中，所述重组酶剂为uvsx，更优选埃希氏菌噬菌体vb_ecom_dalca uvsx。54.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述方法可以包括重组酶负载蛋白，并且其中，所述重组酶负载蛋白选自由以下组成的组：uvsy、大肠杆菌reco、大肠杆菌recr或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合；优选地其中，所述重组酶负载蛋白为uvsy，更优选埃希氏菌噬菌体sto uvsy。55.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述聚合酶可以是真核聚合酶，其选自由以下组成的组：pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合。所述聚合酶可以是原核聚合酶，其选自由以下组成的组：嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)聚合酶i大片段、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)pol i大片段(bsu聚合酶)、单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes)dna聚合酶i、金黄色葡萄球菌(s.aureus)dna聚合酶i(sau聚合酶)、大肠杆菌dna聚合酶i klenow片段、大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶ii、大肠杆菌dna聚合酶iii、大肠杆菌dna聚合酶iv、大肠杆菌dna聚合酶v或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合；优选地其中，所述聚合酶为金黄色葡萄球菌dna聚合酶i(sau聚合酶)或枯草芽孢杆菌pol i大片段(bsu聚合酶)。所述聚合酶可以是噬菌体聚合酶，其选自由以下组成的组：噬菌体t4 gp43 dna聚合酶、t7 dna聚合酶和phi-29 dna聚合酶或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合。56.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述单链稳定剂可以选自由以下组成的组：gp32、大肠杆菌ssb蛋白、噬菌体t4 gp32蛋白、噬菌体rb69 gp32、噬菌体vb_ecom_nbg1 gp32或其任何功能性类似物、同源物或衍生物，以及它们的任意组合；优选地，所述单链稳定剂为gp32或噬菌体vb_ecom_nbg1 gp32。57.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，可以仅提供所述重组酶剂作为所述idr-多肽，或可以仅提供所述重组酶负载蛋白作为所述idr-多肽，或可以仅提供所述单链稳定剂作为所述idr-多肽，或可以仅提供所述聚合酶作为所述idr-多肽，或可以仅提供所述核酸外切酶作为所述idr-多肽。58.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述idr-多肽的一个或多个功能性idr可以作为包含一个或多个idr或由一个或多个idr组成的氨基酸序列被标记至所述idr-多肽，使得所述idr-多肽为基因工程化的融合蛋白，其中，所述一个或多个功能性idr位于所述idr-多肽的c端、位于所述idr-多肽的n端、或位于所述idr-多肽的c端和所述idr-多肽的n端、或位于沿所述多肽的长度的任何氨基酸位置。59.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以被表征为当通过metadisorder算法分析时得分大于0.5的氨基酸序列。60.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含包括三肽序列rgg的一个或多个重复的氨基酸序列，或由包括三肽序列rgg的一个或多个重复的氨基酸序列组成。在任何此类方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含还包括二肽序列fg的一个或多个重复的氨基酸序列，或可以由还包括二肽序列fg的一个或多个重复的氨基酸序列组成。在任何此类方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含还包括至少一个由酪氨酸或苯丙氨酸组成的芳香族氨基酸残基的氨基酸序列，或可以由还包括至少一个由酪氨酸或苯丙氨酸组成的芳香族氨基酸残基的氨基酸序列组成。61.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：62.i.(ynpqggyqq)n(seq id no:19)，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3；或63.ii.(ysptsps)n(seq id no:124)，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3；或64.iii.(fsptspt)n(seq id no:125)，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3；或65.iv.(ysptsp-a/n/g)n(seq id no:126)，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3；或66.v.(yspgspa)n(seq id no:127)，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3。67.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含富含谷氨酰胺的氨基酸序列或由富含谷氨酰胺的氨基酸序列组成，任选地其中，所述氨基酸序列包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续的谷氨酰胺残基。在任何此类方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含包括三肽序列qqq的一个或多个重复的氨基酸序列，或由包括三肽序列qqq的一个或多个重复的氨基酸序列组成。在任何此类方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr包含(qqqpqy)n的氨基酸序列(seq id no:128)或由(qqqpqy)n的氨基酸序列(seq id no:128)组成，其中，n为1至10的正整数，任选地其中，n＝1、2或3。68.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含seq id no：1的至少5个连续的氨基酸的序列或由seq id no：1的至少5个连续的氨基酸的序列组成。69.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含seq id no：9的至少5个连续的氨基酸的氨基酸序列或由seq id no：9的至少5个连续的氨基酸的氨基酸序列组成。70.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列含有一个或多个芳香族酪氨酸残基和一个或多个苯丙氨酸残基，它们能够与多价金属离子(优选二价金属离子)进行芳香族阳离子-π相互作用。71.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽的所述一个或多个功能性idr可以包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列含有一个或多个精氨酸残基，它们能够与多价金属离子(优选二价金属离子)进行胍-金属相互作用。72.在任一种上述方法中，所述idr-大分子或所述idr-多肽可以包含用氨基酸序列标记的大分子或多肽或由用氨基酸序列标记的大分子或多肽组成，所述氨基酸序列包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列组成，或者包含seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列组成，例如，其与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多同一性。73.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述idr-多肽可以是单链稳定剂，其为gp32并且其具有seq id no 65至88中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 65至88中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。74.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述idr-多肽可以是重组酶剂，其为uvsx并且其具有seq id no 44至59中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 44至59中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。75.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述idr-多肽可以是重组酶负载蛋白，其为uvsy并且其具有seq id no 60至64中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 60至64中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。76.在任一种上述方法中，所述方法还可以包括：在所述体外反应系统中向所述idr-大分子或所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进(simulating)或增强所述体外反应系统中的液-液分层，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，所述多价金属离子进一步促进或增强所述系统内所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，优选地其中，所述多价金属离子进一步促进或增强多个可检测的相分离的水性颗粒的形成；任选地其中，所述多价金属离子以浓度提供；优选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。在任何此类方法中，所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。77.在任一种上述方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强所述液-液分层以及由所述idr-大分子或idr-多肽导致的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。78.在任一种上述方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。79.在任一种上述方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。80.在任一种上述方法中，所述生化反应可以在包含表面的固相反应系统中实施。在任何此类方法中，所述生化反应可以是在如上所述体外反应系统中扩增单链靶核酸分子或双链靶核酸分子的方法，其中，所述至少一个核酸引物和/或所述idr-大分子和/或所述一种或多种多肽辅助因子附着于所述表面。81.在任一种在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的上述rpa方法中，所述反应可以在包含表面的固相反应系统中实施，并且其中，所述重组酶剂和/或所述重组酶负载蛋白和/或所述单链稳定剂和/或所述聚合酶和/或所述核酸外切酶和/或所述第一核酸引物和/或所述第二核酸引物连接于所述表面，优选地其中：(i)所述第一核酸引物或所述第二核酸引物附着于所述表面；或(ii)所述第一核酸引物和所述第二核酸引物均连接于所述表面。82.在包含表面的固相反应系统中实施的上述任何方法中，所述表面可以是平坦的或可以是微珠，优选地，所述表面包含硅、玻璃、基于凝胶的材料和/或聚合物材料(如聚苯乙烯)，更优选地，所述表面为包含聚合物材料(如聚苯乙烯)的微珠。在任何此类方法中，所述表面可以结合至基材，优选地，所述表面为平坦的和/或所述基材包含玻璃。所述表面，例如平坦的表面和/或所述基材可以被提供作为流通池(flow-cell)。83.本发明提供了在培养的细胞中实施生化反应的方法，通过将任何上述idr-大分子中的至少一种或任何上述idr-多肽中的至少一种引入培养的宿主细胞中，或者通过在培养的宿主细胞中表达任何上述idr-多肽中的至少一种，以提高培养的宿主细胞中生化反应的效率。84.上述任何用于实施体外生化反应的方法可以包括在培养的细胞中实施的生化反应，如通过将所述至少一种idr-大分子或所述至少一种idr-多肽引入培养的宿主细胞中，或者通过在培养的宿主细胞中表达所述至少一种idr-多肽，以提高培养的宿主细胞中生化反应的效率。85.所述生化反应可以是导致在培养的宿主细胞中操纵核酸分子的任何反应，或导致在培养的宿主细胞中改变核酸分子的任何反应，如核酸分子的结构的改变，如核酸分子的核苷酸序列的改变。所述生化反应可以是导致在培养的宿主细胞中合成核酸分子的任何反应。所述生化反应可以是导致从核酸分子表达多肽的任何反应。所述生化反应可以是导致在培养的宿主细胞中编辑核酸序列的任何反应，例如，其中，所述idr-多肽为crispr多肽，如cas多肽，包括cas9多肽。所述生化反应可以是导致在培养的宿主细胞中切割核酸的任何反应。所述生化反应可以是导致在培养的宿主细胞中同源重组核酸的任何反应。所述生化反应可以是在培养的宿主细胞中的代谢反应，以在培养的宿主细胞中产生一种或多种感兴趣的生物制品，或产生一种或多种从培养的宿主细胞分泌或从培养的宿主细胞释放到培养基中的感兴趣的生物制品。86.在任一种上述方法中，与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的至少一种大分子或至少一种多肽不包含或尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述反应)获得的反应的效率相比，提高生化反应的效率可以包括使用所述至少一种idr-大分子或所述至少一种idr-多肽提高所述反应的所述效率。87.在任一种上述rpa方法中，与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的至少一种多肽尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述反应)获得的扩增产物的量相比，提高或增强rpa生化反应的效率或实施可以包括使用所述至少一种idr-多肽提高在rpa反应中获得的扩增产物的量。88.在涉及将至少一种idr-大分子或idr-多肽引入所述体外反应系统的任一上述方法中，与在相同反应条件(除了所述至少一种大分子或多肽不包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)之外)下引入至少一种大分子或多肽后的所述系统中反应的效率相比，idr-大分子或idr-多肽提高了所述系统中反应的效率。89.在涉及将至少一种用氨基酸序列标记的多肽(idr-多肽)引入所述体外反应系统的任一上述方法中，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成，与在相同反应条件(除了所述至少一种多肽尚未被包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的氨基酸序列标记之外)下引入所述至少一种多肽后的所述系统中反应的效率相比，所述系统中反应的效率通过所述idr-多肽而提高。90.本发明还提供了一种非天然存在的idr-大分子，其包含大分子和标签氨基酸序列，其中，所述标签氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成，其中，所述idr-大分子能够在水性体外反应系统中导致液-液分层。任何此类idr-大分子都能够导致液-液分层并且在系统中形成多个相分离的水性隔室，优选多个可检测的相分离的水性颗粒。由体外反应系统中任何此类非天然存在的idr-大分子导致的任何此类液-液分层可以由此提高生化反应的效率。91.任一种上述idr-大分子可以是一种非天然存在的、人工的或基因工程化的idr-大分子或idr-多肽，包含大分子或多肽和所述标签氨基酸序列。在idr-多肽的情况下，所述标签氨基酸序列可以位于所述多肽的c端、位于所述多肽的n端、或位于所述多肽的c端和所述多肽的n端、或位于沿所述多肽的长度的任何氨基酸位置。92.在任一种上述idr-大分子或idr-多肽中，所述标签氨基酸序列的所述一个或多个功能性idr为任一种上述方法中所定义的功能性idr。93.在任一种上述idr-大分子或idr-多肽中，所述标签序列包含能够与多价金属阳离子进行芳香族阳离子-π相互作用的氨基酸残基，多价金属阳离子优选二价金属阳离子，更优选mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+离子，还更优选mg2+、mn2+或ca2+，甚至更优选mg2+。94.在任一种上述idr-大分子或idr-多肽中，所述idr-大分子或所述idr-多肽包含用氨基酸序列标记的大分子或多肽或由用氨基酸序列标记的大分子或多肽组成，所述氨基酸序列包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列组成，或者包含seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列组成，例如，该功能性变体氨基酸序列与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多的同一性。95.在任一种上述idr-多肽中，包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的序列所标记的多肽可以是酶，如解旋酶、旋转酶、重组酶(例如rpa重组酶剂)、核酸酶(例如核酸外切酶和核酸内切酶)、连接酶、糖酵解酶、甲基化酶、甲基转移酶、葡萄糖基转移酶、聚合酶、激酶、磷酸酶、基因编辑酶，如crispr酶(例如cas9酶)；辅助因子，例如作为rpa重组酶负载蛋白和rpa单链稳定剂。包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的序列所标记的多肽可以是连接酶，任选地为rb69连接酶，如rb69连接酶-his2(seq id no:112)。包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的序列所标记的多肽可以是rpa单链稳定剂，优选gp32；任选地其中，所述idr-多肽具有seq id no 65至88和seq id no:120中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 65至88和seq id no:120中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的序列所标记的多肽可以是rpa重组酶剂，优选uvsx；任选地其中，所述idr-多肽具有seq id no 44至59中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 44至59中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。包含所述一个或多个功能性idr的或由所述一个或多个功能性idr组成的序列所标记的多肽可以是rpa重组酶负载蛋白，优选uvsy；任选地其中，所述idr-多肽具有seq id no 60至64中任一个的氨基酸序列，或其中，所述idr-多肽为其功能性变体，例如，具有与seq id no 60至64中任一个具有80％或更多同一性的氨基酸序列的idr-多肽。96.本发明还提供了一种分离的核酸分子，包含编码任何上述idr-多肽的第一核酸序列；任选地包括编码启动子的第二核酸序列，其中，所述第一核酸序列可操作地连接至所述第二核酸序列。本发明还提供了一种重组多核苷酸表达载体，其包含任何此类核酸分子。本发明还提供了一种宿主细胞，其包含任何此类核酸分子或任何此类重组多核苷酸表达载体。本发明还提供了一种细胞培养物，其包含任何此类宿主细胞的生长培养基和群体。97.本发明还提供了一种试剂盒，其包含任何上述非天然存在的idr-大分子或idr-多肽。任何此类试剂盒还可以包含额外的rpa组分，其包含rpa重组酶剂，和/或rpa重组酶负载蛋白，和/或聚合酶，和/或第一核酸引物和第二核酸引物，和/或核酸外切酶，和/或缓冲液，和/或多价金属离子(优选二价金属阳离子)的源。在任何此类试剂盒中，所有组分均可以以冻干形式提供。98.本发明还提供了一种促进或增强溶液中液-液分层的方法，所述方法包括：提供包含任何上述idr-大分子或任何上述idr-多肽的溶液，并且使溶液中的所述idr-大分子或所述idr-多肽与多价金属离子接触，因此促进或增强所述溶液中的液-液分层。本发明还提供了在水性体外反应系统中促进或增强由idr-大分子或idr-多肽导致的液-液分层的另一种方法，所述方法包括将任何一种上述idr-大分子或任何一种上述idr-多肽提供到所述系统中，将多价金属离子提供到系统中，并且允许idr-大分子或idr-多肽接触所述多价金属离子，因此促进或增强了由溶液中的idr-大分子或idr-多肽导致的液-液分层。在任何此类方法中，液-液分层可以导致在所述溶液中形成多个相分离的水性隔室，优选多个可检测的相分离的水性颗粒。在任何此类方法中，所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。在任何此类另一种方法中，所述多价金属离子可以与一个或多个功能性idr氨基酸序列中的氨基酸残基进行芳香族阳离子-π相互作用，从而促进液-液分层。99.在任何此类另一种方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强所述液-液分层以及由所述idr-大分子或所述idr-多肽导致的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。100.在任何此类另一种方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。101.在任何此类另一种方法中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。102.本发明还提供了多价金属离子在促进或增强溶液中液-液分层中的用途，所述分层由任何一种上述idr-大分子或任何一种上述idr-多肽介导。本发明还提供了多价金属离子在促进或增强水性体外反应系统中由引入系统的idr-大分子或idr-多肽导致的液-液分层中的用途，其中，所述idr-大分子或idr-多肽为任何一种上述idr-大分子或任何一种上述idr-多肽。在任何此类用途中，所述液-液分层可以导致在所述溶液中形成由idr-大分子或idr-多肽导致的多个相分离的水性隔室，优选多个可检测的相分离的水性颗粒。在任何此类用途中，所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。在任何此类用途中，所述多价金属离子可以与一个或多个功能性idr氨基酸序列中的氨基酸残基进行芳香族阳离子-π相互作用，从而促进液-液分层。103.在任何此类用途中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或所述idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强所述液-液分层以及由所述idr-大分子或所述idr-多肽导致的所述多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。104.在任何此类用途中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述idr-多肽提供多价金属离子，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率；任选地其中，所述多价金属离子以约22mm或更高的浓度提供，优选地其中，所述多价金属离子以约22mm至50mm的浓度提供。所述多价金属离子可以是二价金属离子，任选地为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+，优选mg2+、mn2+或ca2+，更优选mg2+。105.在任何此类用途中，适于实施反应的条件还可以包括：向所述体外反应系统中的所述idr-大分子或idr-多肽提供atp，从而进一步促进或增强实施反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-多肽共定位，从而进一步提高所述系统中生化反应的效率，其中，atp在所述系统中以1mm至3.5mm的浓度提供，任选1mm至2mm，优选1mm。106.本发明还提供了任何一种上述非天然存在的idr-大分子或任何一种上述idr-多肽用于疗法，用作药剂，用作药物，用于诊断方法或用作诊断剂。107.本发明还提供了一种制备任何一种上述非天然存在的idr-大分子或任何一种上述idr-多肽的方法，所述方法包括：提供大分子，任选地提供多肽，并且用一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记所述大分子或多肽。所述标记可以通过本文描述和定义的任何方式来实施。所述一个或多个功能性固有无序区域多肽序列可以与任何本文描述和定义的相同。所述大分子或多肽可以是任何合适的大分子或多肽，包括本文描述和定义的任何大分子或多肽。108.上述idr-大分子或idr-多肽中的任何一种都可以提高生化反应的效率。与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的大分子或相关的多肽不包含或尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述反应)获得的反应的效率相比，提高生化反应的效率可以包括使用所述idr-大分子或所述idr-多肽提高所述反应的所述效率。109.上述idr-大分子或idr-多肽中的任何一种都可以提高生化反应的效率，其中，重组酶聚合酶扩增(rpa)反应中的反应。与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的多肽不包含或尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述rpa反应)获得的扩增产物的量相比，提高rpa生化反应的效率或实施可以包括使用所述idr-多肽提高在rpa反应中获得的扩增产物的量。110.本发明还提供了一种确定一种或多种靶多核苷酸分子的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：111.(i)实施上述方法以扩增所述一种或多种靶多核苷酸分子，从而得到包含所述一种或多种靶多核苷酸分子的多个拷贝的群体；并且112.(ii)对包含所述靶多核苷酸分子的多个拷贝的所述群体实施一种或多种核酸测序反应，113.优选地其中，所述方法在包含表面的固相反应系统中实施。114.本发明还提供了任何一种上述idr-大分子或任何一种上述idr-多肽在确定一种或多种靶多核苷酸分子的核苷酸序列的方法中的用途，优选地其中，所述方法如上所述。115.本发明还提供了多肽或分离的多肽，其包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列组成，或者包含seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列组成，例如，该功能性变体氨基酸序列与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多同一性。如本文进一步描述的，任何此类多肽可以连接/标记至大分子或多肽以形成idr-标记的大分子或idr-标记的多肽。被标记的大分子或多肽可以是在水性反应系统中实施生化反应所需的大分子或多肽。当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，任何此类idr-标记的大分子或idr-标记的多肽都可以导致所述系统中由seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或其任何功能性变体导致的液-液分层和多个相分离的水性隔室的形成，优选多个可检测的相分离的水性颗粒，从而提高所述系统中生化反应的效率。当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，任何此类idr-标记的大分子或idr-标记的多肽都使实施所述反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-大分子或所述idr-多肽共定位，从而提高所述系统中生化反应的效率。116.所述水性反应系统可以是水性体外反应系统。117.本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列组成，或者包含seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43的功能性变体氨基酸序列组成，例如，该功能性变体氨基酸序列与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多的同一性。118.本发明还提供了idr部分在生成idr-标记的大分子或idr-标记的多肽中的用途，idr部分为多肽，其包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成，其中，所述idr部分连接/标记至大分子或多肽；其中，被标记的大分子或多肽是在水性反应系统中实施生化反应所需的大分子或多肽，并且其中，当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，所述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽导致由所述idr部分引起的液-液分层，并且导致所述系统中多个相分离的水性隔室的形成，优选多个可检测的相分离的水性颗粒，从而提高所述系统中生化反应的效率。当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，任何此类idr-标记的大分子或idr-标记的多肽都使实施所述反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-标记的大分子或所述idr-标记的多肽共定位，从而提高所述系统中生化反应的效率。119.优选地，所述idr部分连接/标记至多肽，从而生成idr-标记的多肽，优选生成作为重组基因融合蛋白。120.优选地，所述idr部分为包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no1至43中任一个的氨基酸序列组成的多肽，或者包含seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列组成的多肽，例如，功能性变体氨基酸序列与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多的同一性。121.任何上述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以被定义为非天然存在的、人工的或基因工程化的大分子或多肽。122.任何上述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以进一步具有本文描述和定义的任何一种或多种idr-大分子或idr-多肽的特征。123.所述水性反应系统可以是水性体外反应系统。124.本发明还提供了根据任何上述用途获得的idr-标记的大分子或idr-标记的多肽。125.本发明还提供了一种生成idr-标记的大分子或idr-标记的多肽的方法，包括：提供大分子或多肽并且在其上连接/标记idr部分，其中，所述idr部分为包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成的多肽；其中，被标记的大分子或多肽为在水反应系统中实施生化反应所需的大分子或多肽，并且其中，当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，所述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽引起由所述idr部分导致的液-液分层，并且导致所述系统中多个相分离的水性隔室的形成，优选多个可检测的相分离的水性颗粒，从而提高所述系统中生化反应的效率。当在实施生化反应的条件下保持在水性反应系统中时，任何此类idr-标记的大分子或idr-标记的多肽都使实施所述反应所必需的分子与所述多个相分离的水性隔室中的所述idr-标记的大分子或所述idr-标记的多肽共定位，从而提高所述系统中生化反应的效率。126.优选地，所述方法包括：提供多肽并且在其上连接/标记idr部分，以生成idr-标记的多肽，优选生成作为重组基因融合蛋白。127.优选地，所述idr部分为包含seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列或由seq id no1至43中任一个的氨基酸序列组成的多肽，或者包含seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列或由seq id no 1至43中任一个的功能性变体氨基酸序列组成的多肽，例如，功能性变体氨基酸序列与seq id no 1至43中任一个具有80％或更多的同一性。128.任何上述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以被定义为非天然存在的、人工的或基因工程化的大分子或多肽。129.任何上述idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以进一步具有本文描述和定义的任何一种或多种idr-大分子或idr-多肽的特征。130.所述水性反应系统可以是水性体外反应系统。131.本发明还提供了通过任何上述方法获得的idr-标记的大分子或idr-标记的多肽。附图说明132.图1示出了在不同的模板核酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。133.图2示出了在不同的模板核酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his5)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。134.图3示出了在不同的模板核酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。135.图4示出了在不同的模板核酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-sup1)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。136.图5示出了在不同的模板核酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-sup2)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。图5a、5b、5c和5d中所示的实验分别使用具有1、2、3和4个sup2 idr重复的gp32融合蛋白。137.图6示出了在不同的mgoac浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his5)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。138.图7示出了在不同的磷酸肌酸浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。139.图8示出了在不同的koac浓度下使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。140.图9示出了有或没有拥挤剂(peg)的情况下使用被7个组氨酸残基标记的gp32(用于蛋白质纯化目的，即没有idr标签)与idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-sup1)相比的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。141.图10示出了没有拥挤剂的情况下多价金属阳离子对促进由idr氨基酸序列标签介导的相分离(颗粒形成)的效果。idr氨基酸序列被标记至gp32蛋白以生成gp32-his2融合蛋白(图10a)、gp32-hrp1融合蛋白(图10b)、gp32-sup1融合蛋白(图10c)以及gp32-fib融合蛋白(图10d)。在每种情况下，测试了代表性浓度的二价金属阳离子(即镁(mgoac)、锰(mgcl2)和钙(cacl2))的效果。142.图11示出了没有拥挤剂的情况下多价金属阳离子对促进由idr氨基酸序列标签介导的相分离(颗粒形成)的效果。idr氨基酸序列被标记至gp32蛋白以生成gp32-fib融合蛋白(图11a)、gp32-sup1融合蛋白(图11b)、gp32-his2融合蛋白(图11c)、gp32-hrp1融合蛋白(图11d)、gp32-his5融合蛋白(图11e)。在每种情况下，测试了代表性浓度的二价金属阳离子(即镁(mgoac)、锰(mgcl2)和钙(cacl2))的效果。143.图12示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子，即镁(mgoac)对idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。144.图13示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子，即镁(mgoac)对idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。145.图14示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子(即镁(mgoac))的不同浓度对idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。146.图15示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子(即镁(mgoac))的不同浓度对idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。147.图16示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子(即镁(mgoac))的添加对idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)促进相分离的能力的影响。通过在添加mgoac后由于颗粒形成而形成不透明的溶液来证明相分离(图16a)，并且通过颗粒的沉淀(pelleting)进一步证明颗粒形成(图16b)。如沉淀材料的sds-page分析所揭示的，rpa蛋白质组分被证明与颗粒相关联。148.图17示出了有或没有拥挤剂的情况下使用天然gp32融合蛋白的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。实验表明，在没有拥挤剂的情况下，未被包含固有无序区域(idr)的氨基酸序列标记的gp32不能介导扩增。149.图18.图18a为描绘使用双引物珠进行实时扩增而设置的反应混合物的动画(cartoon)。图18b为描绘实时反应中扩增产物的动画。图18c为描绘终点反应中扩增表征的动画。图18d示出了使用连接至固体表面的引物或使用溶液中游离的引物的使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)的实时重组酶聚合酶扩增轨迹。图18e和18f示出了使用至固体表面的引物的使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-his2)的终点重组酶聚合酶扩增轨迹。150.图19示出了针对gp32(图19a)、uvsy(图19b)和uvsx(图19c)使用metadisorder软件程序生成的无序曲线图。151.图20示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，二价金属阳离子(即镁(mgcl2))的不同浓度对idr-标记的rb69连接酶融合蛋白(rb69连接酶-his2)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。152.图21示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，idr-标记的rb69连接酶融合蛋白(rb69连接酶-his2)的连接酶活性性能。153.图22示出了，与未标记的rb69连接酶和t4 dna连接酶相比，在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，idr-标记的rb69连接酶融合蛋白(rb69连接酶-his2)的连接酶活性性能。154.图23示出了，与nebnext ultra ii连接预混反应液(ligation master mix)相比，在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，idr-标记的rb69连接酶融合蛋白(rb69连接酶-his2)的连接酶活性性能。155.图24示出了在没有拥挤剂的示例性体外生化反应环境中，atp对idr-标记的rb69连接酶融合蛋白(rb69连接酶-his2)促进相分离(颗粒形成)的能力的影响。156.图25示出了flexwelltm腔室的代表性部分的明场图像和荧光图像，flexwelltm腔室具有每珠0、5、10、20、40或80个单链up1-up2′‑tf1l模板的拷贝，在50℃退火1小时，然后在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用连接至固体表面的引物使用idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)通过重组酶聚合酶扩增。通过用nt.bbvci切割扩增子并用氨基烯丙基-dutp-xx-atto-594延伸切口来检测扩增。在尚未添加模板的珠上没有观察到荧光，而在已经退火的模板的量增加的珠上观察到荧光的量增加。这表明在没有拥挤剂的情况下扩增发生在珠的固体表面上。157.图26a示出了证明由idr-标记的gp32融合蛋白(gp32-hrp1)介导的相分离的水性颗粒的形成的明场图像和荧光图像。图26b示出了证明在形成由gp32-hrp1介导的相分离的水性颗粒后反应的提高的效率(cas12a对核酸的切割率)的图。具体实施方式158.重组酶聚合酶扩增是一种用于扩增核酸分子的技术。系统尤其利用重组酶并且优选重组酶负载蛋白。这些蛋白质组分与扩增引物形成复合物。在与待扩增的靶核酸分子结合后，复合物“扫描”靶核酸分子并“搜索”靶序列和引物序列之间的互补区域。一旦发现互补区域，复合物有助于引物与靶序列的结合。然后，聚合酶可以延伸引物以生成靶序列的拷贝。重组酶复合物的使用提供了与其它核酸扩增方法(如pcr)相比的关键区别。在rpa中，不需要由热循环驱动的熔解和退火步骤，因为重组酶复合物为引物结合问题提供了完全基于酶的溶液。因此，rpa是一种恒温技术。不需要极端热循环意味着rpa与如pcr等技术相比具有许多明显的优势。159.rpa方法中证据充分的要求为存在“拥挤剂”，在本技术领域通常也称为“大分子拥挤剂”。这些试剂在本技术领域中是众所周知的并且具有本领域所理解的含义。在本文中更详细地讨论了拥挤剂。rpa方法中最常用的拥挤剂之一为聚乙二醇(peg)，虽然也可以使用其它拥挤剂。在本发明之前，拥挤剂的使用被认为是rpa方法中的必需要求。160.本发明人意外地发现，可以避开迄今为止认为的在rpa方法中对拥挤剂的关键要求。本发明基于该发现。161.发明人意外地发现，通过用包含一个或多个功能性“固有无序区域”(idr)或由一个或多个功能性“固有无序区域”(idr)组成的氨基酸序列“标记”大分子，如rpa方法所需的蛋白质组分，idr氨基酸序列标签能够在完全没有拥挤剂的情况下促进有效rpa。因此，能够在不依赖拥挤剂的情况下在rpa系统中实现高效扩增，从而减少rpa反应的复杂性。162.发明人还意外地发现，在没有拥挤剂的情况下，涉及idr-标记的大分子组分的rpa方法的扩增的效率可以与生化反应系统中idr氨基酸标签序列促进液-液分层导致相分离的功能性能力相关。相分离可以通过在生化反应环境中形成相分离的水性隔室来评估，特别是球状水性球形粒(globular foci)或相分离的水性颗粒，其可通过标准方法检测，包括通过显微镜观察，如本文进一步描述的。163.此外，发明人还意外地发现，提供idr-标记的大分子组分和拥挤剂能够在rpa方法中的扩增的效率方面提供累加效应甚至协同效应。164.此外，发明人意外地发现，在没有拥挤剂的情况下，涉及idr氨基酸标记的大分子组分的rpa方法中的扩增的效率可以与引入生化反应环境中的多价金属阳离子的浓度相关。因此，多价金属阳离子能够进一步促进或增强由idr-大分子或idr-多肽导致的液-液分层，从而进一步提高反应效率。165.发明人还意外地发现，如本文进一步描述的某些浓度的atp能够进一步促进或增强由idr-大分子或idr-多肽导致的液-液分层，从而进一步提高反应效率。166.基于这些意外的发现，本发明提供了提高基于酶的体外生化反应(包括rpa反应)的效率的方法和试剂，如本文进一步描述的。167.如本文进一步描述的idr氨基酸序列和idr试剂作为有用的试剂具有广泛的适用性，以应用于生化反应的任何合适的大分子组分，如多肽，从而在生化反应环境中促进液-液分层并包括促进相分离，而不依赖于大分子拥挤剂，特别是当idr氨基酸序列与多价金属阳离子一起使用时。本发明还包括多价金属阳离子(如二价金属阳离子)或其任何功能性等效物在生化反应环境中促进idr氨基酸序列介导的相分离中的用途，而不依赖于大分子拥挤剂。168.因此，本发明提供了如本文进一步描述和定义的基于idr的方法、大分子、多肽、核酸、载体、宿主细胞和用途。169.下面依次描述本发明的要素。170.生化反应171.如上所述，发明人意外地发现可以避开对拥挤剂的需求，这是rpa和其它反应的先前考虑的必需组分。如本文中详细描述的，这可以通过将包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的氨基酸序列附着/拴系/标记至rpa反应中所需的蛋白质组分来实现。发明人还意外地表明，附着至连接酶的功能性固有无序区域能够提高连接酶反应的效率。发明人已经表明，在没有拥挤剂的情况下，idr氨基酸序列诱导的相分离的程度可以与反应(例如扩增)的效率相关，并且可以用多价金属阳离子增强。基于这些出人意料的观察，可以合理地预期，与生化反应的大分子或蛋白质组分相关的此类idr氨基酸序列将提高体外或体内生化反应环境中的反应效率，特别是在没有添加的/外源性拥挤剂的情况下。172.因此，本发明包括将本文描述和定义的任何idr氨基酸序列应用于体外或体内生化反应的任何合适的大分子或多肽组分的用途，从而提供能够在生化反应环境中促进液-液分层并提高生化反应的效率的idr试剂。生化反应环境中的此类液-液分层可以导致生化反应环境中的相分离。生化反应环境中的此类液-液分层可以导致相分离，从而导致、引起或促进在生化反应环境中相分离的水性隔室的形成，包括可检测的相分离的水性颗粒的形成，如本文进一步描述的。如本文进一步描述和定义的此类idr试剂或基于idr的试剂可以可互换地指代以描述idr-大分子或idr-标记的大分子、或idr-多肽或idr-标记的多肽中的任何一种或多种。173.在本文描述和定义的任何一种方法、工艺和用途中，或在任何一种非天然存在的idr-大分子、idr-融合大分子或编码相同的、重组多核苷酸表达载体或宿主细胞的分离的核酸分子中，提高或增强生化反应的效率或实施可以包括：与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的大分子或多肽不包含或尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述反应)获得的效率相比，使用本文所描述的任何一种或多种基于idr的大分子或多肽提高反应的效率。174.提高或增强生化反应的效率或实施应当根据普遍接受的概念来理解。例如，在rpa反应或任何其它核酸扩增反应中的反应效率可以被理解为使用相对较少的起始靶核酸提供等效的总扩增子的群体，或使用相同量的起始靶核酸提供相对更快的检测时间或相对更快的扩增速率。175.提高或增强rpa生化反应的效率或实施可以包括：与通过在相同条件下实施反应(但是其中，相关的大分子或多肽不包含或尚未被一个或多个功能性固有无序区域多肽序列标记，并且任选地其中，在没有外源性添加的拥挤剂的情况下实施所述反应)获得的扩增产物的量相比，使用本文所描述的任何一种或多种基于idr的大分子或多肽提高rpa反应中获得的扩增产物的量。176.提高反应系统(如体外反应系统)中生化反应的效率可以包括：在规定的时间段内提高系统中反应的任何可测量参数，如一段时间内的反应速率、一段时间内消耗的底物的量、一段时间内生成的产物的量等。177.提高反应系统(如体外反应系统)中生化反应的效率可以包括：提高可检测的相分离的隔室(如可检测的相分离的水性颗粒)内的反应参数。例如，这可以通过测量反应参数并将提高量与可检测的相分离的水性颗粒的形成和/或反应分子的可检测的共定位成可检测的相分离的水性颗粒相关联来间接推测。178.本文描述的是直接的生物信息学方法和相分离测定，其能够用于确定任何idr氨基酸序列在与给定的大分子或蛋白质一起使用并包含在所需的体外生化反应环境中的情况下，是否能够在所需的生化反应环境中以促进液-液分层和相分离所需的方式发挥作用。此外，任何给定的辅助因子，特别是多价(例如二价)金属阳离子的适用性，可以在这些测定中以非常直接的方式确定。179.因此，本发明提供了如本文描述和定义的idr试剂，其可以有效应用于任何给定的所需的体外或体内生化反应环境。180.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施体外或体内生化反应(如本文所述的任何反应)所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。181.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施核酸合成反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。182.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施核酸合成反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用，其中，聚合酶用于通过延伸引物核酸分子来合成新的核酸分子。183.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施核酸扩增反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。核酸扩增反应可以是涉及热循环的反应。核酸扩增反应可以是恒温扩增反应。核酸扩增反应可以是聚合酶链反应(pcr)、聚合酶螺旋反应(psr)、环介导恒温扩增(lamp)、基于核酸序列的扩增(nasba)、自我持续序列复制(3sr)、滚环扩增(rca)、链置换扩增(sda)、多重置换扩增(mda)、连接酶链反应(lcr)、解旋酶依赖性扩增(hda)、分支扩增法(ram)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、转录介导扩增(tma)或切口酶扩增反应(near)。184.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施基因编辑反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。185.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施crispr反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。186.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施引导编辑(prime editing)基因编辑反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用，其中，crispr酶，如cas酶，例如cas9，以具有至少一种逆转录酶的复合物的形式提供，任选地还具有引导编辑向导rna(prime editing guide rna，pegrna)，并且其中，可以提供被一个或多个功能性固有无序区域(idr)多肽序列标记的引导编辑复合物的任何组分，例如，其中，crispr酶被一个或多个功能性idr多肽序列标记，或其中，逆转录酶被一个或多个功能性idr多肽序列标记。187.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施连接反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。188.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施核酸外切酶反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。189.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施核酸内切酶反应、转录反应、dna甲基化反应、dna糖基化反应、抗体-抗原反应、药物-靶标反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。190.如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以与实施涉及蛋白质：蛋白质相互作用的反应所需的任何大分子或蛋白质组分一起使用。191.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法旨在包括在反应容器中的溶液中直接实施的生化反应，如本文进一步描述的rpa反应。192.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法还包括在培养的细胞中实施的生化反应，如通过在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率。193.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括通过将本文定义的idr试剂引入培养的宿主细胞或在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率而在培养的宿主细胞中实施的生化反应，其中，生化反应是导致在培养的宿主细胞中操纵核酸分子的任何反应，或导致在培养的宿主细胞中改变核酸分子的任何反应，如核酸分子的结构的改变，如核酸分子的核苷酸序列的改变。194.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括：通过将本文定义的idr试剂引入培养的宿主细胞或在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率而在培养的细胞中实施的生化反应，其中，生化反应是导致在培养的宿主细胞中合成核酸分子的任何反应。195.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括：通过将本文定义的idr试剂引入培养的宿主细胞或在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率而在培养的细胞中实施的生化反应，其中，生化反应是导致从核酸分子表达多肽的任何反应。196.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括：通过将本文定义的idr试剂引入培养的宿主细胞或在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率，而在培养的细胞中实施的生化反应，其中，生化反应是导致在培养的宿主细胞中编辑核酸序列(例如，其中，idr-多肽为crispr多肽，如cas多肽，包括cas9多肽，或其中，idr-多肽为与crispr多肽复合的多肽，如其中idr-多肽为逆转录酶)、在培养的宿主细胞中切割核酸、以及导致在培养的宿主细胞中同源重组核酸的任何反应。197.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括：通过将本文定义的idr试剂引入培养的宿主细胞或在培养的宿主细胞中表达本文定义的idr试剂以提高培养的宿主细胞中的生化反应的效率，而在培养的细胞中实施的生化反应，其中，生化反应是在培养的宿主细胞中的代谢反应，以在培养的宿主细胞中产生一种或多种感兴趣的生物制品，或产生一种或多种从培养的宿主细胞分泌或从培养的宿主细胞释放到培养基中的感兴趣的生物制品。198.本发明还旨在包括离体(ex vivo)实施的生化反应，例如，通过在例如组织培养物的细胞或在体外开发的任何其它合适的复杂生物系统中表达本文定义的idr试剂。因此，对使用本文定义的任何idr试剂在本文使用的水性体外反应系统中实施生化反应的方法的任何提及可替代地定义为一种使用本文定义的任何idr试剂在水性离体反应系统中实施生化反应的方法。199.本发明还提供了用于提高体内生化反应的效率的工艺、试剂和方法。因此，对使用本文定义的任何idr试剂在本文使用的水性体外反应系统中实施生化反应的方法的任何提及可替代地定义为一种使用本文定义的任何idr试剂在水性体内反应系统中实施生化反应的方法。200.本发明提供了本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽用于疗法、用作治疗剂、用作药剂(medicament)、用作药物制剂(pharmaceutical agent)或用作诊断剂。201.本发明提供了本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。202.本发明提供了本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽用于对人体或动物体实施的诊断方法。203.本发明提供了本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽用于制备通过疗法用于治疗人体或动物体的药剂。204.本发明提供了本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽用于制备用于在人体或动物体上实施的诊断方法的诊断剂。205.本发明提供了一种治疗人类或动物的方法，包括：向有需要的人或动物施用治疗有效量的本文描述或定义的任何非天然存在的idr-大分子或idr-多肽。206.在任一种上述用于提高生化反应的效率的工艺、试剂和方法中，非天然存在的idr-大分子或idr-多肽能够促进液-液分层。所述液-液分层可以能够促进形成溶液中相分离的水性隔室，包括溶液中可检测的相分离的水性颗粒。所述液-液分层液-液分层或可检测的相分离的隔室或颗粒的形成由此提高了由idr-大分子或idr-多肽导致的生化反应的效率。207.如本文所使用的用于实施体外生化反应的方法包括：通过将本文定义的idr试剂引入溶液中或在培养的宿主细胞中引入或表达idr试剂以促进溶液中或培养的宿主细胞中的液-液分层，在反应容器中的溶液中或在培养的宿主细胞中体外实施的任何生化反应。在任何此类生化反应中，如本文描述和定义的，溶液中或培养的宿主细胞中的液-液分层促进溶液或培养的宿主细胞中的相分离。208.可以实施任何此类生化反应以评估如本文描述和定义的任何idr氨基酸序列在促进溶液或培养的宿主细胞中的液-液分层和/或促进溶液或培养的宿主细胞中的相分离方面的功效。209.可以实施任何此类生化反应以评估测试剂(如药物、多肽或任何其它分子)在促进或增强在溶液或培养的宿主细胞中由idr氨基酸序列介导的液-液分层和/或促进或增强在溶液或培养的宿主细胞中由idr氨基酸序列介导的相分离方面的功效，优选地其中，测试剂与idr氨基酸序列相互作用。210.可以实施任何此类生化反应以评估测试剂(如药物、多肽或任何其它分子)在抑制在溶液或培养的宿主细胞中由idr氨基酸序列介导的液-液分层和/或抑制在溶液或培养的宿主细胞中由idr氨基酸序列介导的相分离方面的功效，优选地其中，测试剂与idr氨基酸序列相互作用。211.本文所描述的用于实施体外、体内或离体生化反应的任何方法可以排除用于克隆人类的方法。212.本文所描述的用于实施体外、体内或离体生化反应的任何方法可以排除用于修改人类的生殖细胞遗传同一性的方法。213.本文所描述的用于实施体外、体内或离体生化反应的任何方法可以排除涉及使用人类胚胎或使用全能性人类细胞的方法。214.本文所描述的任何宿主细胞可以排除人类胚胎或全能性人类细胞或人类生殖细胞。215.尽管在一些方面包括体内使用，但是本发明在一些方面包括排除体内使用。因此，本文所描述的用于在水性反应系统中实施生化反应的任何工艺、用途或方法等可以排除体内水性反应系统。216.尽管在一些方面包括离体使用，但是本发明在一些方面包括排除离体使用。因此，本文所描述的用于在水性反应系统中实施生化反应的任何工艺、用途或方法等可以排除离体水性反应系统。217.在本文所描述的任何方法、工艺、用途或idr试剂中，除了至少一种大分子或多肽不包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)之外，与在相同反应条件下引入至少一种大分子或多肽后的系统中反应的效率相比，idr-大分子或idr-多肽可以提高系统中反应的效率。218.在本文所描述的涉及用氨基酸序列标记的至少一种大分子或至少一种多肽(idr-标记的大分子或idr-标记的多肽)的任何方法、工艺、用途或idr试剂中，该氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)或由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成，与在相同反应条件下(除了至少一种大分子或多肽尚未被包含一个或多个功能性idr的或由一个或多个功能性idr组成的氨基酸序列标记之外)引入至少一种大分子或多肽后的系统中反应的效率相比，系统中反应的效率可以由idr-标记的大分子或idr-标记的多肽提高。219.因此，通过比较具有或不具有一个或多个功能性idr的大分子或多肽的反应效率，可以非常简单地确定：idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽是否能够提高系统中的反应效率。本领域技术人员能够实施简单的比较测试以确定相关的功能性能力。本文进一步描述了示例性测试测定。220.类似地，通过比较具有或不具有一个或多个功能性idr的共定位，也可以非常简单地确定：idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽是否能够使实施反应所必需的分子与多个相分离的水性隔室中的idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽共定位，或者进一步促进或增强多个相分离的水性隔室中的反应实施所必需的分子的共定位，从而提高系统中生化反应的效率。同样地，本领域技术人员能够实施简单的比较测试以确定相关的功能性能力。本文进一步描述了示例性测试测定。221.类似地，通过比较有或没有提供多价金属离子的液-液分层，也可以非常简单地确定：向idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽提供多价金属离子是否由此进一步促进或增强液-液分层和多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高系统中生化反应的效率。同样地，本领域技术人员能够实施简单的比较测试以确定相关的功能性能力。本文进一步描述了示例性测试测定。222.类似地，通过比较有或没有提供atp的液-液分层，也可以非常简单地确定：向idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽提供atp是否可以进一步促进或增强液-液分层和多个相分离的水性隔室的形成，从而进一步提高系统中生化反应的效率。通过比较有或没有提供atp的共定位，也可以非常简单地确定：向idr-大分子或idr-多肽、或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽提供atp是否进一步促进或增强多个相分离的水性隔室中反应实施所必需的分子的共定位，从而提高系统中生化反应的效率。同样地，本领域技术人员能够实施简单的比较测试以确定相关的功能性能力。本文进一步描述了示例性测试测定。223.本文描述了通过参考导致相分离的水性颗粒的形成的能力来确定导致液-液分层的能力的测定(例如，参见如本文所描述的“相分离测定方法”)。相同的测定能够用于确定导致在相分离的水性隔室(颗粒)中实施反应所必需的分子的共定位的能力。本文描述了通过参考提高rpa方法的效率的能力来确定提高反应的效率的能力的测定(例如，参见如本文所描述的“rpa测定方法”)。这种测定能够用于评估由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的氨基酸序列提高反应的效率的能力，和/或用于评估二价金属离子进一步提高反应的效率的能力，和/或用于评估atp进一步提高反应的效率的能力。224.使用如本文所描述的简单测定，本领域技术人员能够确定反应效率提高5％或更多，反应效率的提高可以是10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多，50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多或者100％或更多。225.拥挤剂226.拥挤剂通常是高分子量大分子，如蛋白质或合成嵌段聚合物。拥挤剂被认为本质上是生化惰性的，即它对特定相互作用或催化作用没有帮助。227.普遍假定，拥挤剂通过其在溶液中的体积的物理占用效应而对生物/生化系统(无论是体外系统还是体内系统)产生影响，从而导致空间阻塞与可用开放溶剂空间的减少。通过这种排除体积机制，拥挤剂似乎提高其它大分子的有效浓度，特别是对改变解离常数和有利于相互作用的大分子的结合的影响，如多种蛋白质，它们聚集在一起形成特定的有组织的复合物。拥挤效应的规模尤其取决于所涉及分子的分子质量，通常对于较大的分子要强得多。因此，作为一般规则，大分子拥挤是大分子对其它大分子的性质产生的效果。228.此外，拥挤剂已经被广泛描述为能够促进具有优选相的生物/生化系统的形成，其中反应物自身分离成微米大小的相分离的颗粒。这种效果主要源于体积排阻对大分子复合物的解离常数的影响，由于无法轻易扩散到大体积占据的本体(bulk)溶剂中，大分子复合物成为相对“受限制的”。另外和/或可替代地，一些拥挤剂，如聚乙二醇等嵌段链聚合物可以表现出亲液(kosmotropic)特性，这导致它们对本体水(bulk water)的结构进行全面改变，通常降低水的密度。本体溶剂特性的这种改变也可以对其它大分子及其表面应当与水相互作用的组装体产生复杂影响。这反过来也可以促进那些其它大分子分离成可替代相，显著富集生物组分，伴随耗尽了主要占据本体溶剂相的拥挤剂。229.在任何一种情况下，通过简单的体积占据或溶剂改性，从凝聚物组分的角度来看，单独或组合拥挤剂在促进大分子凝聚成相不同的凝聚物中的作用似乎是通过“排斥”而不是“吸引”机制运作的。换言之，从凝聚物中高度富集的组分的角度来看，拥挤剂的作用是产生不易被扩散渗透的本体相环境，和/或其本体溶剂特性以某种方式被改性，使其呈现分散进入其中的净焓劣势。正是以这种方式，拥挤剂的高浓度(通常大于1％w/v)的效果在本文中被称为通过“阻碍”或“排斥”机制发挥作用来促进相分离，只要由于凝聚组分不能像没有拥挤剂时那样容易分散而出现该现象。然而，同时，鉴于其一般惰性，拥挤剂对系统中的其它特定分子几乎没有或没有直接的削弱效果，例如因为拥挤剂并不以直接方式显著地与特定分子侧链相互作用或对特定分子侧链施加影响。230.在标准rpa反应中，聚乙二醇(peg)可以对重组/dna合成具有深远影响。例如，当reca与gp32结合时，peg可以影响发生的多个侵入/延伸循环的数量。peg可以促进以几种不同方式配置的扩增反应。peg和其它类似的拥挤剂可以影响gp32和重组酶的协同性，它们可以影响聚合酶的持续合成能力(processivity)，并且它们可以影响溶液中寡核苷酸的杂交速率与行为。聚乙二醇的链长度可以影响结果。peg还可以提高负载重组酶的丝状体的稳定性，并且提高的持久性可以提高rpa的效率。231.为了在体外生化反应环境中发挥其效果，添加的拥挤剂通常以预计会发生空间排斥/限制效应的浓度存在，通常高于反应体积或反应重量的约1％。232.在标准rpa反应中，拥挤剂以反应体积或反应重量的约1％-12％的浓度存在。233.术语“大分子拥挤剂”或更简单的“拥挤剂”为公认的和本领域所理解的术语。从广泛使用这些术语的文献中可以看出这一点。例如，kuznetsova,i.,m.等人(what macromolecular crowding can do to a protein,2014,int.j.mol.sci.,15,pp 23090-23140)提供了一篇综述，声称涵盖了超过320篇论文，并被建议代表该领域当前知识的最全面的概要之一。术语“拥挤剂”在整个文本中被广泛使用，强调其普遍存在的使用(另见mixed macromolecular crowding:a protein and solvent perspective,biswas,s.et al.,2018,acs omega,3(4),pp4316-4330 and common crowding agents have only a small effect on protein-protein interactions,phillip y.et al.,2009,biophysical journal,97pp875-885 875)。234.可以通过本领域已知的方式将化合物或大分子鉴定为拥挤剂。例如，拥挤剂可以像这样通过其实验确定的和计算的流体动力学半径(hydrodynamic radius)而被鉴定(上文的kuznetsova et al.)。拥挤剂可以像这样通过溶胶-凝胶玻璃封装分析而被鉴定(上文的kuznetsova et al.)。235.以下化合物为已知的拥挤剂的示例。合成嵌段聚合物、聚乙二醇(peg)、peg 1450、peg2050、peg3000、peg 4600、peg 6000、peg 8000、peg 10000、peg 20000、peg 35000、peg化合物分子量15000至20000(也称为carbowax 20m)、葡聚糖、葡聚糖6、葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖670、葡聚糖硫酸盐10、葡聚糖硫酸盐500、水溶性聚蔗糖(ficoll)、水溶性聚蔗糖70、水溶性聚蔗糖400、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(pss)、牛胰胰蛋白酶抑制剂(bpti)、核糖核酸酶a、溶菌酶、β-乳球蛋白、血红蛋白、牛血清白蛋白(bsa)。236.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的任何一种rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在没有拥挤剂的情况下实施。237.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的任何一种rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在有拥挤剂的情况下实施。238.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的任何一种rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在有拥挤剂的情况下实施，其中，以增强了由idr-大分子或idr-多肽提供的生化反应效率的提高的浓度提供拥挤剂。239.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在有拥挤剂的情况下实施，其中，以对由idr-大分子或idr-多肽提供的生化反应的效率提供累加效应的浓度提供拥挤剂。240.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的任何一种rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在有拥挤剂的情况下实施，其中，以对由idr-大分子或idr-多肽提供的生化反应的效率提供协同效应的浓度提供拥挤剂。241.在本发明的任何一种方法、工艺和用途中，包括在本发明的任何一种rpa方法、工艺和用途中，该方法、工艺和用途可以在有拥挤剂的情况下实施，其中，将idr-大分子或idr-多肽引入生化反应系统降低了在没有将idr-大分子或idr-多肽引入生化反应系统的情况下实现生化反应效率的相同提高所需的拥挤剂浓度。242.在可以在有拥挤剂的情况下实施的上述任何一种方法、工艺和用途中，拥挤剂可以以低于其正常生物效应(空间排斥/限制效应)发生时的浓度存在。243.在可以在有拥挤剂的情况下实施的上述任何一种方法、工艺和用途中，拥挤剂可以以低于反应体积或反应重量的约3％，低于反应体积或反应重量的约2％，低于反应体积或反应重量的约1％，或低于反应体积或反应重量的约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的浓度存在。244.如果用于本发明的任何一种方法、工艺和用途，包括rpa反应方法，那么可以使用任何合适的拥挤剂。本文提供了合适的拥挤剂的示例。245.包含固有无序区域(idr)的大分子或多肽246.如本文所描述的，本发明的方法、工艺和试剂涉及“idr-大分子”，包括“idr-标记的大分子”。如本文所描述的，本发明的方法、工艺和试剂涉及“idr-多肽”，包括“idr-标记的多肽”。任何此类idr-大分子、idr-标记的大分子、idr-多肽或idr-标记的多肽在本文中可互换地称为idr试剂或基于idr的试剂。247.如本文所使用的idr-大分子或idr-多肽或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽为包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的任何大分子或多肽或蛋白质。248.如本文所使用的idr-大分子或idr-多肽或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽为包含由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的氨基酸序列的任何大分子或多肽或蛋白质。249.因此，如本文所指的idr-大分子或idr-多肽可以指：包含氨基酸序列的大分子或多肽，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域组成；或包含氨基酸序列的大分子或多肽，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域。250.另外，如本文所指的包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的idr-大分子，可以是被氨基酸序列标记的感兴趣的大分子，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)。这种idr-标记的大分子也是本文定义的idr试剂。如本文所指的包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的idr-标记的多肽，可以是被氨基酸序列标记的感兴趣的多肽，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)。这种idr-标记的多肽也是本文定义的idr试剂。251.如本文所使用的，idr-标记的大分子或idr-标记的多肽是被氨基酸序列“标记的”任何大分子或多肽或蛋白质，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)。252.因此，如本文所指的idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以指：被氨基酸序列标记的大分子或多肽，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域组成；或被氨基酸序列标记的大分子或多肽，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域。253.由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的标记的氨基酸序列在其标记位置处所标记的大分子或多肽或蛋白质中不是天然存在或通常存在的。因此，与它标记的大分子或多肽或蛋白质相比，由一个或多个功能性固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的标记的氨基酸序列可以被认为是外源性氨基酸序列。因此，标记的大分子或多肽或蛋白质可以被认为是非天然存在的、人工的或基因工程化的大分子、多肽或蛋白质。254.本文进一步解释了氨基酸序列可以被“标记”至多肽和其它大分子的机制。255.任何一个或多个功能性固有无序区域(idr)都可以被标记至大分子或多肽或蛋白质，包括本文公开的任何一种或多种特定idr氨基酸标签序列，或其任何一个或多个功能性变体、类似物、同源物或衍生物。256.对于在本发明中的使用，固有无序区域多肽序列及其结构域都应当是“功能性的”。术语“功能性的”是指任何idr氨基酸序列应当具有本文进一步概述的功能性质之一。257.术语“固有无序区域”为技术领域中常用的本领域所理解的术语。对于全面综述，参见：classification of intrinsically disordered regions and proteins,van der lee et al.,2014,chem.rev.114,pp 6589-6631。258.本发明尤其提供了一种在水性体外反应系统中实施生化反应的方法，其中，生化反应取决于至少一种反应大分子的功能，任选地取决于至少一种反应多肽的功能，方法包括：在适于实施反应的条件下将至少一种idr-大分子引入体外反应系统，其中，至少一种idr-大分子包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)，其中，在将至少一种idr-大分子引入体外反应系统后，生化反应的效率因至少一种idr-大分子而提高。idr-大分子的一个或多个功能性idr提高了生化反应的效率。在任何此类方法中，至少一种idr-大分子可以是至少一种idr-多肽。在任何此类方法中，包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的idr-大分子或idr-多肽可以不是生化反应依赖于其功能的“反应大分子”或“反应多肽”。因此，在任何此类方法中，idr-大分子或idr-多肽本身在生化反应中可以不具备固有的生化作用。然而，将其引入反应系统会导致生化反应的效率的提高。259.在体外反应系统中实施生化反应的方法可以是这样的方法，其中，生化反应取决于至少一种idr-大分子的功能，其中，在将其引入体外反应系统后，至少一种idr-大分子在生化反应中实施其反应功能并且提高反应的效率。在任何此类方法中，至少一种idr-大分子可以是至少一种idr-多肽。在任何此类方法中，idr-大分子或idr-多肽本身在生化反应中确实具备固有的生化作用。因此，包含一个或多个功能性固有无序区域(idr)的至少一种idr-大分子或idr-多肽是生化反应依赖于其功能的“反应大分子”或“反应多肽”。260.至少一种idr-大分子或idr-多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域或由一个或多个功能性固有无序区域组成。在适于实施生化反应的条件下将idr-大分子或idr-多肽引入生化反应系统。由于一个或多个功能性固有无序区域的存在，idr-大分子或idr-多肽提高了反应的效率。261.通过提高反应的效率，这意味着与在没有包含一个或多个功能性固有无序区域或由一个或多个功能性固有无序区域组成的氨基酸序列的情况下提供idr-大分子或idr-多肽时观察到的反应的效率相比，该反应的效率得到提高。通过比较测试有和没有idr氨基酸序列的反应大分子或多肽，可以容易地确定这种提高。262.在本发明的任何一种方法中，idr-大分子或idr-多肽的一个或多个功能性固有无序区域促进/导致反应系统中的液-液分层，从而导致相分离。可以容易地确定导致反应系统中相分离的促进液-液分层的功能性能力，例如通过进行如本文所描述的相分离测定。这种液-液分层促进了相分离，并且这可以导致在反应系统中形成相分离的隔室，如可检测的颗粒，例如在显微观察下，如本文进一步详述的。263.idr-大分子或idr-多肽可以具有或不具有催化活性。例如，idr-多肽可以具有催化活性，如在重组酶聚合酶扩增反应中使用的聚合酶，如本文进一步描述的。idr-多肽可以不具有催化活性，如在重组酶聚合酶扩增反应中使用的单链稳定剂，例如本文进一步描述的gp32。264.如本文进一步讨论的，无论idr-大分子或idr-多肽是否具有催化活性，idr-大分子或idr-多肽可以具有生化反应所需的或影响生化反应的功能，使得在生化反应系统中没有idr-大分子或idr-多肽的情况下，生化反应不能继续进行或以降低的效率继续进行。可替代地，如本文进一步讨论的，idr-大分子或idr-多肽本身可以不具有生化反应所需的或影响生化反应的任何功能。然而，由于idr氨基酸序列，与在没有idr-大分子或idr-多肽的情况下观察到的效率，或在没有idr氨基酸序列的相同大分子或多肽存在的情况下观察到的效率相比，将idr-大分子或idr-多肽引入生化反应系统导致生化反应的效率的提高。265.idr多肽的结构性质266.通过结构分析可以容易地确定氨基酸序列中idr的存在。大量基于生物信息学的平台可用于预测多肽和蛋白质中idr的存在。这些包括elm、minimotif、slimprints、phylo-hmm、dilimot、slimfinder、phospho.elm、phosphosite、phosida、scansite、netphorest、networkin、phosphonet、ideal、morfpred、anchor、pfam、ffpred、disprot、d2p2和metadisorder。这些方法中的任何一种都可以用于鉴定idr氨基酸序列。如有必要，可测试no.2的那些位置相同。如果至少80％的位置是相同的，那么测试序列与seq id no.2具有至少80％同一性。如果序列比seq id no.2短，则空位或缺失位置应当被认为是不同的位置。276.本领域技术人员知晓可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的不同计算机程序。例如，可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。可以确定两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比，例如，使用needleman和wunsch(1970)算法，其已被合并到accelrys gcg软件包中的gap程序中(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)，使用blosum 62矩阵或pam250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，而长度权重为1、2、3、4、5或6。277.seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列的功能性变体可以是分别与seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列相比具有更少的氨基酸数量而不同的氨基酸序列(即功能性变体较短)，或分别与seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列相比具有更多的氨基酸数量而不同的氨基酸序列(即功能性变体较长)。因此，与参考氨基酸序列相比，功能性变体可以含有一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个插入。变体与参考序列不同的功能性变体氨基酸序列中的氨基酸数量可以是1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多个或者20个或更多。278.seq id no 1至43中任一个的氨基酸序列的功能性变体例如可以包含表1中所列的序列所示的氨基酸残基的保守氨基酸替换。例如可以根据下表进行保守替换，该表描述了普遍接受的氨基酸的分组。因此，与参考氨基酸序列相比，功能性变体可以含有保守氨基酸替换。与参考序列相比，功能性变体氨基酸序列中作为保守氨基酸替换的氨基酸的数量可以是1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多个或者20个或更多。[0279][0280]可以容易地确定给定变体是否保持idr功能性质，例如通过本文进一步描述的方法。[0281][0282][0283][0284][0285][0286][0287][0288][0289][0290][0291]在氨基酸的情况下，可以进行对等(like-for-like)替换，如碱性替换碱性、酸性替换酸性、极性替换极性等。也可以发生非同源替换，即从一类残基到另一类残基，或可替代地涉及包括非天然氨基酸，如鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸、正亮氨酸鸟氨酸、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。[0292]本文公开的特定idr氨基酸序列(见表1)可以大致分类为4组。一些idr序列可以分类为大于1组。rgg/rg组包括富含fg/yg的idr序列。该组包括fib、hnrpna1、ddx、hrp1和sup。聚q组包括富含q/n的idr序列。该组包括pcf11、ent-1、hrp1、sup、his4、his8和his10。聚p组包括富含p的序列。该组包括his4、his9和his10。聚h组包括富含h的序列。该组包括his1-11。idr氨基酸序列的一些关键特征为它们表现出阳离子-π相互作用和π-π相互作用，并且能够形成酰胺桥和盐桥。优选的idr氨基酸序列的关键特征和关键分子间/分子内相互作用如下表2至20中所示。[0293]表2[0294][0295]表3[0296][0297][0298]表4[0299][0300]表5[0301][0302][0303]表6[0304][0305]表7[0306][0307]表8[0308][0309]表9[0310][0311]表10[0312][0313][0314]表11[0315][0316]表12[0317][0318]表13[0319][0320]表14[0321][0322]表15[0323][0324][0325]表16[0326][0327]表17[0328][0329]表18[0330][0331][0332]表19[0333][0334]表20[0335][0336][0337]idr-大分子或idr-多肽的功能性质[0338]如本文定义的idr-标记的大分子或多肽、或idr-大分子或idr-多肽应当具有由一个或多个功能性idr组成或包含一个或多个功能性idr的氨基酸序列以用于本发明的方法。可以通过常规方法确定此类idr氨基酸序列或结构域是否为功能性的，如本文所描述的那些方法。[0339]颗粒形成[0340]发明人意外地发现，idr-标记的多肽或idr-多肽能够在合适的溶液中形成颗粒。这被认为是由idr氨基酸序列介导的在溶液混合物内通过导致流体的相分离的液-液分层而发生的。[0341]由idr氨基酸序列介导的颗粒的形成在以下实施例中进一步描述。颗粒表现出球形外观并且可以描述为“小球(globules)”、“球形粒(globular foci)”或“颗粒”。[0342]本文提及的术语“颗粒”、“小球”或“球形粒”旨在为同义的并且可以互换使用。允许观察和检测颗粒的条件和方法在本文中列出，包括在以下实施例中。[0343]在本文描述的实施例中，观察到颗粒形成发生在简单的系统中，该系统仅包含idr-标记的多肽和二价金属阳离子的溶液。还发现颗粒形成发生在更复杂的混合物中，包括包含rpa所需组分的那些混合物，其中，rpa蛋白质组分中的一种(gp32)为idr-标记的。在这些情况下，观察到反应组分与颗粒强烈地共定位，例如，通过连接至其的荧光标记探针检测的寡核苷酸中观察到颗粒是密集的，以及包含所有其它rpa反应蛋白组分。[0344]可以使用任何合适的方法以及以下实施例中列出的方法来实施颗粒的检测与监测。示例性方法包括显微术、光散射、流式细胞术以及微流体方法。[0345]可以使用显微术检测颗粒，例如微分干涉对比(differential interference contrast)或荧光显微术，以在高放大倍率下直接观察颗粒。在计算机的帮助下，可以自动获取并分析显微镜图像。此外，显微术可以允许连续或频繁监测至少一部分含有颗粒的混合物。[0346]可以使用流式细胞术检测颗粒。在流式细胞术中，一个或多个光束，例如每个单一波长的光束，被引导到流体动力学聚焦的流体流上。穿过光束的悬浮颗粒散射光，并且在颗粒中发现或附着于颗粒的荧光化学物质可被激发。散射光和/或荧光由装置内的检测器分析，从中可以确定有关颗粒尺寸和荧光的信息。现代流式细胞仪每秒可以“实时”分析数千个颗粒，并且可以主动分开并隔离具有特定性质的颗粒。[0347]例如，可以使用如美国专利申请公开号us2009/0079963和us2010/0179068以及国际专利申请公开号wo2009/112594中公开的细胞计数方法、装置和系统来检测颗粒。[0348]可以使用微流体方法、装置和系统来检测颗粒。例如，可以使用芯片实验室(lab-on-a-chip)装置或系统等检测颗粒(例如，参见美国专利申请公开号us2009/0326903和us2009/0297733)。[0349]颗粒尺寸可以约为0.5-20μm，例如，介于选自0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18和20μm中的任意两个尺寸之间(例如，尺寸约为1-10μm)。[0350]颗粒的浓度可以是约10-5000个颗粒/nl，例如，可以检测介于选自10、20、50、100、200、500、1000、2000和5000个颗粒/nl中的任意两个颗粒数之间(例如，约100-500个颗粒/nl)。颗粒的浓度可以是约200-400个颗粒每纳升。[0351]这种相分离的颗粒的尺寸可以小于约0.5μm。可以通过溶液的浊度的变化来检测相分离的颗粒，包括那些尺寸小于约0.5μm的颗粒。溶液的浊度的变化可以通过标准方式测量，并且通常可以根据formazin浊度单位(formazin turbidity unit，ftu)或formazin比浊单位(formazin nephelometric unit，fnu)进行量化。其它方法包括尺寸排阻色谱法，包括多角度光散射(sec-mals)。[0352]idr功能的实验测定[0353]如本文所定义的idr-大分子或idr-多肽，或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽可以确定具有功能性固有无序区域(idr)氨基酸序列和/或其结构域，因此通过例如使用如下所描述的相分离测定方法或rpa测定法，可用于本发明的方法和试剂中。[0354]因此，idr-大分子、idr-多肽或idr-标记的大分子或idr-标记的多肽是包含氨基酸序列或被氨基酸序列标记的大分子或多肽，所述氨基酸序列由一个或多个功能性固有无序区域组成；或者是被氨基酸序列标记的大分子或多肽，所述氨基酸序列包含一个或多个功能性固有无序区域。在所有情况下，功能性固有无序区域是可以在下文描述的相分离测定方法和/或如下描述的rpa测定方法中被确定为功能性的区域。[0355]相分离测定方法[0356]相分离测定方法为这样的方法，其包括：[0357]1.将一个或多个固有无序区域氨基酸序列标记至多肽以生成idr-多肽融合蛋白，优选标记至重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32蛋白以生成gp32-idr融合蛋白，并且提供纯化的idr-多肽融合蛋白；[0358]2.将idr-多肽融合蛋白添加至一定体积的水至终浓度1000ng/μl，其中，混合物的终体积为50μl，并且优选添加二价金属阳离子至终浓度为2mm或更高，更优选地其中，二价金属阳离子为mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+；[0359]3.涡旋混合物，然后脉冲离心该混合物；[0360]4.将10μl混合物上清液的样本转移至血细胞计数器载玻片；[0361]5.在×400放大倍率的显微镜下查看血细胞计数器载玻片；[0362]6.观察混合物中颗粒的形成；[0363]7.在混合物中没有颗粒的情况下，重复步骤1至6并递增地提高二价金属阳离子的浓度，直到观察到混合物中颗粒的形成；[0364]8.计数×400放大倍率下在218μm×175μm放大区域中形成的颗粒的数量；并且[0365]9.(i)当在放大区域中计数10个或更多颗粒时，优选当在放大区域中计数50个或更多颗粒时，更优选当在放大区域中计数100个或更多颗粒时，确定由一个或多个固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个固有无序区域(idr)的氨基酸序列是功能性的；或[0366](ii)如果二价金属阳离子的浓度提高至100mm或更高，并且在放大区域中没有观察到颗粒形成，或在放大区域中计数少于10个颗粒，则确定由一个或多个固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个固有无序区域(idr)的氨基酸序列是非功能性的。[0367]在上述方法中，如果需要检查提供二价金属阳离子对颗粒形成的影响，步骤2可以包括将二价金属阳离子添加至任何所需的终浓度。因此可以检查二价金属阳离子的不同浓度的影响。[0368]在上述方法中，如果需要检查提供atp对颗粒形成的影响，步骤2可以包括将atp添加至任何所需的终浓度。因此可以检查atp的不同浓度的影响。atp可以例如以1mm至3.5mm的浓度提供，例如1mm至2mm。[0369]步骤2可以包括添加可检测的核酸分子，并且其中，步骤8包括通过检测装置计数颗粒的数量。例如，步骤2可以包括添加被fam(荧光素)标记的具有seq id no：104所示的核酸序列的探针，并且步骤8可以包括通过荧光检测颗粒。可检测的核酸分子可以添加至任何合适的终浓度，如0.5μm。[0370]因此，上述测定可以用于检查反应效率、导致液-液分层的能力以及导致分子在多个相分离的水性隔室(颗粒)中共定位的能力。[0371]在上述方法中，如果二价金属阳离子为mg2+，那么阳离子的来源优选为mgoac。如果二价金属阳离子为ca2+，那么阳离子的来源优选为cacl2。如果二价金属阳离子为mn2+，那么阳离子的来源优选为mncl2。[0372]rpa测定方法[0373]rpa测定方法是这样的方法，包括：[0374]1.将一个或多个固有无序区域多肽序列标记至gp32蛋白，优选重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32蛋白，以生成gp32-idr融合蛋白，并且提供纯化的gp32-idr融合蛋白；[0375]2.生成一种反应混合物，其包括：[0376]a.tris hcl ph 8.3，25mm；[0377]b.koac，7.5mm；[0378]c.dtt，1mm；[0379]d.atp，2.5mm；[0380]e.磷酸肌酸，20mm；[0381]f.肌酸激酶，1μm；[0382]g.dntp，1mm；[0383]h.纯化的gp32-idr融合蛋白，20μm；[0384]i.纯化的uvsx，4.8μm[0385]j.纯化的uvsy，8.6μm[0386]k.金黄色葡萄球菌dna聚合酶1(sau)，0.135μm[0387]l.核酸外切酶iii，0.27μm[0388]m.正向引物，0.4μm[0389]n.反向引物，0.4μm[0390]o.探针，0.12μm[0391]3.通过向反应混合物中添加33mm mgoac和模板核酸的10个拷贝启动重组酶聚合酶扩增反应；[0392]4.将反应混合物于39℃在荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合；[0393]5.(i)以模板依赖性方式当与基线相比时，通过可测量的荧光增加在15分钟内可检测到扩增产物的2倍或更多增加时，确定一个或多个固有无序区域多肽序列是功能性的；或[0394](ii)当15分钟后通过荧光没有检测到扩增产物时，确定一个或多个固有无序区域多肽序列是非功能性的。[0395]在上述方法中，正向引物序列为：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no:98)；反向引物序列为：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no:99)；探针序列为：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaaggattgga(seq id no:100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，bhq为黑洞淬灭剂(black hole quencher)；并且，模板为单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes)基因组dna。[0396]上述rpa测定方法的步骤5可替代地包括：当以模板依赖性方式与基线相比时通过可测量的荧光增加在15分钟内可检测到扩增产物的5倍或更多增加时，或当可检测到10倍或更多增加时，或20倍或更多增加，或30倍或更多增加，或40倍或更多增加，或50倍或更多增加，或100倍或更多增加，或150倍或更多增加，或200倍或更多增加，或250倍或更多增加，或300倍或更多增加，或350倍或更多增加，或400倍或更多增加，或450倍或更多增加，或500倍或更多增加，或1000倍或更多增加，或2000倍或更多增加，或3000倍或更多增加，或4000倍或更多增加，或5000倍或更多增加时，则确定一个或多个固有无序区域多肽序列是功能性的。扩增产物超过基线的增加意味着：与通过在相同条件下(除了其中gp32蛋白尚未被一个或多个固有无序区域多肽序列标记之外)实施反应获得的扩增产物的量相比，扩增产物的增加。[0397]在上述方法中，如果需要检查提供二价金属阳离子对反应效率的影响，步骤3可以包括将二价金属阳离子添加至任何所需的终浓度。因此可以检查二价金属阳离子的不同浓度的影响。[0398]在上述方法中，如果需要检查提供atp对反应效率的影响，步骤2可以包括将atp添加至任何所需的终浓度。因此可以检查atp的不同浓度的影响。atp可以例如以1mm至3.5mm的浓度提供，例如1mm至2mm。[0399]将idr氨基酸序列标记至大分子和多肽[0400]本发明的方法、工艺和试剂尤其涉及idr-标记的大分子和idr-标记的多肽，其中，idr-标记的大分子或idr-标记的多肽是被氨基酸序列标记的感兴趣的大分子或多肽(其可在本文中被称为idr部分)，该氨基酸序列由一个或多个固有无序区域(idr)组成或包含一个或多个固有无序区域(idr)。[0401]术语“标签(tag)”或“标记(tagging)”应以其最广泛的意义来理解。该术语应理解为是指idr部分，即由一个或多个功能性idr组成或包含一个或多个功能性idr的氨基酸序列，其以任何合适的方式与感兴趣的大分子或多肽连接、拴系、结合或联合。[0402]将idr部分标记至感兴趣的多肽的最优选方式是通过生成重组基因融合蛋白，其中，感兴趣的多肽在核苷酸水平上被基因工程化，使得当转录和翻译时，表达的蛋白质包含感兴趣的多肽和idr部分。[0403]如果需要，可以将接头置于感兴趣的多肽与idr部分之间。例如，柔性、刚性和可切割的接头在本领域中是众所周知的并且广泛用于制备融合蛋白(例如，参见：fusion protein linkers:property,design and functionality,chen,x.,et al.2013,adv.drug deliv.rev.,15,65(10),pp1357–1369)。[0404]基因工程的标准方法是本领域众所周知的(例如，参见sambrook et al.,2001,molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition,cold spring harbour laboratory press；and current protocols in molecular biology,greene publishing and wiley-lnterscience,new york(1995))，蛋白质表达和纯化的方法也是如此。[0405]可以将idr部分标记至感兴趣的大分子或多肽的其它方式是通过一个或多个共价键或通过亲和相互作用。[0406]idr部分可以以任何合适的取向标记至多肽，如在感兴趣的多肽的n端，在感兴趣的多肽的c端，或感兴趣的多肽可以在其n端与c端、或沿多肽的长度的任何氨基酸位置包含idr部分。[0407]通过使用本技术领域中众所周知的方法，肽/寡肽/多肽/蛋白质可以连接/拴系缀合至其它大分子，包括其它肽/寡肽/多肽/蛋白质。[0408]一种此类方法为“点击化学(click chemistry)”。术语“点击化学”通常用于描述在铜催化剂存在下叠氮化物与炔烃生成1,5-二取代1,2,3-三唑的反应。点击化学允许肽/寡肽/多肽/蛋白质缀合至大量其它大分子，包括其它肽/寡肽/多肽/蛋白质，以及例如碳水化合物、核酸、聚合物、药物、适体、水凝胶等。该方法也称为“cuaac”(cu催化的炔烃叠氮化物环加成反应)(例如，参见“click”reactions:a versatile toolbox for the synthesis of peptide-conjugates.tang,w.et al.,2014,chem.soc.rev.,43,pp7013-7039)。[0409]许多其它连接剂/交联剂化学物质可用于将肽/寡肽/多肽/蛋白质缀合至其它大分子，如包含与胺反应的马来酰亚胺、巯基反应基或琥珀酰亚胺酯(通常被称为nhs酯)的交联剂。例如，琥珀酰亚胺可以用于在蛋白质或肽与塑料材料之间形成共价键。[0410]可以使用通常用于在多肽和非多肽分子之间生成缀合物的标准化学物质，如用于生成抗体-药物缀合物的化学物质。许多此类技术在本技术领域中是众所周知的。[0411]也可以使用基于亲和性的相互作用。例如，由一个或多个功能性固有无序区域组成或包含一个或多个功能性固有无序区域的氨基酸序列可以通过基于亲和性的相互作用(如链霉亲和素-生物素、受体-配体相互作用等)连接/拴系至感兴趣的大分子或多肽。[0412]用于idr氨基酸序列功能的多价金属阳离子[0413]当本文描述和定义的idr-大分子或idr-多肽用于体外生化反应时，体外生化反应缓冲液优选含有多价金属阳离子，优选二价金属阳离子。[0414]反应缓冲液中多价/二价金属阳离子的存在有助于促进和增强液-液分层，从而导致在体外生化反应环境中由idr-大分子或idr-多肽介导/导致的相分离。[0415]如通过本文公开和定义的技术，可以容易地确定二价金属阳离子增强在体外生化反应环境中由idr-大分子或idr-多肽介导/导致的相分离的功能性能力。特别是，如本文进一步描述和定义的，这种功能性能力可以通过以idr依赖性方式在体外生化反应环境中的多价/二价金属阳离子诱导球形粒或颗粒的形成的能力来确定，例如通过本文描述的测定确定。[0416]优选使用二价金属阳离子来促进/增强idr依赖性的液-液分层，从而导致相分离。然而，设想了任何多价或任何二价金属阳离子的功能性等效物。如本文描述的多价/二价金属阳离子的功能性等效物为在体外生化反应环境中可以替代二价金属阳离子以促进idr依赖性液-液分层从而导致相分离的任何试剂，例如通过本文描述的测定确定的。[0417]可以使用任何合适的多价/二价金属阳离子，作为单一试剂或试剂的组合并且任选地在螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)或次氮基三乙酸(nta))的存在下。[0418]二价金属阳离子可以是mg2+、mn2+、ca2+、co2+、ni2+或cu2+。这些阳离子中的任何一种可以用作单一试剂，或可以使用阳离子的任何组合。优选地，它们被用作单一试剂。优选的二价金属阳离子为mg2+、mn2+和ca2+。[0419]在体外生化反应环境中，在促进idr介导的相分离方面达到最佳结果的特定多价/二价金属阳离子，以及使用的多价/二价金属阳离子的特定浓度可以取决于用于标记感兴趣的大分子或多肽的特定固有无序区域氨基酸序列。可以使用常规测试凭经验确定最佳多价/二价金属阳离子和最佳浓度。如本文进一步描述的相分离测定可以用于此目的。[0420]多价/二价金属阳离子的优选浓度范围为约300μm至约100mm、约300μm至约50mm、约400μm至约50mm、约400μm至约20mm、约400μm至约30mm、约500μm至约10mm、约500μm至约25mm以及约1mm至约35mm。[0421]体外生化反应缓冲液可以含有mg2+离子。优选的浓度范围为约300μm至约100mm，更优选约400μm至约50mm，还更优选约500μm至约40mm，甚至更优选约25mm至约35mm，如33mm。优选地，缓冲液以指示的浓度含有mgoac。[0422]体外生化反应缓冲液可以含有ca2+离子。优选的浓度范围为约300μm至约100mm，更优选约400μm至约50mm，还更优选约1mm至约40mm，甚至更优选约25mm至约35mm，如33mm。优选地，缓冲液以指示的浓度含有cacl2。[0423]体外生化反应缓冲液可以含有mn2+离子。优选的浓度范围为约300μm至约50mm，更优选约400μm至约50mm，还更优选约500μm至约40mm，甚至更优选约25mm至约35mm，如33mm。优选地，缓冲液以指示的浓度含有mncl2。[0424]重组酶聚合酶扩增(rpa)[0425]重组酶聚合酶扩增(rpa)是一种用于恒温扩增核酸的方法。一般而言，在rpa的第一步中，将重组酶剂与第一和第二核酸引物以及重组酶负载蛋白接触以形成第一和第二核蛋白引物。一般而言，在第二步中，第一和第二核蛋白引物与双链模板核酸接触以在模板核酸的第一链的第一部分形成第一双链结构，并且在模板核酸的第二链的第二部分形成第二双链结构，使得第一核酸引物和第二核酸引物的3'端在给定核酸分子上朝向彼此取向。一般而言，在第三步中，第一和第二核蛋白引物的3'端被聚合酶延伸，以生成第一和第二双链核酸以及第一和第二被置换的核酸的单链。使用单链稳定剂以稳定第一和第二被置换的核酸的单链。通常，可以重复第二步和第三步，直到达到所需的扩增程度。[0426]例如，rpa方法在美国专利号7,270,981，美国专利号7,399,590，美国专利号7,666,598，美国专利号7,435,561以及国际专利申请公开号wo2010/141940中广泛公开。此外，关于最近的综述，参见review：a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification,li,j.et al.,2019,analyst,144,pp31-67。[0427]重组酶剂[0428]rpa方法，包括本发明的那些，使用重组酶剂。[0429]本发明的一种或多种idr-多肽中的任何一种可以附着/拴系/标记至任何重组酶剂。[0430]重组酶剂为一种分子，通常是酶，它可以包被单链核酸，通常是dna(ssdna)以形成核蛋白丝状体。然后，此类丝状体能够“扫描”双链核酸分子，通常是dna(dsdna)用于序列同源性/互补性的区域。当定位互补序列时，核蛋白丝状体(包含重组酶剂)链侵入双链核酸分子，生成短杂交体和被称为d环的置换链泡。[0431]任何合适的重组酶剂都可以用于本文描述的rpa方法，并且可以用本文描述的任何idr氨基酸序列进行标记。[0432]重组酶剂可以来源于原核生物、真核生物或病毒生物。[0433]重组酶剂可以是reca、uvsx、rada、radb、rad 51或任何这些蛋白质的任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物。[0434]可以使用这些蛋白质的任何组合。[0435]合适的重组酶剂包括大肠杆菌reca蛋白、t4 uvsx蛋白或来自任何类群(phyla)的任何同源蛋白或蛋白复合物。[0436]真核reca同源物通常在待鉴定的该组的第一个成员后命名为rad51。可以使用其它非同源重组酶剂代替reca，例如使用rect或reco。[0437]示例性的重组酶剂包括reca和uvsx，及其片段或突变体和其组合。reca和uvsx蛋白可以从任何物种中获得。也可以使用可获得的reca和uvss蛋白和核酸序列以及分子生物学技术来生成reca和uvsx片段或突变蛋白。示例性的uvsx蛋白包括来源于肌病毒科(myoviridae)噬菌体的那些，如t4、t2、t6、rb69、aeh1、kvp40、不动杆菌噬菌体(acinetobacter phage)133、气单孢菌噬菌体(aeromonas phage)65、噬藻体p-ssm2、噬藻体pssm4、噬藻体s-pm2、rb14、rb32、气单孢菌噬菌体25、弧菌噬菌体(vibrio phage)nt-1、phi-1、rb16、rb43、噬菌体31、噬菌体44rr2.81、rb49、噬菌体rb3和噬菌体lz2。其它示例性重组酶剂包括古细菌rada和radb蛋白以及真核(例如，植物、哺乳动物和真菌)rad51蛋白(例如，rad51、rad51b、rad51c、rad51d、dmc1、xrcc2、xrcc3和reca)。[0438]重组酶剂优选为uvsx、t4 uvsx、t6 uvsx、rb18 uvsx、大肠杆菌噬菌体wv7 uvsx、志贺氏菌噬菌体(shigella phage)cb8 uvsx、志贺氏菌噬菌体shfl2 uvsx、大肠杆菌噬菌体ar1 uvsx、噬菌体vb_ecom_g4507 uvsx、志贺氏菌噬菌体shfml-11uvsx、埃希氏菌噬菌体(escherichia phage)vb_ecom_dalca uvsx、大肠杆菌reca、大肠杆菌rada、大肠杆菌radb、大肠杆菌rad 51或其任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物，或它们的任何组合。特别优选的重组酶剂为埃希氏菌噬菌体vb_ecom_dalca uvsx。[0439]重组酶剂还可以包含酸性残基的c端缺失以提高其活性。[0440]上述重组酶剂的任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物本身也可以用作重组酶剂，并且这些功能性变体、类似物、同源物或衍生物也被考虑作为重组酶剂用于本文描述和定义的方法中。[0441]例如，一种来自reca的小肽，已被证明保留了reca的重组性质的某些方面。该肽包含大肠杆菌reca的第193至212位残基，并且可以介导单链寡核苷酸的配对。[0442]重组酶剂(例如，uvsx)可以是突变体或杂交重组酶剂。uvsx的突变体形式描述于美国专利号8,071,308中。突变体uvsx可以是rb69 uvsx，其包括rb69 uvsx氨基酸序列中的至少一个突变，其中，该突变选自由以下组成的组：在位置64不是组氨酸的氨基酸、在位置64的丝氨酸、在c端的一个或多个谷氨酸残基的添加、在c端的一个或多个天冬氨酸残基的添加，以及它们的组合。[0443]突变体uvsx可以是在t6 uvsx氨基酸序列中具有至少一个突变的t6 uvsx，其中，该突变选自由以下组成的组：(a)在位置66处不是组氨酸的氨基酸；(b)在位置66处的丝氨酸；(c)在c端的一个或多个谷氨酸残基的添加；(d)在c端的一个或多个天冬氨酸残基的添加；以及(e)它们的组合。在使用杂交重组酶剂的情况下，例如，杂交蛋白可以是uvsx蛋白，其包括至少一个区域，该区域包括来源于不同uvsx物种的氨基酸序列。例如，该区域可以是uvsx的dna结合环2区域。[0444]如果需要，重组酶剂可以是温度敏感的(本文称为“ts”)重组酶剂。如果使用ts重组酶剂，那么rpa反应可以在一个温度(允许温度)开始并在另一个温度(非允许温度)终止。例如，允许温度的组合可以是25℃/30℃、30℃/37℃、37℃/42℃等。ts蛋白可以是可逆的。当可逆的ts蛋白从非允许温度转换至允许温度时，它的活性就会恢复。[0445]虽然可以使用任何重组酶剂浓度，但优选的重组酶浓度可以是，例如，在0.2-12μm、6-12μm、4-12μm和4-6μm的范围内，优选约5μm，更优选约4.8μm。[0446]重组酶剂通常需要atp、atpγs或其它核苷三磷酸或其类似物的存在。优选地，重组酶剂用于反应环境中，其中靶向位点的再生可以在一轮d环刺激的合成后不久发生。涉及重组酶分解的完成的重组事件将避免由从一端到另一端的单侧合成振荡导致的扩增停滞(stalling)或非常低效率的ssdna的线性扩增。[0447]用包含固有无序区域的氨基酸标签序列标记的示例性uvsx重组酶剂列于下表21中。[0448]表21[0449][0450][0451][0452][0453][0454][0455][0456][0457]重组酶负载蛋白[0458]rpa方法，包括本发明的那些，可以另外包括/使用重组酶负载蛋白。[0459]任何合适的重组酶负载蛋白均可以用于本文描述的rpa方法。[0460]本发明的一种或多种idr-多肽中的任何一种都可以附着/拴系/标记至任何重组酶负载蛋白。[0461]重组酶负载蛋白可以来源于原核、病毒或真核生物。示例性的重组酶负载蛋白包括大肠杆菌reco、大肠杆菌recr、uvsy及其突变体或片段，或它们的组合。示例性的uvsy蛋白包括来源于肌病毒科噬菌体的那些，如t4、t2、t6、rb69、aeh1、kvp40、不动杆菌噬菌体133、气单孢菌噬菌体65、噬藻体p-ssm2、噬藻体pssm4、噬藻体s-pm2、rb14、rb32、气单孢菌噬菌体25、弧菌噬菌体nt-1、phi-1、rb16、rb43、噬菌体31、噬菌体44rr2.8t、rb49、噬菌体rb3和噬菌体lz2。[0462]优选的重组酶负载蛋白为uvsy、大肠杆菌reco、大肠杆菌recr或任何这些蛋白质的任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物。特别优选的uvsy重组酶负载蛋白为埃希氏菌噬菌体sto uvsy。[0463]可以使用任何这些蛋白质的任何组合。[0464]这些蛋白质的优选浓度为0.1-24μm、6-24μm、4-24μm和4-12μm，优选约10μm，更优选约8.6μm。重组酶负载蛋白可以以重组酶剂的微摩尔浓度的约0.5至约2倍存在。[0465]用包含固有无序区域的氨基酸标签序列标记的示例性uvsy重组酶负载蛋白列于下表22中。[0466]表22[0467][0468][0469]单链稳定剂[0470]rpa方法，包括本发明的那些，使用单链稳定剂。[0471]任何合适的单链稳定剂(单链dna结合蛋白)均可以用于本文描述的rpa方法。[0472]本发明的一种或多种idr-多肽中的任何一种都可以附着/拴系/标记至任何单链稳定剂。[0473]单链稳定剂用于在rpa反应过程中发生的各种交换反应期间稳定核酸。特别是，单链稳定剂用于稳定重组酶/ssdna核蛋白丝状体。[0474]单链稳定剂可以来源于或获得自任何物种，例如来自原核、病毒或真核的物种。[0475]单链稳定剂包括来自大肠杆菌的单链dna结合蛋白和来源于肌病毒科噬菌体的那些，如t4、t2、t6、rb69、aeh1、kvp40、不动杆菌噬菌体133、气单孢菌噬菌体65、噬藻体p-ssm2、噬藻体pssm4、噬藻体s-pm2、rb14、rb32、气单孢菌噬菌体25、弧菌噬菌体nt-1、phi-1、rb16、rb43、噬菌体31、噬菌体44rr2.8t、rb49、噬菌体rb3和噬菌体lz2。单链稳定剂的其它示例包括：反硝化产碱杆菌(a.denitrificans)alide_2047、泰国伯克霍尔德氏菌(burkholderia thailandensis)bthab_33951、prevotella pollens hmpref9144_0124，以及真核单链dna结合蛋白复制蛋白a。[0476]优选的单链稳定剂选自由以下组成的组：gp32、大肠杆菌ssb蛋白、噬菌体t4 gp32蛋白、噬菌体rb69 gp32、噬菌体vb_ecom_nbg1 gp32及其衍生物，以及它们的任何组合。特别优选的单链稳定剂为gp32，并且特别是噬菌体vb_ecom_nbg1 gp32。[0477]可以使用任何这些蛋白质的任何组合。[0478]单链稳定剂的一种优选浓度为约5-30μm，如约8.6μm，优选约15-25μm，更优选约20μm。[0479]用包含固有无序区域的氨基酸标签序列标记的示例性gp32单链稳定剂列于下表23中。[0480]表23[0481][0482][0483][0484][0485][0486][0487][0488][0489][0490]聚合酶[0491]rpa方法，包括本发明的那些，使用聚合酶。[0492]任何合适的聚合酶都可以用于本文描述的方法中。[0493]本发明的一种或多种idr-多肽中的任何一种都可以附着/拴系/标记至任何合适的聚合酶。[0494]为了dna的合成或扩增，优选使用dna聚合酶。[0495]rpa反应的一个优点是对可以使用的聚合酶的类型没有限制。例如，可以使用真核、原核和噬菌体聚合酶。[0496]dna聚合酶可以是真核聚合酶。可以使用的真核聚合酶的示例包括pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε或其任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物，以及它们的任何组合。[0497]dna聚合酶可以是原核聚合酶。可以使用的原核聚合酶的示例包括大肠杆菌dna聚合酶i klenow片段、大肠杆菌dna聚合酶i、大肠杆菌dna聚合酶ii、大肠杆菌dna聚合酶iii、大肠杆菌dna聚合酶iv、大肠杆菌dna聚合酶v、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothennophilus)聚合酶i大片段、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)pol i大片段(bsu聚合酶)、单核细胞增生李斯特氏菌dna聚合酶i、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)dna聚合酶1(sau)或其任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物，以及它们的任何组合。[0498]dna聚合酶可以是噬菌体聚合酶。可以用于本文描述的方法的噬菌体聚合酶的示例包括phi-29 dna聚合酶、t7 dna聚合酶、噬菌体t4 gp43 dna聚合酶或其任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物，以及它们的任何组合。[0499]dna聚合酶通常含有链置换性质。[0500]dna聚合酶可以使用侵入链的游离3'-羟基通过掺入新的核苷酸以催化dna合成。许多聚合酶可以使用侵入链的3'-羟基以催化合成，并且在合成发生的同时置换另一条链。例如，大肠杆菌聚合酶ii或iii可以用于延伸侵入的d环。另外，可以使用在大肠杆菌中通常用于sos损伤靶向突变的大肠杆菌聚合酶v。所有这些聚合酶都可以通过它们与β-二聚体夹以及单链dna结合蛋白(ssb)与其它组分的相互作用和协同而成为高度进行性的(processive)。来自原核生物、病毒和真核生物的其它聚合酶也可以用于延伸侵入链。[0501]许多dna聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性，并且有些还具有5'-3'核酸外切酶活性，这在rpa反应中是不可取的，因为随着聚合酶向前移动它会导致逐渐消化一条dna链，而非置换。[0502]3'-5'核酸外切酶具有潜在的优势和其明显的劣势。一方面，3'-5'核酸外切酶活性增加了复制反应的保真性，并且还可以防止聚合酶在错误掺入点处停滞。许多dna应用都需要高保真性扩增。3'-5'核酸外切酶活性也可以适于更大dna片段的扩增，其中由于错误掺入而造成的停滞可能抑制有效扩增。[0503]虽然3'-5'核酸外切酶活性具有这些明显的优势，但是也存在一些缺点。当采用具有3'-5'核酸外切酶的聚合酶时，游离的寡核苷酸可以进行末端依赖性降解。[0504]利用缺乏3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶可以降低反应噪音。这表明错误引发可能是由聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性缩短的寡核苷酸引起的。因此，3'-5'核酸外切酶编辑活性、焦磷酸化或任何其它类似的编辑活性都可以是噪音的来源。这可以通过使用饱和量的相对协同的gp32蛋白与一些聚合酶(如klenow片段)在很大程度上进行抑制。然而，可以提供用于本文描述的方法的聚合酶，其缺乏3'-5'核酸外切酶活性。[0505]dna聚合酶可以以10000单位/ml至10单位/ml的浓度存在，如5000单位/ml至500单位/ml。[0506]辅助剂[0507]rpa反应，包括本发明的那些，还可以利用辅助剂。[0508]本发明的一种或多种idr-多肽中的任何一种都可以连接/拴系/标记至任何辅助剂。[0509]这些辅助剂包括单链结合蛋白、解旋酶、拓扑异构酶、解离酶及其任何组合。此类试剂可以分别对核酸具有解旋、松弛和解离活性。[0510]辅助剂还可以包括ruva、ruvb、ruvc、recg、pria、prib、pric、dnat、dnab、dnac、dnag、dnax夹负载物、聚合酶核心复合物、dna连接酶和滑动夹(sliding clamp)及其任何组合。滑动夹可以是大肠杆菌β-二聚体滑动夹、真核pcna滑动夹或t4滑动夹gp45及其组合。另外，辅助剂可以包括由β-夹、dnax夹负载物和聚合酶核心复合物组成的dna聚合酶iii全酶复合物。后面的这些辅助剂会允许实施领先的和滞后的rpa。[0511]可以用一种或多种额外的酶实施rpa反应，该额外的酶可以在dna合成启动后促进重组酶剂/dsdna复合物的有效分解。这些酶包括那些能够促进3'-5'分解的酶和那些能够支持5'-3'分解的酶。[0512]此类额外的酶包括若干种聚合酶，其能够在3'-5'方向上置换reca并且能够促进重组酶剂/dsdna复合物的3'-5'分解。这些dna聚合酶包括大肠杆菌polv和其它物种的同源聚合酶。包含大肠杆菌polv或其任何功能性变体、类似物、同源物或衍生物可以提高扩增效率。[0513]其它酶包括称为解旋酶的一类酶，其可以用于促进reca从dsdna中分解。这些促进了5'-3'和3'-5'方向的分解。用于促进reca从中间体分解的理想的解旋酶复合物由大肠杆菌蛋白ruva和ruvb组成。ruvab复合物促进分支迁移(branch migration)，并且解离reca蛋白，从而允许reca被回收。将ruvab掺入rpa混合物中可以促进reca在链交换和置换后从dsdna解离，从而允许从相同位点重新合成重复的模板。另外，ruvab复合物能够与ruvc一起发挥作用，最终切割并解离霍利迪连结体(holliday junction)。将ruvc添加到rpa反应混合物中，可以解离复杂的结构，如在侵入位点形成的霍利迪连结体。[0514]其它酶包括大肠杆菌recg蛋白。recg能够促进分支结构的分解。[0515]在rpa反应混合物中有用的其它酶是那些允许在atp和单链稳定剂存在下连续生成reca核蛋白丝状体的酶。因此，可以使用reco和recr，以及任选的recf蛋白。[0516]rpa反应混合物中通常包含核酸外切酶。这些被包括用于可切割的探针的有效操作。常用的核酸外切酶的一个示例为核酸外切酶iii。本发明的任何idr多肽可以附着/拴系/标记至任何核酸外切酶。[0517]引物[0518]rpa方法采用聚合酶以生成模板核酸分子的拷贝。因此，rpa方法，包括本发明的那些，使用引物以启动通过聚合酶的延伸。[0519]大多数核酸聚合酶的必要条件是，掺入需要在与新合成位点相邻的一小段双链核酸的末端糖上的游离的3'-羟基部分。这段双链核酸通常由短寡核苷酸在模板上形成，该寡核苷酸通常具有互补序列，称为引物，其用作聚合酶合成反应的起始位点。在某些情况下，可以利用3'修饰(如巯基)来引发合成反应。与模板碱基配对并由聚合酶延伸的引物核酸可以是rna或dna。通常，对于体外反应，以短的、通常是化学合成的单链dna(或修饰的dna或rna)提供引物，并且通常称为寡核苷酸引物。引物通常具有特定序列，尽管也可以使用随机引物。引物凭借其特异性碱基配对能力靶向互补序列。寡核苷酸引物与靶核酸之间杂交体的形成通常通过在允许自发性退火的盐、ph和温度的条件下将两者在溶液中孵育来形成。[0520]在存在重组酶剂的情况下，rpa中使用的引物可以具有用于与靶dna杂交的单链区域。例如，该单链区域可以是约10个碱基、约15个碱基、约20个碱基、约25个碱基、约30个碱基、约40个碱基以及约50个碱基。理论上甚至可以使用更长的区域，如约75个碱基、约100个碱基、约150个碱基或更多。单链区域的选择将取决于起始核酸的复杂性，例如，使得人类基因组可以需要更长的引物，而质粒可以需要短得多的引物。[0521]优选的引物长度为约30至约50个碱基。例如，30-45个碱基、30-40个碱基、30-35个碱基、35-40个碱基、40-45个碱基以及45-50个碱基。虽然指示了上述引物长度，但是具有小于30个碱基的最佳引物长度的重组酶和/或单链结合蛋白也是可能的和可设想的。[0522]虽然pna和rna也适合用作引物，但是rpa中使用的引物优选为dna。值得注意的是，事实上，在自然dna复制中，dna聚合酶通过从rna引物延伸来延长基因组dna。[0523]可以根据标准技术合成引物。在某些情况下，修饰的碱基和/或接头主链化学物质可以是所需的和功能性的。另外，寡核苷酸可以在其末端(5'或3')被用于各种目的的基团修饰，例如荧光基、猝灭剂、保护(阻断)基(可逆或不可逆)、磁性标签、蛋白质等。在某些情况下，单链寡核苷酸可用于链侵入，在其它情况下仅可使用部分单链核酸，侵入核酸的5'段的序列已经杂交至寡核苷酸。[0524]引物可以包含与靶核酸不同源的5'区域。应当注意的是，即使引物与靶核酸不完全互补，也可以实现扩增。引物通过在它们的5'端具有额外的序列而可以是非互补的。例如，这些额外的序列可以是限制性核酸内切酶识别位点的序列或与测序引物互补的序列。限制性核酸内切酶识别位点可以用于扩增的序列的随后切割。还考虑使用在限制性核酸内切酶识别位点之外切割核酸的限制性核酸内切酶。与测序引物互补的序列可以允许使用市售的引物或市售的测序设备对扩增产物进行快速dna测序。[0525]用于设计用于体外dna合成反应的寡核苷酸的软件已经很成熟，特别是用于pcr的软件。有关rpa方法的考虑是类似的，并且包括优化寡核苷酸的熔解温度，避免寡核苷酸内形成发夹，以及针对与给定反应中存在的其它寡核苷酸的互补性进行选择。因此，设计寡核苷酸引物对以避免不可取的副反应是很重要的。[0526]包括优化寡核苷酸序列设计在内，还存在额外的方法以减少或消除引物二聚体形成。如本文其它地方所述，通过利用缺乏3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶可以降低反应噪音。这表明错误引发可能是由聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性缩短的寡核苷酸引起的。因此，3'-5'核酸外切酶编辑活性、焦磷酸化或任何其它类似的编辑活性都可以是噪音的来源。包括使用缺乏核酸外切酶活性的聚合酶和用焦磷酸酶去除焦磷酸酯在内，在最终和/或倒数第二个链接处使用具有不可水解主链的合成寡核苷酸可以有利于降低反应噪音。可替代的主链可以从可用的化学物质的相当大的范围中选择，如硫代磷酸酯(phosphorothiorate)、吗啉基(morpholino)、锁核酸(locked nucleic acid)或肽核酸。[0527]用于rpa反应的试剂[0528]下文概述了用于rpa方法的试剂，包括本发明的那些。[0529]dntp[0530]dntp，例如datp、dgtp、dctp和dttp及其衍生物和类似物，可以添加至rpa反应中。领先的和滞后的链rpa中，atp、gtp、ctp和utp也可以被纳入用于合成rna引物。另外，ddntp(ddatp、ddttp、ddgtp和ddgtp及其衍生物和类似物)可以用于生成片段梯。[0531]可以以每种ntp物种的1mm至200mm的浓度使用dntp。[0532]可以使用dntp和ddntp的混合物，其中ddntp的浓度为dntp的浓度(1mm至200mm)的1/100至1/1000。[0533]可以在存在atp、可水解atp类似物或另一种核苷三磷酸的情况下实施rpa。例如，atp类似物可以是datp、ddatp或另一种核苷三磷酸类似物，如utp。[0534]还原剂[0535]可以用于rpa反应的还原剂包括dtt。dtt浓度可以是1mm至10mm，优选1mm。[0536]atp[0537]atp或atp类似物可以用于rpa反应。[0538]atp或atp类似物可以是atp、atp-γ-s、atp-β-s、ddatp中的任一种或它们的组合。优选的atp或atp类似物的浓度为1mm至10mm，优选2.5mm。[0539]用于atp再生的系统[0540]rpa反应的其它组分可以包括用于atp再生的系统(即，将adp转化为atp的系统)。例如，此类系统可以是磷酸肌酸和肌酸激酶。[0541]atp再生系统允许持续的重组反应，因为重组酶在与核酸结合时具有极高的atp水解的速率。特别是，uvsx蛋白具有比reca高10-20倍的水解速率，并且每个单体每分钟可以消耗200个atp分子。许多系统是可用的。优选肌酸激酶/磷酸肌酸系统。当采用uvsx时，生成的amp可以转化为atp。可以另外使用鸡肌激酶，其将一分子amp与一个atp转化为两分子adp。然后，可以使用肌酸激酶/磷酸肌酸系统将adp转化为atp。atp再生不良可以降低反应速率。[0542]在本文描述的rpa方法中，磷酸肌酸优选以15-25mm的浓度使用，更优选20mm。肌酸激酶优选以约0.25-5.0μm的浓度使用，更优选1μm。[0543]多价金属阳离子[0544]rpa反应中的缓冲溶液优选含有多价金属阳离子。该缓冲液可以含有多价金属阳离子的功能性等效物。[0545]rpa反应中的缓冲溶液优选含有二价金属阳离子。该缓冲液可以含有二价金属阳离子的功能性等效物。[0546]可以使用任何合适的多价或二价金属阳离子或其功能性等效物，作为单一试剂或试剂的组合。[0547]在rpa反应中促进/增强idr-介导的相分离方面实现最佳结果的特定的多价或二价金属阳离子或其功能性等效物，以及所使用的多价/二价金属阳离子的特定浓度可以取决于所使用的特定idr多肽。可以使用常规测试(包括rpa反应本身和/或本文进一步描述的相分离测定)凭经验确定最佳的多价或二价金属阳离子或其功能性等效物，以及其最佳浓度。[0548]二价金属阳离子可以是mg2+、mn2+、ca2+、co2+、ni2+或cu2+。这些阳离子中的任何一种可以用作单一试剂，或可以使用阳离子的任何组合。优选地，它们被用作单一试剂。优选的二价金属阳离子为mg2+、mn2+和ca2+。特别优选的二价金属阳离子为mg2+。[0549]优选的浓度范围为30mm至40mm，更优选33mm至39mm。[0550]缓冲液可以含有mg2+离子，优选以指示的浓度。更优选地，缓冲液以指示的浓度含有mgoac。[0551]缓冲液可以含有ca2+离子，优选以指示的浓度。更优选地，缓冲液以指示的浓度含有cacl2。[0552]缓冲液可以含有mn2+离子，优选以指示的浓度。更优选地，缓冲液以指示的浓度含有mncl2。[0553]缓冲液[0554]rpa反应中的缓冲溶液可以是tris-hcl缓冲液、tris-乙酸盐缓冲液或它们的组合。缓冲液可以以约10mm至约100mm的浓度存在。优选的缓冲液是以约20mm至约30mm，最优选25mm的浓度使用的tris-hcl缓冲液。缓冲的ph可以是6.5至9.0，优选ph8.3。[0555]缓冲液可以含有约5mm至约50mm，优选约10mm至约40mm的乙酸钾。[0556]反应组分[0557]rpa反应的一组优选的但非限制性的反应组分如下。[0558][0559]rpa反应条件[0560]rpa反应，包括本发明的那些，可以孵育任何合适的时间长度。[0561]任何rpa反应都可以孵育5分钟至16小时或更长时间，如15分钟至3小时或30分钟至2小时。[0562]可以实施孵育直到实现所需的扩增程度。所需的扩增程度可以是10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍扩增。[0563]与需要热循环的技术(如pcr)相比，rpa的一个益处为反应可以在降低的温度下实施。rpa的另一个优点为温度不是关键，并且精确控制虽然是优选的，但不是绝对必要的。例如，在现场环境中，在室温或接近体温(35℃至38℃)足够孵育rpa反应，例如通过将样本置于身体缝隙(body crevice)中。此外，可以在没有模板核酸的温度诱导熔解的情况下实施rpa反应。[0564]因此，任何rpa反应都可以在任何合适的温度下实施。[0565]rpa反应可以在低于45℃实施。rpa反应可以在低于40℃实施。rpa反应可以在低于35℃实施。rpa反应可以在低于30℃实施。[0566]rpa反应可以在20℃至50℃、20℃至40℃、如20℃至30℃实施。[0567]rpa反应组分的冷冻干燥[0568]rpa反应的一个优点是试剂，可能除了拥挤剂(如果使用)和缓冲液之外，可以在使用前冷冻干燥(即冻干)。冷冻干燥的试剂提供了不需要冷藏以保持活性的优点。例如，一管rpa试剂可在室温下储存。此优点在冷藏受限的现场条件下特别有用。[0569]rpa试剂可以在管底部或在珠或任何其它合适类型的固体支持物上冷冻干燥。为了实施rpa反应，根据冻干试剂的组成，将冻干试剂在缓冲溶液和拥挤剂(如果使用)或简单的缓冲溶液或水中复原。然后，添加靶核酸或疑似含有靶核酸的样本。复原液也可以含有样本核酸。将复原的反应孵育一段时间并且检测扩增的核酸(如果存在)。[0570]在本文描述的任何一种rpa方法中，可在使用前被冷冻干燥的试剂至少包括：重组酶剂、重组酶负载蛋白、单链稳定剂、dna聚合酶、dntp或dntp和ddntp的混合物、还原剂、atp或atp类似物、引物和探针。[0571]稳定剂，如海藻糖，可以包括在冷冻干燥的混合物中，例如在复原反应中以20mm至200mm存在，最优选40mm至80mm，以改进冷冻干燥性能与保质期。如果需要，冷冻干燥的试剂可以在使用前储存1天、1周、1个月或1年或更长时间。[0572]生化反应试剂，如rpa试剂，可以与拥挤剂一起冷冻干燥。然而，可能存在复杂的相互关联的问题，这可能证明在冻干混合物中省略拥挤剂是合理的。例如，用户可能会在冷冻干燥的拥挤剂的有效再水化方面经历困难，或用户可能会经历其它不利影响，包括需要更大的冻干颗粒。因此，能够从冷冻干燥的材料中排除一些或全部拥挤剂可以是具有优势的，除了其它方面，其包括颗粒尺寸的减小、更短的循环时间和更容易再水化。然而，这具有随之而来的缺点，即如果使用拥挤剂，在生化反应混合物再水化并准备使用之后，需要在使用之前新鲜添加。这在某些情况下可能是有问题的，如在护理点使用或现场使用时。本发明的基于idr的试剂的优点是，预计它们不会在冻干设置中表现出与拥挤剂相同的缺点，因此可以容易地与其它生化反应组分一起冷冻干燥，因此避免在使用前添加新鲜的额外的试剂的需求。[0573]rpa反应产物的检测[0574]可以使用任何合适的方法实施rpa反应产物的检测。[0575]例如，可以在琼脂糖或page凝胶上使用电泳然后进行溴化乙锭染色以实施检测。[0576]监测rpa反应可以涉及例如去除rpa反应的一部分、分离未掺入的部分以及检测未掺入的引物。因为未掺入的引物的尺寸可以小于50bp、小于40bp、小于30bp或小于25bp，并且扩增产物的尺寸可以大于1kb、大于2kb、大于5kb，或大于10kb，因此掺入的与未掺入的引物之间存在很大尺寸差异。可以使用尺寸排阻色谱法例如旋转柱快速实施未掺入的引物的分离。如果引物被标记，则可以在小于1分钟的时间内实施包括旋转柱和测量(例如荧光或放射性)的监测程序。[0577]用于将延长的引物与未延长的引物分离的另一种可替代方法涉及page的使用。例如，通过凝胶电泳可以在小于5分钟的时间内将延长的引物与未延长的引物分离。[0578]用于分离延长的引物的另一种可替代方法涉及固定化的寡核苷酸的使用。例如，与在扩增的dna序列中唯一发现的序列同源的寡核苷酸可以用于特异性捕获由引物延伸产生的核酸。这些捕获寡核苷酸可以固定化于芯片或其它基材上。可以通过reca蛋白介导的方法或必要时通过传统的溶液杂交实施捕获寡核苷酸对延长的寡核苷酸的捕获。[0579]荧光探针的使用是检测rpa扩增产物最常用和优选的，并且具有提供实时检测的优点。[0580]这些探针用荧光团标记，如荧光素(fam)和淬灭剂，如接近荧光团的黑洞淬灭剂。探针在3'端具有阻断基，以防止聚合酶引起的从探针延伸。当探针被切割并且当淬灭剂与荧光团分离时检测到荧光信号，从而允许实时检测。探针含有脱碱基(abasic)位点，通常是四氢呋喃(thf)或dr基，并且在该脱碱基位点发生切割，通常由大肠杆菌核酸外切酶iii(在thf处切割)或大肠杆菌fpg(糖酵解酶/裂解酶)(在dr基处切割)进行。[0581]包含rpa反应组分的试剂盒[0582]本发明还提供了用于实施rpa反应的试剂盒。[0583]试剂盒可以包含上述任何一种浓度的本文描述的用于rpa的任何试剂。[0584]试剂盒可以包含本文描述和定义的任何idr-标记的大分子和/或idr-标记的多肽。优选地，试剂盒还包含额外的rpa组分，选自rpa重组酶剂，和/或rpa重组酶负载蛋白，和/或聚合酶，和/或第一核酸引物和第二核酸引物，和/或核酸外切酶，和/或缓冲液，和/或多价金属离子的来源，多价金属离子优选二价金属阳离子，如mg2+、mn2+、ca2+、co2+或ni2+。[0585]试剂盒的试剂可以被冷冻干燥，在这种情况下，试剂可以以任何合适的量提供，使得当复原时实现合适的试剂浓度。[0586]聚合酶[0587]如上所讨论的，本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以被标记至实施核酸合成反应所需的任何蛋白质组分。[0588]本文描述和定义的任何idr氨基酸序列可以被标记至实施核酸合成反应所需的任何蛋白质组分，其中，聚合酶用于通过延伸引物核酸分子来合成新的核酸分子。[0589]因此，任何合适的聚合酶都可以用如本文描述和定义的idr氨基酸序列进行标记。聚合酶可以是与通过延伸引物核酸分子用于合成新的核酸分子的任何反应相容的并且可以用于通过延伸引物核酸分子用于合成新的核酸分子的任何反应的聚合酶。[0590]聚合酶可以是与任何核酸扩增反应相容的并且可以用于任何核酸扩增反应的聚合酶。核酸扩增反应可以是涉及热循环的反应。核酸扩增反应可以是恒温扩增反应。核酸扩增反应可以是聚合酶链反应(pcr)、聚合酶螺旋反应(psr)、环介导恒温扩增(lamp)、基于核酸序列的扩增(nasba)、自我持续序列复制(3sr)、滚环扩增(rca)、链置换扩增(sda)、多重置换扩增(mda)、连接酶链反应(lcr)、解旋酶依赖性扩增(hda)、分支扩增法(ram)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、转录介导扩增(tma)或切口酶扩增反应(near)。[0591]序列标签[0592]如本文描述的参与生化反应的任何idr-大分子或任何idr-多肽，包括参与rpa反应的那些，可以包含一个或多个序列标签。如本文所描述的，如果使用，那么任何此类序列标签优选连接至多肽作为融合蛋白。序列标签和将序列标签连接至多肽的方式是本领域众所周知的。[0593]序列标签可以是短的氨基酸序列或较大的多肽，包括蛋白质。[0594]序列标签可以连接至多肽的c端，多肽标签的n端，多肽的c端和n端，或以任何组合连接在沿多肽的长度的任何氨基酸位置。[0595]合适的氨基酸序列标签的非限制性示例包括：6-组氨酸(6x-his；hhhhhh；seq id no：89)、c-myc表位(eqkliseedl；seq id no：90)、八肽(dykddddk；seq id no：91)、蛋白c(edqvdprlidgk；seq id no：92)、标签-100(eetarfqpgyrs；seq id no：93)、v5表位(gkpipnpllgldst；seq id no：94)、vsv-g(ytdiemnrlgk；seq id no：95)、xpress(dlyddddk；seq id no：96)以及血凝素(ypy-dvpdya；seq id no：97)。[0596]合适的蛋白质标签的非限制性示例包括：β-半乳糖苷酶、硫氧化还原蛋白、his-补丁(patch)硫氧化还原蛋白、igg结合结构域、inteinchitin结合结构域、t7基因10、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、绿色荧光蛋白(gfp)以及麦芽糖结合蛋白(mbp)。[0597]本领域技术人员将理解，序列标签和蛋白质标签可以互换使用，例如用于纯化和/或鉴定目的。[0598]固相生化反应[0599]可以使用固相或可逆固相技术实施根据本发明的方法中实施的生化反应。适于实施本文描述的工艺、用途和方法的固相反应系统可以包含表面。可以使用任何合适的表面。[0600]本文描述的数据表明，可以在没有拥挤剂的情况下使用固相技术用根据本发明的基于idr的试剂实施生化反应。一个具体的示例为核酸的重组酶聚合酶扩增，其中，引物连接至固体表面。适合使用固相方法实施的任何合适的生化反应都可以使用此类方法使用根据本发明的方法实施，根据本发明的方法涉及本文描述和定义的任何基于idr的试剂。[0601]多种此类固相技术在本领域中是已知的并且可以使用。[0602]大分子，如多核苷酸，包括核酸扩增引物、肽、半抗原、激素、药物等，可以被固定至表面。[0603]可以将生化反应的任何合适的大分子组分固定至表面，包括本文描述和定义的基于idr的试剂。[0604]大分子，如多核苷酸，例如用于扩增反应的引物可以直接或间接固定至表面。例如，它们可以通过化学键合直接连接至表面。它们可以通过中间表面间接连接至表面。[0605]例如，表面可以是平坦的表面(如玻璃、基于凝胶的材料)或微粒的表面(如珠或功能化的量子点)。构成表面的材料本身可以结合至基材。基材可以包括任何合适的材料，如玻璃、塑料或聚合物材料。[0606]根据本发明的方法，参与生化反应的大分子可以固定至基于凝胶的材料，例如聚丙烯酰胺或水凝胶，并且其中，基于凝胶的材料本身结合至支持基材，如玻璃或塑料或聚合物材料。[0607]例如，预形成的多核苷酸可以通过通常用于生成核酸微芯片的方法固定化至表面。例如，可以合成多核苷酸，然后将其点样或印刷到表面上，通常是平坦的表面。可以使用接触印刷技术将多核苷酸沉积到表面上。例如，可以将实心或空心的尖端或针头浸入包含预形成的多核苷酸的溶液中并与表面接触。可替代地，多核苷酸可以被吸附到微型印记(micro-stamp)上，然后通过物理接触转移到表面。非接触印刷技术包括热印刷或压电印刷，其中，可以使用与喷墨和气泡喷射印刷中所用方法类似的方法从印刷尖端喷射出包含预形成的多核苷酸的亚纳升大小的微滴。[0608]多核苷酸可以直接在表面上合成，如使用用于生成核酸微芯片的所谓“芯片上”方法。用于生成多核苷酸的芯片上技术包括光刻技术(photolithography)，其涉及使用通过光刻掩模引导的紫外光以选择性激活受保护的核苷酸，从而允许随后掺入新的受保护的核苷酸。预定的核苷酸的uv介导的脱保护与偶联的循环允许原位生成具有所需序列的多核苷酸。作为使用光刻掩模的可替代的方案，通过使用喷墨印刷技术连续沉积核苷碱基并使用偶联、氧化和脱保护的循环以生成具有所需序列的寡核苷酸，可以在表面上生成多核苷酸(有关综述，参见kosuri和church，nature methods，2014，11，499-507)。[0609]用于连接大分子(包括多核苷酸、肽、半抗原、激素、药物等)的表面可以由任何合适的材料制成。通常，表面可以包含硅、玻璃或任何合适的聚合物材料，如聚苯乙烯。表面可以包括凝胶表面，如聚丙烯酰胺表面或水凝胶表面。凝胶表面又可以偶联或结合至固体支溴乙酰胺基。任选地，在使用n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供溴乙酰基。表面上另外的官能团可以是溴乙酰基，任选地其中，在使用n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)衍生的聚丙烯酰胺表面上提供溴乙酰基，并且，例如在适当的情况下，第一官能团可以是胺基、硫醇基、硫代磷酸基或硫代酰胺基。多核苷酸所连接的表面可以包含凝胶。表面可以包括聚丙烯酰胺表面，如约2％的聚丙烯酰胺，优选地，聚丙烯酰胺表面偶联至固体支持物，如玻璃。[0620]可以使用有助于可逆固定化的微粒和珠。固相可逆固定化(spri)方法或改进的方法是本领域已知的并且可以采用(例如，参见deangelis m.m.et al.(1995)solid-phase reversible immobilization for the isolation of pcr products,nucleic acids research,23(22):4742–4743.)。[0621]表面可以以例如顺磁珠的形式提供。顺磁珠可以在磁场的影响下聚集。例如，顺磁性表面可以设置有化学基团，例如羧基，其在合适的连接条件下将用作包括核酸在内的大分子的结合部分。大分子可以在合适的洗脱条件下从此类表面上洗脱。微粒和珠的表面可以设置有对紫外线敏感的聚碳酸酯。例如，核酸可以在合适的固定化缓冲液存在下结合至活化的表面。[0622]可以允许微粒和珠在反应溶液中自由移动，然后被可逆地固定化，例如通过将珠保持在微孔中或蚀刻到表面中的坑内。珠可以定位为芯片的一部分，例如通过使用连接至珠的独特核酸“条形码”或通过使用颜色编码。[0623]表面可以是电介质上电润湿系统(electrowetting-on-dielectric system，ewod)的一部分。ewod系统提供了电介质涂覆的表面，其有助于以微滴形式的极少量液体的微流操纵(例如，参见chou,w-l.,et al.(2015)recent advances in applications of droplet microfluidics,micromachines,6:1249-1271.)。可以通过电润湿技术在芯片上可编程地生成、移动、分割和组合液滴体积。因此，电润湿系统提供了将大分子可逆地固定至表面和/或操纵固定至表面的大分子的可替代的方式。[0624]因此，在如本文描述或定义的根据本发明的任何一种方法或用途中，可以在包含表面的固相反应系统中实施生化反应。[0625]在如本文描述或定义的根据本发明的任何一种方法或用途中，其中，在包含表面的固相反应系统中实施生化反应，实施反应所需的任何大分子都可以连接至表面。例如，在一个此类方法中，其中，生化反应为在如本文描述的体外反应系统中扩增单链靶核酸分子或双链靶核酸分子的方法，至少一种核酸引物和/或反应大分子和/或idr-大分子和/或一种或多种多肽辅助因子可以连接于表面。[0626]在如本文描述或定义的根据本发明的任何一种方法或用途中，其中，在包含表面的固相反应系统中实施生化反应，实施反应所需的idr-大分子可以连接至表面。[0627]在如本文描述或定义的根据本发明的任何一种方法或用途中，其中，生化反应为在体外反应系统中扩增双链靶核酸分子的重组酶聚合酶扩增方法，其中，反应在包含表面的固相反应系统中实施，并且其中，重组酶剂和/或重组酶负载蛋白和/或单链稳定剂和/或聚合酶和/或核酸外切酶和/或第一核酸引物和/或第二核酸引物可以连接于表面。在一个此类方法或用途中，第一核酸引物或第二核酸引物可以连接于表面。可替代地，在其它此类方法或用途中，第一核酸引物和第二核酸引物均可以连接于表面。[0628]在如本文描述或定义的根据本发明的任何一种方法或用途中，其中，在固相反应系统中实施生化反应，大分子所连接的表面可以是微珠，优选地其中，微珠包含硅、玻璃、凝胶或聚合物材料，如聚苯乙烯，或其任何组合。[0629]在本文描述的任何一种方法或用途中，其中，在包含表面和/或基材的固相反应系统中实施生化反应，可以提供表面和/或基材作为流通池。可以使用与正在实施的生化反应相容的任何合适的流通池。合适的流通池可以包括多个流体通道，用于实施生化反应的试剂可以流过这些流体通道。用于实施生化反应的任何一种或多种大分子可以连接至内衬有流体通道的表面。合适的流通池可以用于实施用于扩增单链或双链靶核酸分子的生化反应。使用本文描述的工艺、用途和方法实施的测序反应也可以使用合适的流通池实施。[0630]实施例[0631]提供以下实施例以说明本发明而非限制本发明。[0632]实施例1.使用具有源自人类otx1的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增。[0633]实验的目的与概要[0634]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含在人类同源框蛋白otx1的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列。[0635]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下使用c端标记有富含组氨酸的固有无序区域(idr)结构域(otx1)的gp32，在模板浓度的范围内的单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0636]材料与方法[0637]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhhhqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化的金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his2。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：82(表23)。[0638]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的指示的拷贝，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)，测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。测试模板以拷贝数滴定，如图1所示。[0639]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加给定浓度的模板和33mm mgoac来引发反应。[0640]相关的引物和探针如下所示。[0641]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0642]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0643]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaa ggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0644]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0645]结果与结论[0646]如图1所示，在rpa反应开始后的7分钟内，很容易以高灵敏度检测到测试模板。仅仅用靶标的10个拷贝即可检测到扩增子。[0647]因此发现，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，在没有拥挤剂(如peg)的情况下，有效地发生扩增。[0648]实施例2.使用具有源自人类mafa的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增。[0649]实验的目的与概要[0650]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含在人类转录因子mafa的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的结构域序列。[0651]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有富含组氨酸的固有无序区域(idr)结构域(mafa)的gp32在模板浓度的范围内的单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0652]材料与方法[0653]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为sghhgahhgahhpaaaaayeafrgpgfaggggaddmgaghhhgahhaahhhhaahhhhhhhhhhggaghgggaghh(seq id no：27)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化的金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his5。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：85(表23)。[0654]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的指示的拷贝，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)，测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。测试模板以拷贝数滴定，如图2所示。[0655]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加给定浓度的模板和33mm mgoac来引发反应。[0656]相关的引物和探针如下所示。[0657]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0658]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0659]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaa ggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0660]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0661]结果与结论[0662]如图2所示，在rpa反应开始后的10分钟内，很容易以高灵敏度检测到测试模板。仅仅用靶标的10个拷贝即可检测到扩增子。[0663]因此发现，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，在没有拥挤剂(如peg)的情况下，有效地发生扩增。[0664]实施例3.使用具有源自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)hrp1的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增。[0665]实验的目的与概要[0666]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。[0667]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有包含酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)的序列的gp32，在模板浓度的范围内对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0668]材料与方法[0669]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化的金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：79(表23)。[0670]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的指示的拷贝，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。测试模板以拷贝数滴定，如图3所示。[0671]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加给定浓度的模板和33mm mgoac来引发反应。[0672]相关的引物和探针如下所示。[0673]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0674]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0675]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaa ggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0676]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0677]结果与结论[0678]如图3所示，在rpa反应开始后的7分钟内，很容易以高灵敏度检测到测试模板。仅仅用靶标的10个拷贝即可检测到扩增子。[0679]因此发现，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，在没有拥挤剂(如peg)的情况下，有效地发生扩增。[0680]实施例4.使用具有源自酿酒酵母sup2的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增。[0681]实验的目的与概要[0682]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含酿酒酵母sup2蛋白的固有无序区域(idr)结构域。[0683]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有包含酵母sup2蛋白的固有无序区域(idr)结构域的序列的gp32，在模板浓度的范围内对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0684]材料与方法[0685]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ynpqggyqq(seq id no：19)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化的金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-sup1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：72(表23)。[0686]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的指示的拷贝，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)，测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。测试模板以拷贝数滴定，如图c所示。[0687]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加给定浓度的模板和33mm mgoac来引发反应。[0688]相关的引物和探针如下所示。[0689]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0690]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0691]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaaggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0692]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0693]结果与结论[0694]如图4所示，在rpa反应开始后的7分钟内，很容易以高灵敏度检测到测试模板。仅仅用靶标的10个拷贝即可检测到扩增子。[0695]因此发现，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，在没有拥挤剂(如peg)的情况下，有效地发生扩增。[0696]实施例5.使用具有源自酿酒酵母sup2的idr标签的gp32对人类apob基因的重组酶聚合酶扩增。[0697]实验的目的与概要[0698]实施该实验以评估含有标签的多种gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含酿酒酵母sup2蛋白的固有无序区域(idr)结构域氨基酸序列。评估了可变数量的idr结构域重复单元，并且检查了融合蛋白的浓度范围。[0699]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有包含酵母sup2蛋白的固有无序区域(idr)结构域的序列的gp32的人类载脂蛋白b(apob)基因的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0700]材料与方法[0701]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ynpqggyqq(seq id no：19)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。连接了单个ynpqggyqq单元，或者连接了两个、三个或四个重复。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。这些融合蛋白被命名为gp32-sup2(两个重复；seq id no：20)、gp32-sup3(三个重复；seq id no：21)以及gp32-sup4(四个重复；seq id no：22)。这些融合蛋白的完整氨基酸序列分别显示为seq id no：73、seq id no：74以及seq id no：75(表23)。[0702]然后，使用来源于人类基因组dna的dna模板，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白与gp32-sup1。[0703]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、图5a至d所示浓度的gp32融合蛋白、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加模板和33mm mgoac来引发反应。在每种情况下使用的测试模板拷贝数为10000。[0704]相关的引物和探针如下所示。[0705]正向引物：gcagctgtatagcaaattcctgttgaaagcag(seq id no：101)。[0706]反向引物：tcctggctgtattcattgttgttaaattgg(seq id no：102)。[0707]探针：cactgatgct tttcctagacacgagatga[fam-dt]g[thf]c[bhq1-dt]tgt ggagcctttgt(seq id no：103)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bh q为黑洞淬灭剂。[0708]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0709]结果与结论[0710]结果如图5所示。图5a显示了使用单个idr结构域标签单元的结果。图5b至d显示了分别使用两个、三个和四个idr结构域标签单元重复的结果。在rpa反应开始约10分钟后检测到测试模板。[0711]发现在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用这些idr-标记的gp32融合蛋白，有效地发生扩增。发现单个idr结构域标签单元和两个idr结构域标签单元的性能最佳。三个idr结构域标签单元也给出了良好性能。[0712]实施例6.使用具有源自人类mafa的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增——镁离子浓度的比较。[0713]实验的目的[0714]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含在人类转录因子mafa的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的结构域序列。该实验评估了镁浓度的范围内性能。[0715]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有富含组氨酸的固有无序区域(idr)结构域(mafa)的gp32在镁浓度的范围内对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0716]材料与方法[0717]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为sghhgahhgahhpaaaaayeafrgpgfaggggaddmgaghhhgahhaahhhhaahhhhhhhhhhggaghgggaghh(seq id no：27)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his5。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：85(表23)。[0718]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的指示的拷贝在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。以每个反应10000个拷贝提供测试模板，并且镁离子浓度在5.6mm到44.8mm之间变化。[0719]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加模板和5.6mm至44.8mm mgoac的指示的浓度的mgoac来引发反应。[0720]相关的引物和探针如下所示。[0721]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0722]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0723]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaa ggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0724]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0725]结果与结论[0726]发现在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，有效地发生扩增。[0727]如图6所示，据发现，当存在28mm或更多镁时，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白发生良好的扩增。该实验中的最佳浓度似乎是33.6mm，进一步增加至44.8mm则会产生相似的检测时间。[0728]实施例7.磷酸肌酸水平对人类apob基因片段的重组酶聚合酶扩增的影响。[0729]实验的目的与概要[0730]实施该实验以评估改变磷酸肌酸水平对含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能的影响，该标签包含在人类同源框蛋白otx1的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的结构域序列。[0731]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有富含组氨酸的固有无序区域(idr)结构域(otx1)的gp32的人类载脂蛋白(apob)基因的片段的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0732]材料与方法[0733]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his2。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：82(表23)。[0734]然后，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)测试重组噬菌体vb ecom nbg1gp32融合蛋白。使用人类apob测定法进行磷酸肌酸滴定。以104个拷贝的浓度提供测试模板。[0735]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、图中所示的磷酸肌酸的水平、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合蛋白、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加每个反应104个拷贝模板和33mm mgoac来引发反应。[0736]正向引物：gcagctgtatagcaaattcctgttgaaagcag(seq id no：101)。[0737]反向引物：tcctggctgtattcattgttgttaaattgg(seq id no：102)。[0738]探针：cactgatgct tttcctagacacgagatga[fam-dt]g[thf]c[bhq1-dt]tgt ggagcctttgt(seq id no：103)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bh q为黑洞淬灭剂。[0739]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0740]结果与结论[0741]发现在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，发生扩增。如图7a、7b和7c所示，在基于peg的rpa(50mm)中使用的标准磷酸肌酸浓度下，20分钟内几乎没有观察到扩增活性。将磷酸肌酸减少至20mm会导致最佳性能，但在15-25mm也观察到了良好的性能，并且在30-35mm于20分钟内也观察到了扩增的较低水平。[0742]实施例8.使用具有源自酿酒酵母hrp1的idr标签的gp32对单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增——盐浓度的比较。[0743]实验的目的与概要[0744]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。该实验评估了盐浓度的范围内的性能，在这种情况下使用乙酸钾。[0745]该实施例表明，在没有拥挤剂的情况下，使用c端标记有酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)的gp32在盐浓度的范围内可以优化单核细胞增生李斯特氏菌基因hly的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0746]材料与方法[0747]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmy qnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：79(表23)。[0748]然后，使用来源于单核细胞增生李斯特氏菌基因组dna的dna模板的100个拷贝，在无peg扩增情况下(即在没有拥挤剂的情况下)测试重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。乙酸钾浓度在10mm到高达100mm之间变化。[0749]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合物、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加模板和33mm mgoac来引发反应。[0750]相关的引物和探针如下所示。[0751]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0752]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0753]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaaggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0754]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0755]结果与结论[0756]发现在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白，有效地发生扩增。[0757]还发现，在没有拥挤剂的情况下，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白的扩增可以在盐浓度的范围内进行优化，其中乙酸钾为代表性的示例。[0758]如图8所示，据发现，当存在10mm或更多乙酸钾时，使用这种idr-标记的gp32融合蛋白会发生良好的扩增。该实验中的最佳浓度范围似乎是10-40mm。在浓度高于40mm时，观察到效率较低的扩增。[0759]实施例9.使用具有源自酿酒酵母sup2的idr标签的gp32对人类apob基因片段的重组酶聚合酶扩增——与拥挤剂的协同效应[0760]实验的目的与概要[0761]实施该实验以评估拥挤剂(在这种情况下是peg)的低浓度对含有在酵母sup2基因的固有无序区域中发现的富含组氨酸的序列(具体为sup1序列ynpqggyqq(seq id no：19))的gp32融合蛋白制剂的反应效率的影响，该序列连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。将该融合蛋白在人类载脂蛋白(apob)基因片段的重组酶聚合酶扩增中的性能与缺乏sup1 idr标签的gp32蛋白的该性能进行了比较。[0762]据发现，拥挤剂的低浓度可以增强sup1 idr-标记的gp32的反应效率，并且可以实现可以观察到协同效应的条件。[0763]材料与方法[0764]gp32-sup1[0765]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ynpqggyqq(seq id no：19)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-sup1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：72(表23)。[0766]gp32(7his)[0767]使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化噬菌体vb ecom nbg1 gp32，该色谱法依赖于放置在受试的蛋白的恰好c端的七组氨酸标签。该融合蛋白被命名为gp32(7his)。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：65(表23)。[0768]在有或没有拥挤剂的情况下，使用包含人类载脂蛋白(apob)基因片段的dna模板在rpa反应中测试了重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白。[0769]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、50mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm gp32融合蛋白、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.27μm核酸外切酶iii来建立反应。通过添加模板和33mm mgoac来引发反应。在每种情况下使用的测试模板拷贝数为10000。将peg添加到相关图中标注的终浓度。所使用的peg的种类是分子量为35000的peg。[0770]相关的引物和探针如下所示。[0771]正向引物：gcagctgtatagcaaattcctgttgaaagcag(seq id no：101)。[0772]反向引物：tcctggctgtattcattgttgttaaattgg(seq id no：102)。[0773]探针：cactgatgct tttcctagacacgagatga[fam-dt]g[thf]c[bhq1-dt]tgtggagcctttgt(seq id no：103)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0774]然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0775]结果与结论[0776]结果如图9所示。图9显示，当在没有拥挤剂peg的情况下测试idr-标记的gp32-sup1融合蛋白时，有效地检测到测试模板。[0777]当在0.5％至2％的拥挤剂peg的存在下测试没有sup1 idr标签的gp32-7his融合蛋白时，观察到少量的但仍可检测到的扩增产物。[0778]当在拥挤剂peg的存在下测试idr-标记的gp32-sup1融合蛋白时，有效地检测到测试模板。在这种情况下，可以观察到协同效应，当与以下观察到的量相比时，扩增产物的量超过组合的量：(i)在没有peg的情况下idr-标记的gp32-sup1融合蛋白和(ii)在没有peg的情况下没有sup1 idr标签的gp32-7his融合蛋白(例如，参见图9并且将sup1 1％peg与sup1 0％peg+普通gp32 1％peg进行比较)。[0779]这些结果表明，当将反应的idr-标记的大分子组分与低浓度的拥挤剂组合时，可以观察到对生化反应的实施效率的增强的影响，并且当将反应的idr-标记的大分子组分与低浓度的拥挤剂组合时，可以实现促进对反应效率的协同效应的条件。[0780]实施例10.在多价金属阳离子存在下通过idr标签促进相分离。[0781]实验的目的与概要[0782]实施该实验以评估水性体外生化系统中的多价金属阳离子对促进由若干种gp32融合蛋白驱动/导致的相分离的影响，每种gp32融合蛋白都具有包含固有无序区域(idr)结构域氨基酸序列的标签。[0783]该实施例表明，包含idr结构域氨基酸序列的标签意外地能够促进相分离，并且更意外的是，多价金属阳离子的存在增强了此效果。[0784]材料与方法[0785]gp32-his2融合蛋白[0786]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhhhqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。gp32-his2融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：82(表23)。[0787]gp32-hrp1融合蛋白[0788]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。gp32-hrp1融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：79(表23)。[0789]gp32-sup1融合蛋白[0790]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ynpqggyqq(seq id no：19)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。gp32-sup1融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：72(表23)。[0791]gp32-fib融合蛋白[0792]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为pgfsprgggfggrggfgdrggrggrggfgggrgrgggfrgrgr(seq id no：1)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。gp32-fib融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：69(表23)。[0793]相分离测定[0794]下文概述的方法适用于所有测试的融合蛋白。使用的融合蛋白溶液的体积取决于纯化后的蛋白质浓度。[0795]在每种情况下，配制50μl溶液，其包含终浓度为1000ng/μl的标记的融合蛋白和以乙酸盐或氯化物形式存在的金属离子，目标浓度如下文和本文呈现的相关附图中所示。[0796]对于gp32-his2融合，纯化后的蛋白质浓度为48mg/ml。每50μl反应中使用1.04μl这种融合蛋白，以达到溶液中1000ng/μl的终浓度。对于gp32-hrp1融合，纯化后的蛋白质浓度为39mg/ml。每50μl反应中使用1.28μl这种融合蛋白，以达到溶液中1000ng/μl的终浓度。对于gp32-sup1融合，纯化后的蛋白质浓度为36mg/ml。每50μl反应中使用1.4μl这种融合蛋白，以达到溶液中1000ng/μl的终浓度。对于gp32-fib融合，纯化后的蛋白质浓度为20.2mg/ml。每50μl反应中使用2.48μl这种融合蛋白，以达到溶液中1000ng/μl的终浓度。[0797]在这些实验中，用代表性的二价金属阳离子(镁(mgoac)、锰(mgcl2)和钙(cacl2))测试了发生可检测的相分离增强所需的二价金属阳离子浓度。锰和钙的乙酸盐形式并没有被简单地使用，由于它们在溶液中已知的不稳定性。乙酸溶液中的锰将随着时间氧化，并且乙酸钙似乎会支持溶液中某些细菌的生长，而氯化钙则不会。[0798]在构成包含水、idr-标记的蛋白质和二价金属阳离子的混合物之后，将混合物涡旋、旋转减慢并将10μl的混合物样本转移至dhc-b01 c-chip血细胞计数器载玻片。然后，在×400放大倍率的显微镜下对载玻片进行成像。通过形成球状球形粒/颗粒来评估可检测的相分离，这些球形粒/颗粒可以通过放大目视鉴定并且使用血细胞计数器计数。然后，可以实施每单位体积的球形粒计数。通过计数×400放大倍率下在218μm×175μm的放大区域中形成的球形粒的数量来实施球形粒计数。这是通过将放大的图像分成20个正方形部分(图像的4×5)，计数这些部分的一个中的球形粒，然后将该数目乘以20来完成的。[0799]结果与结论[0800]观察到，在该测定中刚好低于最低可检测的相分离浓度(mpsc)与刚好高于mpsc之间发生的转变在所有实施的反应中发生得非常突然。在刚好低于mpsc时，根本没有观察到可检测的相分离的水性颗粒，并且发现溶液中没有可见的可检测的颗粒(球形粒)。高于mpsc时，该转变非常明显，数百个可见的可检测的颗粒(球形粒)突然形成。[0801]球形粒的尺寸不同，并且发现其与idr标签和使用的二价金属阳离子相关。可以确定的是，球形粒的具体尺寸并不重要。[0802]球形粒以大致球形的颗粒状结构存在。对于任何给定的idr标签和任何给定的二价金属离子组合，使用标准方法可以容易地确定球形粒的群体的平均直径。[0803]使用单独融合蛋白的结果概述如下。[0804]gp32-his2融合蛋白[0805]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的镁的最低浓度被确定为10mm——在视野内计数了约600个颗粒(球形粒)。[0806]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的钙离子的最低浓度被确定为12mm——在视野内计数了约500个颗粒(球形粒)。[0807]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的锰离子的最低浓度被确定为2mm——在视野内计数了约180个颗粒(球形粒)。[0808]代表性的放大的图像如图10a所示。[0809]gp32-hrp1融合蛋白[0810]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的镁离子的最低浓度被确定为16mm——在视野内计数了此浓度下的约580个颗粒(球形粒)。[0811]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的钙离子的最低浓度被确定为24mm。在视野内计数了此浓度下的约240个颗粒(球形粒)。[0812]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的锰离子的最低浓度被确定为6mm。在视野内计数了此浓度下的约260个颗粒(球形粒)。[0813]代表性的放大的图像如图10b所示。[0814]gp32-sup1融合蛋白[0815]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的镁离子的最低浓度被确定为24mm。在视野内计数了此浓度下的约280个颗粒(球形粒)。[0816]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的钙离子的最低浓度被确定为32mm。在视野内计数了此浓度下的约460个颗粒(球形粒)。[0817]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的锰离子的最低浓度被确定为4mm。在视野内计数了此浓度下的约220个颗粒(球形粒)。[0818]代表性的放大的图像如图10c所示。[0819]gp32-fib融合蛋白[0820]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的镁离子的最低浓度被确定为500μm。在视野内计数了此浓度下的约340个颗粒(球形粒)。[0821]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的钙离子的最低浓度被确定为1mm。在视野内计数了此浓度下的约500个颗粒(球形粒)。[0822]在这些条件下，增强可检测的相分离的水性颗粒的形成所需的锰离子的最低浓度被确定为500μm。在视野内计数了此浓度下的约360个颗粒(球形粒)。[0823]代表性的放大的图像如图10d所示。[0824]当在×400放大倍率下在218μm×175μm的放大区域内形成10个或更多个颗粒(球形粒)时，使用这些测定法，确定了idr或idr结构域在标记至蛋白质时增强体外生化环境中可检测的相分离的水性颗粒的形成的功能性能力可以被确立。当在×400放大倍率下在218μm×175μm的放大区域内优选形成50个或更多个颗粒(球形粒)时，更优选当形成100个或更多个颗粒(球形粒)时，可以确立idr或idr结构域在标记至蛋白质时在体外生化环境中诱导相分离的功能性能力。[0825]如本文所使用的，术语“球形粒”与“小球”、“颗粒”或“球状颗粒”同义，并且这些术语可以互换使用。[0826]实施例11.在多价金属阳离子存在下通过idr标签形成球形粒。[0827]实验的目的与概要[0828]实施该实验以评估体外生化反应系统中的多价金属阳离子对促进由若干种gp32融合蛋白驱动/导致的相分离的影响，每种gp32融合蛋白都具有包含固有无序区域(idr)结构域氨基酸序列的标签。[0829]该实施例表明，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进/增强相分离，并且这种效应在各种多价金属阳离子的存在下发生。[0830]材料与方法[0831]gp32-fib融合蛋白[0832]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为pgfsprgggfggrggfgdrggrggrggf gggrgrgggfrgrgr(seq id no：1)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。gp32-fib融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：69(表23)。[0833]gp32-sup1融合蛋白[0834]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ynpqggyqq(seq id no：19)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr结构域标签之后。gp32-sup1融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：72(表23)。[0835]gp32-his2融合蛋白[0836]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhhhqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。gp32-his2融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：82(表23)。[0837]gp32-hrp1融合蛋白[0838]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。gp32-hrp1融合蛋白的完整氨基酸序列提供为seq id no：79(表23)。[0839]gp32-his5融合蛋白[0840]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为sghhgahhgahhpaaaaayeafrgpgfaggggaddmgaghhhgahhaahhhhaahhhhhhhhhhggaghgggaghh(seq id no：27)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。gp32-his5融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：85。[0841]相分离测定[0842]下文概述的方法适用于所有测试的融合蛋白。使用的融合蛋白溶液的体积取决于纯化后的蛋白质浓度。[0843]在每种情况下，配制50μl溶液，其包含终浓度为1000ng/μl(29.4μm)的标记的融合蛋白和二价金属阳离子。测试的金属离子为mg2+(mgoac)、mn2+(mncl2)和ca2+(cacl2)，并且在每种情况下，这些以20mm的终浓度使用。[0844]在构成包含水、idr-标记的蛋白质和多价金属阳离子的混合物之后，将混合物涡旋、旋转减慢并将10μl的混合物样本转移至dhc-b01 c-chip血细胞计数器载玻片。然后，使用×400放大倍率的明场显微术对载玻片进行成像。通过形成球状球形粒(颗粒)来评估相分离，这些颗粒可以通过放大目视鉴定并且使用血细胞计数器计数。[0845]结果与结论[0846]代表性的放大的图像如图11a至11e所示。[0847]对于每个测试的idr-标记的gp32融合蛋白，观察到可检测的相分离，如通过可检测的球状相分离的颗粒(球形粒)的形成所确定的。在每种情况下，在存在mg2+、mn2+和ca2+二价金属离子的情况下观察到该效应。[0848]因此，多价金属离子诱导/增强相分离的能力似乎是适用于具有完全不同氨基酸序列的广泛范围的不同idr标签的一般性质。[0849]实施例12.通过具有源自酿酒酵母hrp1的idr标签的gp32形成球形粒。[0850]实验的目的与概要[0851]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂在没有拥挤剂的情况下在示例性体外生化反应环境中形成球形粒的能力，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。[0852]该实施例表明，在示例性体外生化反应环境中和没有拥挤剂的情况下，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进/增强相分离，如可检测的相分离的水性颗粒的形成所确定的。[0853]材料与方法[0854]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：79(表23)。[0855]创建了示例性体外生化反应环境以测试idr结构域序列标签的效果。在这种情况下，环境为表征重组酶聚合酶扩增反应的环境。[0856]根据以下方案建立反应。用以下组分产生反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.2μm正向引物、0.2μm反向引物、0.516μm探针、22.6μm gp32-hrp融合、8.4μm uvsx、15.3μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶(大亚基)以及0.27μm核酸外切酶iii。gp32、uvsx、uvsy、聚合酶和核酸外切酶iii在一步添加到引物、缓冲液、核苷酸和肌酸激酶的混合物之前制备作为预混物。总体积为44μl。组合后，将6μl的280mm mgoac添加到混合物中以达到33mm的终浓度。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，其放置在设置为39℃的加热台上，然后在显微镜下观察，其中，在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[0857]相关的引物和探针如下所示。[0858]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0859]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0860]探针：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[0861]结果与结论[0862]如图12所示，连接至gp32的hrp标签促进了许多可检测的相分离的水性颗粒(球形粒)的形成，在寡核苷酸中观察到这些水性颗粒是密集的(如荧光标记探针所检测的那样)。[0863]使用相同的材料和条件进行了单独的实验，除了gp32蛋白仅用七组氨酸序列标记而不用hrp idr标签标记。在这些实验中，没有形成球形粒(数据未示出)，表明球形粒的形成是由idr标签特异性驱动的，因此七组氨酸序列不是本文定义的功能性idr。[0864]结果证明了idr结构域标签(在这种情况下由上述酿酒酵母hrp1氨基酸序列标签表示)在体外生化反应环境中(在这种情况下由表征重组酶聚合酶扩增反应的反应混合物环境表示)并且在没有拥挤剂的情况下促进可检测的相分离的功能性能力。[0865]实施例13.通过具有源自人类otx1的idr标签的gp32形成球形粒。[0866]实验的目的与概要[0867]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂在没有拥挤剂的情况下在示例性体外生化反应环境中形成球形粒的能力，该标签包含人类otx1蛋白的固有无序区域(idr)。[0868]该实施例表明，在示例性体外生化反应环境中和没有拥挤剂的情况下，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进可检测的相分离。[0869]材料与方法[0870]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his2。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：82(表23)。[0871]创建了示例性体外生化反应环境以测试idr结构域序列标签的效果。在这种情况下，环境为表征重组酶聚合酶扩增反应的环境。[0872]根据以下方案建立反应。用以下组分产生反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.2μm正向引物、0.2μm反向引物、0.516μm探针、22.6μm gp32-his2融合物、8.4μm uvsx、15.3μmuvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶(大亚基)以及0.27μm核酸外切酶iii。gp32-his2、uvsx、uvsy、聚合酶和核酸外切酶iii在一步添加到引物、缓冲液、核苷酸和肌酸激酶的混合物之前制备作为预混物。总体积为44μl。组合后，将6μl的280mm mgoac添加到混合物中以达到33mm的终浓度。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，其放置在设置为39℃的加热台上，然后在显微镜下观察，其中，在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[0873]相关的引物和探针如下所示。[0874]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0875]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0876]探针：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[0877]结果与结论[0878]如图13所示，连接至gp32的his2 idr标签促进了许多可检测的相分离的水性颗粒(球形粒)的形成，在寡核苷酸中观察到这些水性颗粒是密集的(如荧光标记探针所检测的那样)。注意到，与本文进一步描述的当hrp idr标签连接至gp32时形成的那些相比，这些小球的尺寸看起来更小。[0879]结果证明了idr结构域标签(在这种情况下由上述his2氨基酸序列标签表示)在体外生化反应环境中(在这种情况下由表征重组酶聚合酶扩增反应的反应混合物环境表示)并且在没有拥挤剂的情况下促进可检测的相分离的功能性能力。[0880]实施例14.多价金属阳离子对通过具有源自酿酒酵母hrp1的idr标签的gp32形成球形粒的影响。[0881]实验的目的与概要[0882]实施该实验以评估多价金属阳离子对含有标签的gp32融合蛋白制剂在没有拥挤剂的情况下在示例性体外生化反应环境中形成球形粒的能力的影响，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。[0883]该实施例表明，在不存在拥挤剂的情况下，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进/增强相分离，如通过形成可检测的相分离的水性颗粒所确定的，并且表明多价金属阳离子的存在增强了相分离，并且可以确定促进相分离的优化浓度。[0884]材料与方法[0885]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：79(表23)。[0886]创建了示例性体外生化反应环境以测试在不同浓度的二价金属阳离子存在下idr结构域序列标签的效果。在这种情况下，环境为表征重组酶聚合酶扩增反应的环境。[0887]根据以下方案建立反应。用以下组分产生反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.26μm正向引物、0.26μm反向引物、0.4μm探针、22.6μm gp32-hrp融合物、8.4μm uvsx以及15.3μmuvsy。gp32、uvsx和uvsy在一步添加到引物、缓冲液、核苷酸和肌酸激酶的混合物之前制备作为预混物。将mgoac添加至混合物中以达到相关图中所示的终浓度。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，其放置在设置为39℃的加热台上，然后在显微镜下观察，其中，在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[0888]相关的引物和探针如下所示。[0889]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0890]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0891]探针：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[0892]结果与结论[0893]如图14a和14b所示，连接至gp32的hrp idr标签促进了许多可检测的相分离的水性颗粒(球形粒)的形成，在寡核苷酸中观察到这些水性颗粒是密集的(如荧光标记探针所检测的那样)。[0894]在22.4mm mgoac时清晰可见球形粒。球形粒的最佳形成发生在33mm mgoac。在浓度高于33mm时开始观察到一些小球的凝集。[0895]值得注意的是，33mm mgoac是镁的浓度，在该浓度下，如本文描述的，在没有拥挤剂的情况下使用idr-标记的gp32在重组酶聚合酶扩增(rpa)反应中观察到最佳扩增效率。因此，idr标签介导的球形粒的形成的效率令人惊讶地与不存在拥挤剂的体外系统中示例性生化反应的效率相关，在这种情况下，使用idr-标记的蛋白质在rpa反应中的扩增作为示例测试生化系统。[0896]结果支持了令人惊讶的结论，即在没有拥挤剂的情况下，idr结构域序列标签在驱动/提高生化反应的效率方面的性能可以与相分离的效率相关，并且这反过来似乎通过包含在系统中的多价金属阳离子或其功能性等效物的浓度而被增强，以影响固有无序区域或结构域的功能。[0897]实施例15.多价金属阳离子对通过具有源自人类otx1的idr标签的gp32形成球形粒的影响。[0898]实验的目的与概要[0899]实施该实验以评估在没有拥挤剂的情况下多价金属阳离子对具有标签的gp32融合蛋白在示例性体外生化反应环境中形成颗粒/球形粒的能力的影响，该标签包含人类otx1蛋白的固有无序区域(idr)。[0900]该实施例表明，在示例性体外生化反应环境中并且在没有拥挤剂的情况下，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进可检测的相分离，并且表明多价金属阳离子的存在增强了可检测的相分离，并且可以确定促进可检测的相分离的优化浓度。[0901]材料与方法[0902]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his2。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：82(表23)。[0903]创建了示例性体外生化反应环境以测试不同浓度的二价金属阳离子存在下idr结构域序列标签的效果。在这种情况下，环境为表征重组酶聚合酶扩增反应的环境。[0904]根据以下方案建立反应。用以下组分产生反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.26μm正向引物、0.26μm反向引物、0.4μm探针、20μm gp32-his2融合、8.4μm uvsx以及8.6μm uvsy。gp32、uvsx和uvsy在一步添加到引物、缓冲液、核苷酸和肌酸激酶的混合物之前制备作为预混物。将mgoac添加至混合物中以达到相关图中所示的终浓度。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，其放置在设置为39℃的加热台上，然后在显微镜下观察，其中，在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[0905]相关的引物和探针如下所示。[0906]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0907]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0908]探针：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[0909]结果与结论[0910]如图15a和15b所示，连接至gp32的his2标签促进了许多球形粒的形成，在寡核苷酸中观察到这些球形粒是密集的(如荧光标记探针所检测的那样)。[0911]在22.4mm mgoac时清晰可见球形粒。球形粒的最佳形成发生在33mm mgoac至39mm mgoac。在浓度39mm以上时开始观察到一些小球的凝集。[0912]值得注意的是，33mm mgoa至39mm mgoac是镁的浓度，在该浓度下，如本文描述的，在没有拥挤剂的情况下使用idr-标记的gp32在重组酶聚合酶扩增(rpa)反应中观察到最佳扩增效率。因此，idr标签介导的球形粒的形成的效率令人惊讶地与不存在拥挤剂的体外系统中示例性生化反应的效率相关，在这种情况下，使用idr-标记的蛋白质在rpa反应中的扩增作为示例测试生化系统。[0913]结果支持了令人惊讶的结论，即在没有拥挤剂的情况下，idr结构域序列标签在驱动/提高生化反应的效率方面的性能可以与相分离的效率相关，并且这反过来似乎通过包含在系统中的多价金属阳离子或其功能性等效物的浓度而被增强，以影响固有无序区域或结构域的功能。[0914]实施例16.镁浓度对通过具有源自酿酒酵母hrp1的idr标签的gp32形成球形粒的影响。[0915]实验的目的与概要[0916]实施该实验以评估镁离子对含有标签的gp32融合蛋白制剂在没有拥挤剂的情况下在示例性体外生化反应环境中形成球形粒的能力的影响，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。[0917]该实施例表明，在示例性体外生化反应环境中并且在没有拥挤剂的情况下，包含idr结构域氨基酸序列的标签能够促进/增强相分离，如通过可检测的相分离的水性颗粒的形成所确定的那样，并且表明相分离取决于镁离子的存在，并且发现反应混合物的所有蛋白质组分都与相分离的颗粒相关联，而与本体相不相关。[0918]材料与方法[0919]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmy qnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：79(表23)。[0920]创建了示例性体外生化反应环境以测试在镁离子存在或不存在的情况下idr结构域序列标签的效果。[0921]根据以下方案建立反应。用以下组分产生1ml反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.4μm探针、20.26μm gp32-hrp融合、5μm uvsx、8.67μm uvsy、0.127μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶(大亚基)以及0mm或33.6mm mgoac。[0922]相关的引物和探针如下所示。[0923]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0924]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0925]探针：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[0926]对完成的混合物拍照。[0927]混合物以2000rcf离心1分钟。从mgoac混合物中去除上清液。在具有33.6mm mgoac的混合物中，留下小沉淀，假定它由相分离的小球/颗粒组成。在没有mgoac的混合物中，没有看到类似的沉淀。将10μl 1％sds溶液添加至沉淀进行溶解。沉淀的体积估计为4.5μl，估计总体积为14.5μl。通过sds-page分析1μl的每个样本。[0928]结果与结论[0929]如图16a所示，向1ml rpa混合物中加入乙酸镁使混合物变得不透明。在没有乙酸镁的情况下没有观察到这一点。这种不透明的效果与在等效较小反应中看到的效果相同，并且当通过显微镜观察到形成球形粒/相分离的颗粒时，其具有估计在2-3微米范围内的典型直径，并且通常为每纳升约200-400个颗粒。当进行离心时，这些不透明的混合物被澄清，并且在试管的底部可以看到沉淀或下层相形成，这被假定为是被强制聚集成单个体积的大量颗粒(图16b)。此沉淀部分的估计体积约为4μl，这大致是预计形成的颗粒的预测总体积，根据血细胞计数器/显微镜视野计算，假设平均粒径为3μm(因此体积约为13飞升(femtoliter))并且丰度为每纳升约400个颗粒，每微升400000个颗粒，估计每微升混合物产生约5nl的颗粒体积，因此每毫升混合物产生约5μl的颗粒体积。[0930]在添加乙酸镁之前和之后对1微升本体混合物(bulk mixture)(或透明相)的分析表明，在添加之前，可以在透明液体中如预期地鉴定出各种蛋白质——gp32是质量方面最突出的蛋白质。在浓缩和澄清后，上清液中只能发现微量的蛋白质，而沉淀则大量富含添加到rpa混合物中的所有蛋白质(图16c)。通过推断，可以假设已达到约200倍的反应物浓度，总蛋白浓度约为200μg/μl。[0931]结果表明，rpa反应混合物的所有蛋白质组分，即肌酸激酶、gp32-hrp融合物、uvsx、uvsy和聚合酶都与相分离的颗粒相关，而与本体相无关。[0932]实施例17.包含固有无序区域的氨基酸序列在提高生化反应的效率方面的必需性质的证明。[0933]实验的目的与概要[0934]实施该实验以评估在有或没有拥挤剂的情况下在示例性体外生化反应环境中缺乏含有包含固有无序区域(idr)的氨基酸序列的标签的gp32蛋白的性能。[0935]该实施例表明，在没有包含idr结构域氨基酸序列的标签的情况下，在没有拥挤剂的情况下gp32不能有效地介导重组酶聚合酶扩增，并且不能在分析期间在该测定系统中进行检测。通过与上述其它实施例(如实施例1至5)进行比较，这些数据确定了包含idr结构域氨基酸序列的标签对于在没有拥挤剂的情况下提高生化反应的效率是必不可少的。[0936]材料与方法[0937]噬菌体vb ecom nbg1 gp32蛋白以其天然形式被纯化，缺乏任何形式的外源性idr标签或组氨酸标签。使用肝素树脂纯化蛋白质并用nacl梯度洗脱。对来自400mm nacl级分的天然gp32蛋白进行测试。[0938]创建了示例性体外生化反应环境以测试在有或没有拥挤剂的情况下天然gp32蛋白的效果。[0939]根据以下方案建立反应。[0940]用以下组分形成无peg的反应混合物：25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm天然gp32蛋白、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.135μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶(大亚基)以及0.27μm核酸外切酶iii。[0941]用以下组分形成基于peg的反应混合物：50mm tris hcl ph 8.3、100mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、50mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、0.4μm正向引物、0.4μm反向引物、0.12μm探针、20μm天然gp32蛋白、4.8μm uvsx、8.6μm uvsy、0.27μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶(大亚基)、0.27μm核酸外切酶iii以及终浓度如相关图中所示的peg。所用的peg的种类为分子量为35000的peg。[0942]在所有反应中，相关的引物和探针如下所示。[0943]正向引物：cgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaac(seq id no：98)。[0944]反向引物：ctgcatctccgtggtatactaatacattgttttta(seq id no：99)。[0945]探针：cgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataag[fam][thf][bhq-1]atacaaggattgga(seq id no：100)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且bhq为黑洞淬灭剂。[0946]通过添加33mm mgoac和来源于李斯特氏菌基因组dna的dna模板的100个拷贝来引发所有反应。然后，将反应物在39℃置于荧光计中孵育，并使用轴承球进行磁力混合。[0947]结果与结论[0948]如图17所示，在5.5％peg存在下观察到用天然gp32蛋白的快速扩增。然而，在没有peg的情况下，没有观察到用天然gp32蛋白的扩增。[0949]在上述其它实施例中，如实施例1至5中，在没有peg的情况下，仅当gp32蛋白用包含固有无序区域(idr)的氨基酸序列标记时，才观察到gp32介导的扩增。[0950]因此，并且与本文描述的其它实施例中呈现的数据结合在一起，这些数据确定了包含氨基酸序列的标签(该氨基酸序列包含适用于体外生化反应的功能所必需的蛋白质组分的固有无序区域(idr))能够避开反应中对拥挤剂的要求，并且与没有idr标签序列时观察到的效率相比，提高了生化反应的效率。[0951]实施例18.使用具有源自人类otx1的idr标签的gp32在固体表面上的重组酶聚合酶扩增。[0952]实验的目的与概要[0953]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂的性能，该标签包含在人类同源框蛋白otx1的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列。[0954]该实施例表明，在实时和终点测定中，在没有拥挤剂的情况下使用c端标记有富含组氨酸的固有无序区域(idr)结构域(otx1)的gp32在固体表面上对人工核酸模板的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[0955]材料与方法[0956]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24)。这连接至噬菌体vb ecom nbg1 gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为gp32-his2。该融合蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：82(表23)。[0957]然后，重组噬菌体vb ecom nbg1 gp32融合蛋白在固体表面上进行了无peg扩增(即在没有拥挤剂的情况下)测试。使用以不同比例连接于珠的表面的两种寡核苷酸引物实施测试。通过荧光检测扩增，使用可切割的淬灭荧光探针实时检测或通过退火荧光探针的终点检测。在实时与终点rpa反应中，珠是相同的。珠来源于bangs laboratories,inc.(https://www.bangslabs.com/)，并且其具有羧化的聚苯乙烯核心，并且其上生长有水凝胶，寡核苷酸共价连接至该水凝胶。[0958]实时rpa反应[0959]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、120nm探针、20μm gp32融合蛋白、4.9μm uvsx、7.6μm uvsy、0.146μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及0.34μm核酸外切酶iii来建立反应。反应混合物还包括800000个珠/μl，每个珠具有约750000个寡核苷酸引物/珠，该寡核苷酸引物由pa30正向引物与pb30反向引物的混合物组成。[0960]通过添加33.6mm mgoac和称为tf1l的人工dna模板(以800000个模板拷贝/μl反应混合物的终浓度)引发反应。[0961]相关的引物、探针和模板如下所示。[0962]pa30正向引物：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag(seq id no：105)。[0963]pb30反向引物：cctatcccctgtgtgccttggcagtctcag(seq id no：106)。[0964]探针：agcagaagcaataccgccagcaatagca[dt-fam]g[thf]g[dt-淬灭剂]agagcgagctgcc(seq id no：107)，其中，fam为荧光素，thf为四氢呋喃，并且淬灭剂为黑洞淬灭剂。[0965]tf1l模板序列：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtgttttagggtccccggggttaaaaggtttcgaactcaacagctgtctggcagctcgctctacgcatgctattgctggcggtattgcttctgctcttgctggtggcgccatgtctaaattgtttggagctgagactgccaaggcacacaggggatagg(seq id no：108)。[0966]然后，将反应物在39℃在t8荧光计中孵育30分钟，并且记录fam通道中的荧光。[0967]图18a为描绘使用双引物珠进行实时扩增而设置的反应混合物的动画。图18b为描绘实时反应中扩增产物的动画。[0968]终点rpa反应[0969]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1μm肌酸激酶、1mm dntp、20μm gp32融合、4.9μm uvsx、7.6μm uvsy以及0.146μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶来建立反应。反应混合物还包括800000个珠/μl，每个珠具有约750000个寡核苷酸引物/珠，该寡核苷酸引物由pa30正向引物与pb30反向引物的混合物组成。[0970]通过添加33.6mm mgoac和称为tf1l的人工dna模板(以800000个模板拷贝/μl反应混合物的终浓度)引发反应。[0971]相关的引物和模板如下所示。[0972]pa30正向引物：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag(seq id no：105)。[0973]pb30反向引物：cctatcccctgtgtgccttggcagtctcag(seq id no：106)。[0974]tf1l模板序列：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtgttttagggtccccggggttaaaaggtttcgaactcaacagctgtctggcagctcgctctacgcatgctattgctggcggtattgcttctgctcttgctggtggcgccatgtctaaattgtttggagctgagactgccaaggcacacaggggatagg(seq id no：108)。[0975]然后，将反应物在39℃孵育30分钟，然后通过添加十二烷基硫酸钠(sds)至1％终浓度并加热至65℃持续10分钟以使蛋白质变性来终止反应。[0976]通过用水稀释10倍、涡旋、在约18000下离心15分钟然后去除上清液来去除sds。将珠重悬于te ph 8.0、0.05％tritonx-100缓冲液中，以得到约800000个珠/μl。[0977]两种荧光寡核苷酸探针(pb30′探针(rox-5′‑ctgagactgccaaggcacacaggggat agg；seq id no：109)和tf1l探针(fam-5′‑ggtttcgaactcaacagctg；seq idno：110)，其中，rox为羧罗丹明(carboxyrhodamine)，fam为荧光素)在te ph 8.0、0.05％triton x-100、100mm nacl缓冲液中与珠杂交，两种探针的终浓度均为1μm和80000个珠/μl。通过加热至95℃持续2分钟，然后以0.1℃/秒的速度冷却至25℃而实施杂交。使用已连接tf1l扩增子的珠运行阳性对照。然后，通过将杂交混合物在te ph 8.0、0.05％triton x-100缓冲液中稀释六倍并以约18000g离心15分钟来清洁珠以去除未杂交的探针，然后去除尽可能多的上清液。将珠重悬于te ph 8.0、0.05％triton x-100缓冲液中。然后，将反应物在39℃在t8荧光计中孵育5分钟(fam水平设置为17％，rox水平设置为8％)，并且记录fam和rox通道中的荧光。[0978]图18c为描绘终点反应中扩增表征的动画。[0979]结果[0980]实时rpa反应[0981]图18d示出了使用特异性核酸外切酶切割探针的tf1l扩增子的实时荧光检测。图中指定的pa30引物百分比表示与珠结合的寡核苷酸为pa30寡核苷酸的百分比，其余与珠结合的寡核苷酸为pb30寡核苷酸。当所有pa30和pb30寡核苷酸引物都与珠结合时，以及当pa30和pb30寡核苷酸引物处于液相或pb30与珠结合且pa30处于液相时，检测到扩增。当珠上仅存在pb30并且没有pa30时，未检测到扩增。[0982]终点rpa反应[0983]使用对pb30寡核苷酸引物(rox标记的，图18e)和tf1l扩增子(fam标记的，图18f)特异的探针观察tf1l扩增子的终点荧光检测。图中指定的百分比表示与珠结合的寡核苷酸为pa30寡核苷酸的百分比，其余与珠结合的寡核苷酸为pb30寡核苷酸。下表显示了每种珠类型的荧光的水平、tf1l探针荧光与pb30′探针荧光的比率、以及标准化为直接连接tf1l扩增子的未扩增的对照珠的相同比率，以解释由不完全洗涤引起的背景荧光。[0984][0985]结论[0986]发现在实时和终点测定中使用gp32-his2融合蛋白都可以在没有拥挤剂(如peg)的情况下有效地发生核酸扩增。[0987]实施例19.包含固有无序区域的氨基酸序列的鉴定。[0988]通过metadisorder软件程序检查噬菌体vb ecom nbg1 gp32、t4 uvsy和t4 uvsx的氨基酸序列(metadisorder:a meta-server for the prediction of intrinsic disorder in proteins.kozlowski,l.p.,et al.,bmc bioinformatics,2012,13(1):111)。[0989]分别如图19a、19b和19c所示，噬菌体vb ecom nbg1 gp32、t4 uvsy和t4 uvsx的全长氨基酸序列含有当通过算法分析时得分大于0.5的氨基酸序列延伸段，并且因此包含固有无序区域序列。[0990]该实施例表明，可以使用标准分析方法容易地鉴定固有无序区域序列或其结构域。[0991]实施例20.rb69连接酶与具有源自人类otx1的idr标签的rb69连接酶的相分离促进活性的比较。[0992]实验的目的与概要[0993]实施该实验以评估含有标签的连接酶融合蛋白制剂的相分离促进活性，该标签包含在人类同源框蛋白otx1的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列(his2标签)。[0994]该实验表明，在没有拥挤剂的情况下，通过rb69连接酶-his2形成相分离的水性颗粒(球形粒)会通过mg2+浓度增强，而通过rb69连接酶形成球形粒则与mg2+浓度的相关性较差或根本没有相关性。[0995]材料与方法[0996]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24；表1)。这连接至rb69 dna连接酶的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组融合蛋白和无idr蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸以及无idr蛋白的c端的多组氨酸标签。该融合蛋白被命名为rb69连接酶-his2，而无idr蛋白被命名为rb69连接酶。蛋白质的完整氨基酸序列分别显示为下表24中的seq id no：111和seq id no：112。[0997]表24[0998][0999][1000]实验中使用的探针寡核苷酸为：用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[1001]配制50μl的溶液，其包含终浓度为1mg/ml的连接酶、50mm nacl、0.4μm fam-寡核苷酸以及目标浓度如相关图中所示的mgcl2。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，并且在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[1002]结果与结论[1003]如图20所示，在mg2+存在的情况下，rb69连接酶-his2增强了许多相分离的水性颗粒(球形粒)的形成，在寡核苷酸探针中观察到这些球形粒是密集的(如荧光标记所检测的那样)。未标记的rb69连接酶在增强球形粒形成方面几乎没有效果，即使在20mm mg2+时也是如此。[1004]实施例21.具有源自人类otx1的idr标签的rb69连接酶的连接酶活性性能的评估。[1005]实验的目的与概要[1006]实施该实验以评估含有标签的连接酶融合蛋白制剂的连接酶活性性能，该标签包含在人类同源框蛋白otx1(his2标签)的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列。[1007]该实验表明，当rb69连接酶-his2的浓度增加时，双连接产物增加。[1008]材料与方法[1009]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24；表1)。这连接至rb69 dna连接酶的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组idr融合蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸。该融合蛋白被命名为rb69连接酶-his2。该蛋白质的完整氨基酸序列显示于上表24中。[1010]连接模板是从puc19载体(new england biolab)扩增的170bp片段(lig170)。通过混合25μl dreamtaq green master mix(thermo fisher scientific)、0.2μm lig170_fw引物、0.2μmlig170_rv引物、1pg puc19建立50μl扩增反应。pcr反应实施如下：95℃持续2分钟；95℃持续30秒、55℃持续30秒和72℃持续1分钟的35个循环；接着，在72℃最终延伸5分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中运行。用monarch dna凝胶提取试剂盒(new england biolab)切除并纯化靶dna的条带。dna在5'端被t4多核苷酸激酶(t4 pnk，thermo fisher scientific)进一步磷酸化。通过混合1×反应缓冲液a、1mm atp、1u t4 pnk和来自上一步的dna建立50μl磷酸化反应。磷酸化反应在37℃孵育30分钟。5'-磷酸化的双链dna通过monarch pcr&dna清理试剂盒(new england biolab)进行纯化，并通过qubit dsdna hs测定试剂盒(thermo fisher scientific)进行量化。[1011]相关的引物和模板序列如下所示。[1012]lig170_fw引物：5’‑gagcgcaacgcaattaa-3’(seq id no：113)。[1013]lig170_rv引物：5’‑atccgctcacaattccacac-3’(seq id no：114)。[1014]lig170模板：5’‑gagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggat-3’(seq id no：115)。[1015]通过缓慢退火两种寡核苷酸1.5μm ilmn_ad_p5和1.5μm ilmn_ad_p7rc_idx01制备illumina接头(adaptor)。退火过程为将寡核苷酸混合物加热至95℃，并以0.1℃/min的速率冷却至14℃。[1016]ilmn_ad_p5：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seq id no：116)。[1017]ilmn_ad_p7rc_idx01：5’‑po4-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcgtatgccgtcttctgcttg-3’(seq id no：117)。[1018]rb69连接酶-his2为35mg/ml，并且将其稀释至1mg/ml作为工作原液。配制20μl溶液，其包含终浓度为1ng/μl的t4 pnk处理的lig170、187.5nm illumina接头、5％peg 35000、1×t4 dna连接酶反应缓冲液(new england biolab)以及终浓度为0.1/0.2/0.3/0.4mg/ml的rb69连接酶-his2。连接反应在16℃实施20分钟并且在65℃实施15分钟。为了在琼脂糖凝胶上进行可视化，每种反应条件设置了8个平行反应，并且在加载至2％琼脂糖凝胶之前合并。通过imagej(national institutes of health)分析凝胶图像，并且通过excel(microsoft)绘制条带的光密度。[1019]结果与结论[1020]如图21所示，当rb69连接酶-his2的浓度增加时，双连接产物增加。当0.4mg/ml的rb69连接酶-his2用于20μl反应(图中为0.8μg)时，93.5％的模板可以通过illumina接头在两端连接。[1021]实施例22.rb69连接酶与具有源自人类otx1的idr标签的rb69连接酶的连接酶活性性能的比较。[1022]实验的目的与概要[1023]实施该实验以评估含有标签的连接酶融合蛋白制剂的活性性能，该标签包含在人类同源框蛋白otx1(his2标签)的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列。[1024]该实验表明，与未标记的rb69连接酶的效率相比，his2标签可以显著提高rb69连接酶的ta连接效率。[1025]材料与方法[1026]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhhhqgyggsg(seq id no：24；表1)。这连接至rb69 dna连接酶的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组融合蛋白和无idr蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸和在无idr蛋白的c端的多组氨酸标签。该融合蛋白被命名为rb69连接酶-his2，并且该无idr蛋白被命名为rb69连接酶。这些蛋白质的完整氨基酸序列显示于上表24中。[1027]连接模板是从puc19载体(new england biolab)扩增的170bp片段(lig170)。通过混合25μl dreamtaq green master mix(thermo fisher scientific)、0.2μm lig170_fw引物、0.2μmlig170_rv引物、1pg puc19建立50μl扩增反应。pcr反应实施如下：95℃持续2分钟；95℃持续30秒、55℃持续30秒和72℃持续1分钟的35个循环；接着，在72℃最终延伸5分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中运行。用monarch dna凝胶提取试剂盒(new england biolab)切除并纯化靶dna的条带。dna在5'端被t4多核苷酸激酶(t4 pnk，thermo fisher scientific)进一步磷酸化。通过混合1×反应缓冲液a、1mm atp、1u t4 pnk和来自上一步的dna建立50μl磷酸化反应。磷酸化反应在37℃孵育30分钟。5'-磷酸化的双链dna通过monarch pcr&dna清理试剂盒(new england biolab)进行纯化，并通过qubit dsdna hs测定试剂盒(thermo fisher scientific)进行量化。dsdna hs测定试剂盒对纯化的dna进行量化，并且通过excel(microsoft)绘制dna的量。还通过2％琼脂糖凝胶分析dna。[1056]ilmn_p5：5’‑aatgatacggcgaccaccga-3’(seq id no：118)[1057]ilmn_p7：5’‑caagcagaagacggcatacg-3’(seq id no：119)[1058]结果与结论[1059]只有双连接产物可以被扩增。如图23所示，与nebnext ultra ii连接预混反应物相比，rb69连接酶-his2可以具有增强高达2.8倍的连接效率。[1060]实施例24.atp对具有源自人类otx1的idr标签的rb69连接酶的相分离性能的影响的分析。[1061]实验的目的与概要[1062]本实验的目的为分析atp对连接酶融合蛋白制剂导致相分离的能力的影响。该连接酶融合蛋白具有标签，该标签包含在人类同源框蛋白otx1(his2标签)的固有无序区域(idr)中发现的富含组氨酸的氨基酸结构域序列。[1063]该实验表明，atp显著增强了由his2标签介导的相分离。[1064]材料与方法[1065]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为aghhhhhphahhplsqssghhhhhhhhh hqgyggsg(seq id no：24)。这连接至rb69 dna连接酶的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组idr融合蛋白和无idr蛋白，该色谱法依赖于受试的融合蛋白的idr结构域标签中天然存在的组氨酸以及在无idr蛋白的c端的多组氨酸标签。该融合蛋白被命名为rb69连接酶-his2，而无idr蛋白被命名为rb69连接酶。蛋白质的完整氨基酸序列显示于上表24中。fam-寡核苷酸为用fam(荧光素)标记的ccgcaatggtgca ctctcagtacaatctgctctgatg(seq id no：104)。[1066]配制50μl溶液，其包含终浓度为1mg/ml的连接酶、0.4μm fam-寡核苷酸和0/20mm mgcl2以及0/1mm atp。然后，将10μl反应混合物转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，并且在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。[1067]结果与结论[1068]如图24所示，使用无idr的rb69连接酶观察到非常少的相分离的水性颗粒(球形粒)。rb69连接酶-his2在1mm atp存在下显著促进了许多球形粒的形成。添加20mm mg2+之后，观察到球形粒的荧光更亮，表明球形粒形成的进一步增强和/或更多dna被迫共定位在球形粒中。[1069]实施例25.使用具有源自酿酒酵母hrp1的idr标签的gp32在固体表面上的重组酶聚合酶扩增。[1070]实验的目的与概要[1071]实施该实验以评估含有标签的gp32融合蛋白制剂在固体表面上扩增的能力，该标签包含酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)。[1072]该实施例表明，在实时和终点测定中，在没有拥挤剂的情况下使用c端标记有酿酒酵母hrp1蛋白的固有无序区域(idr)的gp32在固体表面上对人工核酸模板的重组酶聚合酶扩增(rpa)。[1073]材料与方法[1074]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至t4噬菌体gp32的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组的融合蛋白，该色谱法依赖于放置在受试的融合蛋白的恰好c端的额外的七组氨酸标签，即放置在融合蛋白的c端的idr标签之后。该融合蛋白被命名为t4-gp32-hrp1。该融合蛋白的完整氨基酸序列如下显示为seq id no：120。[1075]mfkrkstaelaaqmaklngnkgfssedkgewklkldnagngqavirflpskndeqapfailvnhgfkkngkwyietcssthgdydscpvcqyiskndlyntdnkeyslvkrktsywanilvvkdpaapenegkvfkyrfgkkiwdkinamiavdvemgetpvdvtcpweganfvlkvkqvsgfsnydeskflnqsaipniddesfqkelfeqmvdlsemtskdkfksfeelntkfgqvmgtavmggaaataakkadkvaddldafnvddfntkteddfmssssgssssaddtdlddllndlggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmqhhhhhhh[1076](seq id no：120)[1077]然后，将重组t4噬菌体gp32融合蛋白在固体表面上进行无peg扩增(即在没有拥挤剂的情况下)测试。使用连接至珠的表面的两种寡核苷酸引物实施测试。通过使用终点反应在扩增子中发现的切口酶位点掺入荧光核苷酸来检测扩增。珠来源于bangs laboratories,inc.(https://www.bangslabs.com/)，并且其具有聚苯乙烯核心，该聚苯乙烯核心被羧化并接枝有共聚物，寡核苷酸共价连接至该共聚物。使用标准微加工技术(如光刻、软光刻、蚀刻等)将珠沉积在图案化成离散区域的玻璃基材上。得到的区域具有特性，如疏水性或亲水性，并且能够吸引或排斥待分析的样本。grace bio-lab flexwelltm可拆卸孵育腔室用于将单片图案化的玻璃分成八个反应腔室，每个反应腔室的尺寸为6.5mm×6.5mm，每个估计在表面上以有序阵列的形式含有1225万个珠。将不同量的扩增模板添加到不同的反应腔室，使得如果所有模板都与珠上的引物杂交，那么反应腔室将具有0、5、10、20、40或80个模板拷贝/珠，假设杂交的效率远低于100％。将单链dna模板(up1-up2′_tf1l模板序列：aatgatacggcgaccaccgtgatctacactgttttacaacctcagcatggaaaaaggtttcgaactcaacagctgtctggcagctcgctctacgcatgctattgctggcggtattgcttctgctcttgctggtggcgccatgtctaaattgtcgatacatctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no：121))添加至50μl缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、1mm edta、0.05％triton x-100、100mm nacl)中的反应腔室，用flexwelltm sealstripstm覆盖并加热至50℃持续1小时，以使模板退火至珠上的互补寡核苷酸。然后，去除过量的缓冲液，用ttm缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、10mm mgcl2、0.05％triton x-100)洗涤珠两次，然后用反应缓冲液(25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt)洗涤两次，以去除未退火的任何模板。[1078]通过混合25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt、2.5mm atp、20mm磷酸肌酸、1.7μm肌酸激酶、1mm dntp、6.6μm gp32融合物、2.7μm uvsx、2.7μm uvsy、0.22μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶以及23mm mgoac来建立反应。反应混合物还包括290000个珠/mm2，0.59μl反应混合物/mm2，每个珠具有约600000个寡核苷酸引物，由up1正向引物与up2-18反向引物的混合物组成，具有以下序列：[1079]up1正向引物：aatgatacggcgaccaccgagatctacac(seq id no：122)。[1080]up2-18反向引物：caagcagaagacggcata(seq id no：123)。[1081]然后，将反应在43℃孵育60分钟，然后通过用sttm缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、10mm mgcl2、0.05％triton x-100以及十二烷基硫酸钠(sds)至终浓度1％)洗涤(添加/去除)两次以使蛋白质变性而终止反应。然后，通过添加/去除ttm缓冲液(10mm tris hcl ph8.0、1mm edta、0.05％triton x-100)将珠洗涤两次以去除sds。[1082]然后，珠在25μl 1×cutsmart缓冲液(neb——50mm koac、20mm tris-乙酸盐、10mm mgoac、100μg/ml bsa、ph 7.9)中被2.5u切口酶nt.bbvci覆盖。up1-up2′_tf1l模板包括nt.bbvci(cc/tcagc)的识别位点的单个拷贝，其在dna的一条链中引入了切口。将珠加热至37℃持续45分钟以确保任何扩增子都被切割。通过用sttm缓冲液(10mm tris hcl ph8.0、1mm edta、0.05％triton x-100以及十二烷基硫酸钠(sds)至终浓度1％)洗涤(添加/去除)两次以使切口酶变性而终止切割。然后，通过添加/去除ttm缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、1mm edta、0.05％triton x-100)将珠洗涤两次以去除sds，并用反应缓冲液(25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt)洗涤两次。[1083]该方案中的最后一步是将荧光标记的dutp并入到扩增子中。这是通过将珠浸入具有0.11μm金黄色葡萄球菌dna聚合酶、160pm氨基烯丙基-dutp-xx-atto-594(jena bioscience)和23mm mgoac的反应缓冲液(25mm tris hcl ph 8.3、7.5mm koac、1mm dtt)中，并加热至43℃持续45分钟来完成的。通过用sttm缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、1mm edta、0.05％triton x-100以及十二烷基硫酸钠(sds)至终浓度1％)洗涤(添加/去除)两次以使切口酶变性来终止延伸。然后，通过添加/去除ttm缓冲液(10mm tris hcl ph 8.0、1mm edta、0.05％triton x-100)将珠洗涤两次以去除sds。然后去除flexwell，并且将玻璃盖玻片和小体积的ttm缓冲液放在玻璃晶片(wafer)上。使用荧光显微镜检查晶片，在相同位置拍摄明场和荧光照片。[1084]结果[1085]通过将atto-594标记的dutp掺入扩增子的nt.bbv ci切口位点，观察up1-up2′‑tf1l扩增子的终点荧光检测。图25显示，当不添加模板时，珠保持深色，但随着模板的增加，越来越多比例的珠发出荧光，并且荧光水平增加。[1086]结论[1087]据发现，在没有拥挤剂(如peg)的情况下，使用表面上的t4 gp32-hrp1融合蛋白，有效地发生核酸扩增。[1088]实施例26.gp32-hrp1 ssdna结合蛋白与相关的相分离对cas12a蛋白性能的影响的分析。[1089]实验的目的与概要[1090]本实验的目的是分析idr-标记的gp32 ssdna结合蛋白在聚乙二醇(peg)35k存在的情况下在促进相分离的条件下对cas12a核酸酶蛋白以及向导rna以结合并切割由荧光读数监测的双链dna靶标的活性的影响。使用的gp32 ssdna结合蛋白具有标签，该标签包含在酵母hrp蛋白(gp32-hrp1)的固有无序区域(idr)中发现的氨基酸结构域序列。在该标签与peg存在的情况下，即使在低浓度的蛋白质下，也在没有其它因素的情况下基本上发生相分离。[1091]在这种情况下，cas12a的双链核酸靶标具有6-fam/bhq1配对，当其被切割时生成含有6-fam标记的核苷酸片段，该标记应当必需立即从退火的杂交体中融化，从而导致可测量的荧光增加。该模板还被工程化为通过用于勾住的额外的单链区域与gp32-hrp1相互作用。[1092]该实验表明，在peg35k存在下使用gp32-hrp1 ssdna结合蛋白导致相分离的水性颗粒(小球或球形粒)的形成，并伴随cas12a在体外系统中切割其dna靶标的显著提高的速率。[1093]材料与方法[1094]使用的idr结构域标签的特定氨基酸序列为ggnnggnnmnrrggnfgnqgdfnqmyqnpmmggynpmmnpqamtdyyqkmqeyyqqmq(seq id no：9)。这连接至t4 gp32ssdna结合蛋白的c端。使用标准1步固定化金属(镍)亲和色谱法纯化重组idr融合蛋白，该色谱法依赖于附加至idr标签的c端的7个额外的组氨酸。该融合蛋白被命名为t4gp32-hrp1。该蛋白的完整氨基酸序列显示为seq id no：120。向导rna序列是5’‑uaauuucuacuguuguagauaaagugcucaucauuggaaaacg-3’(seq id no：134)。[1095]通过将两种寡核苷酸退火制备双链/单链dna靶标，顶部寡核苷酸5’‑gaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctatgtatcaaagcggccatttgcgg-3’，在5’端用fam(荧光素)标记(seq id no：135)；底部寡核苷酸5’‑agaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttc-3’，在3’端用bhq-1(淬灭剂)标记(seq id no：136)。退火过程为将1μm寡核苷酸混合物加热至95℃，并以0.1℃/min的速率冷却至14℃。这为具有提供的向导rna的cas12a核酸酶提供了双链靶位点，但也提供了额外的24个单链残基，这些残基可以与gp32-hrp1相互作用，预计结合约3个蛋白质单体。以这种方式，预计如果发生，那么大部分退火的靶标将被迫定位在相分离的gp32-hrp1小球中。此外，荧光团和淬灭剂在任一链上的存在，当退火时它们应当非常接近，但是在切割后分散(因为所得的杂交体只有几个核苷酸长)提供了一种方便的机制以评估切割的速率。正如预期的那样，在依赖于cas12a的方式中，荧光从通常的低水平变化并随着时间增加。[1096]engen lba cas12a蛋白购自new england biolab。[1097]配制包含或不包含cas12a蛋白、peg35k或t4 gp32 hrp1蛋白的溶液。该溶液由以下组成：30mm nacl、10mm tris乙酸盐ph8.3、20mm乙酸镁、0.1mg/ml bsa、33.3nm向导rna、50nm dsdna、5％peg35k。当包括在反应中时，以下组分以以下浓度存在：33.3nm cas12a蛋白，333ng/μl t4 gp32 hrp1蛋白。为了评估反应速率行为，将30μl反应溶液转移至0.2ml管中，并使用axxin t16荧光读数器进行分析，运行温度为42℃。独立地，将20μl反应溶液在42℃加热约1分钟，然后转移至c-芯片血细胞计数器载玻片，并且在明场光条件和荧光条件下拍摄图像。因此，这些图像代表了反应的最初几分钟内系统的微观状态的快照。[1098]结果与结论[1099]如图26a所示，在没有cas12a蛋白但存在gp32-hrp1和peg的情况下，观察到相分离的水性颗粒(球形粒)，但是在标记时仅表现出微弱的荧光，却在很大程度上淬灭，靶dna存在于gp32-hrp1和peg的存在下(在显微镜下分析反应的早期时间点)。当然地，预计不存在cas12a蛋白的切割，这由荧光随时间的变化很小支持，如荧光图的平坦特征所示(图26b)，尽管观察到一些荧光，可能是由于荧光团/淬灭剂探针的不完全退火以及由此引起的背景。[1100]当存在cas12a蛋白但不存在t4 gp32 hrp1时，未观察到球形粒，表明对t4 gp32 hrp1实现小球形成的预期要求。动力学分析表明，靶标切割随着时间稳定增加，评估时间长达10分钟。在显微镜下，整体荧光似乎略高于cas12a-欠缺(cas12a-minus)样本，表明在几分钟内处理了一些与动力学研究一致的退火的探针。[1101]然而，形成鲜明而显著的对比的是，在存在cas12a和t4 gp32-hrp1(和peg)的情况下，观察到许多球形粒，并且在整个显微镜图像中通常观察到强得多的荧光，表明小球形成需要t4 gp32-hrp1，但除此之外，这会导致更多处理(请注意，一旦处理，小的释放的产物不一定预期再定位到小球)。在这些条件下，动力学图也有明显和惊人的不同，并显示出非常快速的荧光积累，在1分钟左右或之前(就在样本被放入读数器之后)达到峰值，然后在剩余的分析时间内达到平台期。在存在t4 gp32-hrp1的情况下观察到的dna切割率的显著增强与我们提出的相分离的颗粒显著促进特异性切割的概念一致，大概是由cas12a蛋白及其dsdna靶标在球形粒内的共定位导致的，从而极大提高了反应的速率。以与本文展示的扩增系统类似的方式，这表明即使只有单个系统组件用于驱动相分离，其它参与者也可以被吸引到该相，从而导致局部高浓度与大规模加速的动力学。[1102]应当理解的是，公开的基于idr的方法、工艺、大分子、多肽和用途的不同应用可以针对本领域的特定需要进行定制。还应理解，本文所使用的术语仅仅是出于描述本发明的特定实施方案的目的，而并非旨在限制。[1103]如在此说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非内容另有明确规定。因此，例如，对实体(如“一种大分子”、“一种多肽”、“一种多核苷酸”、“一种细胞”、“一种宿主细胞”等)的提及包括两种或更多种这样的实体。[1104]除非内容另有明确规定，否则如“约”和“大约”等术语应理解为包括相关数字+/-10％的数值，或+/-5％的数值。[1105]在数字范围显示为“介于(between)”较低值与较高值之间的情况下，该范围应解释为包括较高值与较低值。例如，22mm至50mm的范围或约22mm至约50mm的范围应解释为包括22mm与50mm的值或约22mm与约50mm的值。[1106]本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文。









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