CRM197蛋白表达方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术crm197蛋白表达方法技术领域1.本发明涉及用于在大肠杆菌中表达crm197蛋白并将所述crm197蛋白分泌到周质中的信号序列及其用途，并且更具体地涉及用于表达crm197蛋白的信号序列、编码所述信号序列的核酸、包含所述核酸和crm197蛋白基因的核酸构建体或表达载体、引入了所述核酸构建体或表达载体的重组微生物、以及包括培养所述重组微生物的产生所述crm197蛋白的方法。背景技术：2.白喉毒素(dt)是一种蛋白质外毒素，并且由白喉棒状杆菌的致病菌株分泌。白喉毒素是adp-核糖基化酶，其作为由535个残基构成的酶原被分泌并通过用胰蛋白酶样蛋白酶处理分离成两个片段(片段a和b)。片段a是催化活性区域并且是nad依赖性adp-核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白质合成因子ef-2，由此在细胞中灭活ef-2和中断蛋白质合成。3.crm197是通过分离白喉毒素的各种无毒形式和部分有毒的免疫交叉反应形式(crm或交叉反应物质)发现的(uchida等人,journal of biological chemistry 248,3845-3850,1973)。优选地，crm可具有预定的大小和包含全部或部分dt的组合物。4.crm197是白喉毒素的酶促高度无活性且无毒的形式，其含有单一氨基酸取代(g52e)。该突变赋予位于nad结合位点前面的活性位点环的内在柔性，从而降低crm197与nad的结合亲和力并去除dt的毒性(malito等人,proc.natl.acad.sci.usa 109(14):5229-342012)。crm197，如dt一样，具有两个二硫键。一个二硫键将cys186连接至cys201，从而将片段a连接至片段b。在片段b中另一个二硫键将cys461连接至cys471。dt和crm197具有源自片段a的核酸酶活性(bruce等人,proc.natl.acad.sci.usa 87,2995-8,1990)。5.除非化学连接到蛋白质，否则许多抗原具有低免疫原性，尤其是在婴儿和幼儿中，因此将这些抗原生产为缀合物或缀合疫苗。在这些缀合物疫苗中，蛋白质组分也称为“载体蛋白”。crm197通常用作蛋白质-碳水化合物缀合物和半抗原-蛋白质缀合物中的载体蛋白。crm197作为载体蛋白质，具有优于白喉类毒素以及其他类毒素蛋白的若干优点(shinefield vaccine,28:4335,2010)。6.制备白喉毒素(dt)的方法是本领域熟知的。例如，可以通过从白喉棒状杆菌的培养物中纯化毒素、然后进行化学脱毒，或通过纯化毒素的重组类似物或遗传脱毒类似物来产生dt。7.蛋白质的丰度使其不可能实现用于疫苗的诸如crm197等白喉毒素的大规模生产。此问题先前已通过在大肠杆菌中表达crm197而得以解决(bishai,等人,j.bacteriol.169:5140-5151)，并且bishai等人已报道了含有毒素的重组融合蛋白(包括tox信号序列)，从而产生降解的蛋白质。8.与细胞质产生相比，周质中细菌毒素的产生的特征在于，i)蛋白质在切割信号肽后以成熟形式产生，或ii)大肠杆菌的周质是允许形成二硫键的氧化环境，可以有助于产生适当折叠的可溶性蛋白质，iii)与细胞质相比大肠杆菌的周质含有更少的蛋白酶，这有助于避免所表达蛋白质的蛋白水解切割，以及iv)周质还含有更少蛋白质，这允许以更高的纯度获得重组蛋白。9.通常，蛋白质上的信号序列的存在有利于将蛋白质转运(原核宿主)或分泌(真核宿主)到周质中。在原核宿主中，信号序列使新形成的蛋白质坐落到跨内膜的周质中，然后信号序列被切割。也就是说，重要的是要寻找能够更高效地大规模产生商业基本蛋白质的信号序列，并且有必要开发重组微生物。10.因此，由于开发以高效且有成本效益的方式产生crm197蛋白的方法的大量努力，诸位发明人选择特定信号序列，通过结合密码子背景与二级结构来设计核苷酸序列以优化在大肠杆菌中的翻译，优化编码crm197蛋白的crm197核苷酸序列在大肠杆菌中的表达，并且发现在使用这些时在不改变ph的情况下crm197在大肠杆菌中高效地表达并且高效地分泌到周质中，由此完成了本发明。11.此背景技术章节中公开的信息仅为更好理解本发明背景而提供，并且因此所述信息可能不包括形成对本领域技术人员而言已经清楚的现有技术的信息。技术实现要素：12.本发明的一个目的是提供一种用于表达具有特定序列的crm197蛋白的信号序列；编码信号序列的核酸；以及使用所述核酸产生crm197蛋白的方法，以通过将crm197蛋白分泌到大肠杆菌的周质中使得crm197蛋白的表达最大化同时使得crm197蛋白对大肠杆菌的毒性最小化。13.为了实现所述目的，本发明提供了一种用于表达crm197蛋白的信号序列，所述信号序列由seq id no:13至seq id no:21的氨基酸序列中的任一个表示。14.本发明还提供了一种编码用于表达所述crm197蛋白的信号序列的核酸。15.本发明还提供了一种包含所述核酸和所述crm197蛋白的基因的核酸构建体或表达载体，一种引入了所述核酸构建体或表达载体的重组微生物，以及一种包括培养所述重组微生物的产生crm197蛋白的方法。附图说明16.图1是展示表达模块tpb1tv1.3的示意图，其中ptrc是指trc启动子，rbs是指富a/u增强子+sd，λtr2&t7te和rrnb t1t2是指转录终止子，以及bsai和drai是指用于克隆的限制性酶切位点。17.图2展示了大肠杆菌表达质粒phex1.3，其中ori(pbr322)是指pbr322的复制起点，kanr是指卡那霉素标记物，laci是指laci基因，以及其他符号与图1中的相同。18.图3是展示crm197表达质粒的产生的示意图，其中t1是指λtr2&t7te转录终止子，t2是指rrnb t1t2转录终止子，箭头是指pcr引物，字母字符a、b、c和d是指lic的同源区域，以及其余符号与图1中的相同。19.图4展示了在各种大肠杆菌菌株中l3和l5融合物crm197的表达行为，以及在总大肠杆菌细胞的sds-page之后考马斯染色(左)和蛋白质印迹(右)的结果，其中c是指c2894h，b是指bl21(de3)，w是指w3110-1，o是指origamitm2，s是指shuffle，c-v表示用作阴性对照的含有phex1.3的c2984h，l3和l5表示融合信号序列，以及crm197表示参照crm197，并且将细胞在每个孔中以对应于od600 0.025的密度加载以用于考马斯染色，并且以对应于od600 0.0005的密度加载以用于蛋白质印迹。20.图5展示了诱导剂的类型和浓度对l5诱导的crm197表达的影响，并展示了sds-page之后的考马斯染色(左)和蛋白质印迹(右)的情况，其中加载的细胞的量与图4中的相同，i是指不溶性级分，s是指可溶性级分，(a)示出在25℃下的培养物，以及(b)示出在30℃的培养物。21.图6展示了由l5融合物诱导的crm197蛋白的位置，其中顶部示出sds-page之后的考马斯染色，底部示出蛋白质印迹，cr表示参照crm197，箭头表示成熟的crm197的位置，p1是指在用质膜诱导缓冲液处理之后获得的上清液，p2是指周质级分，以及cy是指细胞质级分。22.图7展示了诱导剂的类型和浓度对l3诱导的crm197表达的影响，其中(a)示出在25℃下的培养物，以及(b)示出在30℃下的培养物。23.图8示出了l3融合物诱导的crm197蛋白的位置。24.图9示出了l3菌株的ph、温度、叶轮速度和溶解氧(do)的变化，以及表达诱导剂的添加时间，其中(a)示出了温度维持在30℃的情形，并且(b)示出了在表达诱导之前将温度降至25℃的情况。25.图10示出了l5菌株的ph、温度、叶轮速度和溶解氧(do)的变化，以及表达诱导剂的添加时间。26.图11示出了在培养过程中添加表达诱导剂之前和之后crm197蛋白表达的变化，其中(a)示出了在30℃诱导的l3菌株的表达，(b)示出在25℃诱导的l3菌株的表达，(c)示出在25℃诱导的l5菌株的表达。在(a)中200ng的参照crm197加载于第3和10列，在(b)中为第4和10列，以及在(c)中为第3和9列。在(a)中第1和2列、在(b)中第1、2和3列以及在(c)中第1和2列是添加表达诱导剂之前的细胞培养溶液，以及在(a)中第16列和第16列(c)是在完成培养之后的上清液，随后的列为在添加诱导剂之后每2小时取样的细胞培养溶液。加载的量与图4中的相同。27.图12展示了l3/l5菌株中crm197蛋白的表达和分离行为，其中(a)展示了使用l3的培养物中的蛋白质分离行为，(b)展示了使用l5的培养物中的蛋白质分离行为，第1列加载200ng的参照crm197，第2列是在完成培养之后的总细胞培养溶液，第3列是在用质膜诱导缓冲液处理之后的上清液，第4和7列是周质级分(第7列的蛋白质加载量是第4列的4倍)，以及第5和6列表示细胞质级分。28.图13展示了通过deae色谱(a)和ha色谱(b)纯化的样品的sds-page的结果。在(a)中，第1列是指由棒状杆菌产生的crm197，第2列是指在回收的周质级分中存在的蛋白质，第3列是指在加载于deae色谱中之前的在超滤后浓缩两倍的样品，第4和5列用于使用deae色谱的流通模式和洗涤溶液检测除了crm197之外的杂质蛋白质，第6列是已去除了杂质的洗脱样品，第7列是通过使用高浓度盐以去除所有与树脂结合的蛋白质而洗脱的样品。在(b)中的ha elu是在去除未与ha树脂结合的蛋白质之后洗脱的crm197。29.图14展示了最终纯化的crm197的sec-hplc分析的结果，其中纯度为99％或更高。30.图15示出了sds-page(左)和蛋白质印迹(右)的结果。第1列是由棒状杆菌产生的crm197，以及第2列是由大肠杆菌(l3)产生的crm197。两个crm197均在相同位置处示出条带。31.图16展示了使用lc/ms得出的完整蛋白质分子质量分析的结果，其中分子量为58,409da，其对应于理论分子量。32.图17展示了圆二色(cd)分析的结果，并表明由棒状杆菌产生的crm197(●)与由大肠杆菌phex-l3产生的crm197(x)之间没有高级结构差异。33.图18展示了荧光光谱分析的结果，其中由棒状杆菌产生的crm197(●)与由大肠杆菌phex-l3产生的crm197(实线)具有相同的338nm最大发射波长。具体实施方式34.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与由本发明所属领域中的技术人员所理解的含义相同。通常，本文所用的命名法是本领域中熟知的，并且是通常使用的。35.在本发明的一个实施方案中，将9种信号序列与crm197蛋白融合以诱导其表达。对于每种信号序列，在考虑密码子背景和mrna的二级结构的情况下，设计了针对翻译优化的核苷酸序列(seq id no:4至seq id no:12)将这些构建体插入表达质粒phex1.3中，并在五种大肠杆菌菌株中观察到crm197的表达，从而找到每种构建体的最佳大肠杆菌菌株。此外，在所选择的大肠杆菌中设定培养温度以及诱导剂的类型和浓度。用所述构建体转化各种大肠杆菌菌株的结果是，即使在其中未工程化与氧化还原电位相关的基因(trxb，gor)的菌株中crm197蛋白也可以以可溶性形式表达，并且可以分泌到周质中。36.因此，在一个方面，本发明涉及一种用于表达crm197蛋白的信号序列，所述信号序列由seq id no:13至seq id no:21的氨基酸序列中的任一个表示。37.在另一方面，本发明涉及一种编码用于表达所述crm197蛋白的信号序列的核酸。38.在本发明中，所述核酸可以由seq id no:4至seq id no:12的核苷酸序列中的任一个表示，优选由seq id no:6或seq id no:8的核苷酸序列表示，但不限于此。39.如本文所用，术语“用于表达crm197蛋白的信号序列”是指用于表达crm197蛋白并将crm197蛋白分泌到周质中的信号序列。40.在本发明的一个实施方案中，选择靶向大肠杆菌外膜的蛋白质的信号序列和源自m13噬菌体的信号序列(表3)，以将crm197蛋白分泌到周质中。通过结合密码子背景与二级结构设计核苷酸序列(seq id no:4至seq id no:12)，以优化所选择的信号序列在大肠杆菌中的翻译。41.在另一方面，本发明涉及一种核酸构建体，其包含编码用于表达crm197蛋白的信号序列的核酸和crm197蛋白的基因。42.在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其包含编码用于表达crm197蛋白的信号序列的核酸和crm197蛋白的基因。43.在本发明的一个实施方案中，编码crm197蛋白的氨基酸序列(seq id no:3)的dna序列还针对大肠杆菌表达进行了优化(seq id no:2)。将每种设计的信号序列的dna片段和优化的crm197 dna片段插入质粒phex1.3中(图3)。44.在本发明中，可以使用任何crm197蛋白基因而不受限制，只要它是编码crm197蛋白的基因即可。优选地，crm197蛋白基因可以由seq id no:2的核苷酸序列表示，但不限于此。45.如本文所用，术语“转化”是指将特定的外部dna链从细胞外部引入细胞中。包含引入的dna链的宿主微生物称为“经转化的微生物”。如本文所用，意为将dna引入宿主中并使dna通过染色体外因子或染色体整合可复制的术语“转化”表明，包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体被引入宿主细胞中或编码靶蛋白的多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中，以在宿主细胞中表达由所述多核苷酸编码的蛋白质。经转化的多核苷酸包括插入并位于宿主细胞染色体内部的经转化多核苷酸和位于染色体外部的经转化多核苷酸二者，只要它可以在宿主细胞中表达即可。46.如本文所用，术语“核酸构建体”包括插入并位于宿主细胞染色体内部的核酸构建体和位于染色体外部的核酸构建体二者，只要它可以在宿主细胞中表达即可。47.此外，如本文所用，术语“多核苷酸”与术语“核酸”可互换使用，并且包括编码靶蛋白的dna和rna。可以将所述多核苷酸以任何形式引入，只要可以将它引入宿主细胞中并在其中表达即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞中，所述表达盒是包含自我表达所需的所有元件的基因构建体。所述表达盒通常包含启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号，它们与所述核酸可操作地连接。所述表达盒可以采用允许自我复制的表达载体。也可以将所述多核苷酸以其天然形式引入宿主细胞中，并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。48.如本文所用，术语“载体”是指包含与能够在合适的宿主中表达dna的合适调节序列可操作地连接的dna序列的dna产物。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。当转化到合适的宿主中时，载体可以独立于宿主基因组复制或者发挥功能，或者一些载体可以与基因组整合。质粒是目前最常用的载体形式。因此，术语“质粒”和“载体”可互换使用。49.考虑到本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于实现所述目的的典型质粒载体包含(a)高效进行复制的复制起点，以便在每个宿主细胞中包括若干个到数百个质粒载体，(b)用以筛选用质粒载体转化的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)插入外源dna片段的限制性酶切割位点。即使不存在适当的限制性酶切割位点，载体和外源dna也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头容易地连接。50.另外，当基因与另一核酸序列基于它们之间的功能关系对齐时，称为与其“可操作地连接”。这可以是以如下方式连接的一个或多个基因和一个或多个调节序列，所述连接方式使得当合适的分子(例如，转录激活因子蛋白)与一个或多个调节序列连接时实现基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的dna与所述多肽的dna可操作地连接；当启动子或增强子影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；当核糖体结合位点影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当被定位以促进翻译时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。51.通常，术语“可操作地连接”是指所连接的dna序列与其接触，或者是指分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，增强子不需要与其接触。这些序列的连接是通过在便利的限制性酶切位点处的连接进行的。当不存在这样的位点时，根据常规方法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。52.在本发明中，所述表达载体可以进一步包含trc启动子。53.在本发明中，所述表达载体可以是phex1.3，但不限于此。54.已知crm197由于其核酸酶活性，对大肠杆菌具有高毒性。因此，在不期望的条件下的crm197表达可对大肠杆菌生长产生不利影响。大肠杆菌表达质粒phex1.3具有laci基因，并且可抑制trc启动子的背景表达，并且插入此质粒中的表达模块tpb1tv1.3(图1)被设计为通过以下方式抑制从源自质粒的启动子转录的crm197的表达：将源自λ噬菌体的tr2转录终止子和源自t7噬菌体的te转录终止子插入待表达的crm197基因的上游中，并且将源自大肠杆菌的rrnb t1t2转录终止子插入所述基因的下游中。55.在另一方面，本发明涉及引入了所述核酸构建体或所述表达载体的重组微生物。56.在本发明中，所述重组微生物可以是大肠杆菌，但不限于此。57.通常使用具有高dna引入效率和引入的dna的高表达效率的宿主细胞作为所述重组微生物，所有的细菌、酵母、霉菌等，即包括原核和真核细胞的所有微生物是可用的，并且在本发明的例子中使用大肠杆菌，但是本发明不限于此，而是可以使用任何类型的微生物，只要crm197蛋白可以充分表达即可。58.应当理解的是，并非所有载体在表达本发明的dna序列时都同样地发挥作用。同样，并非所有宿主对同一表达系统都起相同作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从各种不同载体、表达调节序列和宿主进行适当的选择。例如，应当在考虑宿主的情况下选择载体，因为载体应可在宿主中复制。还应考虑载体的复制次数、控制载体复制次数的能力和由相应载体编码的其他蛋白质的表达(如抗生素标记的表达)。59.可以根据任何已知的转化方法制备转化的重组微生物。60.在本发明中，用于将基因插入宿主细胞染色体中的方法可以选自常规已知的遗传操纵方法，例如使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体或非病毒载体的方法。61.另外，除了使用表达载体之外，还可以通过将核酸构建体直接插入宿主细胞的染色体中进行转化。62.一般来说，可以使用电穿孔、脂质体转染、弹道递送、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸dna、人工病毒粒体、化学促进的dna流入、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、乙酸锂-dmso方法等。63.例如，声孔效应(sonoporation)，例如使用sonitron 2000系统(rich-mar)的方法，也可用于核酸的递送，而其他代表性核酸递送系统包括amaxa biosystems(科隆，德国)、maxcyte,inc.(罗克维尔，马里兰州)和btx molecular system(霍利斯顿，马塞诸塞州)。在美国专利号5,049,386、美国专利号4,946,787和美国专利号4,897,355中披露了脂质体转染方法，并且脂质体转染试剂是可商购的，例如transfectamtm和lipofectintm。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质体转染的阳离子或中性脂质包括felgner的脂质(wo 91/17424和wo 91/16024)，其可以通过离体转导递送至细胞并通过体内转导靶向组织。制备含有靶脂质体的脂质:核酸复合物(如免疫脂质复合物)的方法是本领域熟知的(crystal,science.,270:404-410,1995；blaese等人,cancer gene ther.,2:291-297,1995；behr等人,bioconjugate chem.,5:382389,1994；remy等人,bioconjugate chem.,5:647-654,1994；gao等人,gene therapy.,2:710-722,1995；ahmad等人,cancer res.,52:4817-4820,1992；美国专利号4,186,183；美国专利号4,217,344；美国专利号4,235,871；美国专利号4,261,975；美国专利号4,485,054；美国专利号4,501,728；美国专利号4,774,085；美国专利号4,837,028；美国专利号4,946,787)。64.在本发明的一个实施方案中，用制备的质粒载体转化各种大肠杆菌菌株(表4)的结果是，对于l3融合物，crm197在所有菌株中表达，而对于l5融合物，crm197在除了origamitm2之外的菌株中表达(图4)。即使在其中未工程化与氧化还原电位相关的基因(trxb，gor)的菌株中，l3和l5融合物二者也均能够表达可溶性形式的crm197蛋白，并且所述蛋白质具有与从亲本菌株分离的蛋白质相同的物理化学/免疫特性。此外，在l3融合物的情形下，crm197蛋白可以在25℃以及30℃下以可溶性形式表达(图7和图12a)。65.先前的报告显示，当在6.5至6.8的ph下培养，然后在诱导过程中变动至ph 7.5时，crm197到周质中的分泌得以改善。相比之下，发现在本发明中制备的菌株在没有变动培养基的ph的情况下将crm197高效地分泌到周质中(图12)。在没有变动ph的情况下以高浓度培养的l5融合物的情形下，crm197的生产率为3.7g/l，并且2g/l或更多的crm197分泌到周质中。66.在另一方面，本发明涉及一种产生crm197蛋白的方法，其包括(a)培养引入了所述核酸构建体或所述表达载体的重组微生物以产生crm197蛋白，以及(b)回收所产生的crm197蛋白。67.在本发明中，步骤(b)可以包括回收分泌到周质中的crm197蛋白。68.在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。然而，对于本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。69.实施例1：crm197过表达质粒的制备70.实施例1.1：质粒phex1.3的构建71.如下制备表达质粒phex1.3的大肠杆菌。用sspi和drai双重消化ptrc99a(amann等人,gene.69,301-15,1988)后，使用琼脂糖电泳纯化约3.2kb的dna片段。使用pcr扩增卡那霉素抗性基因。本文使用的模板是质粒pcr2.1，并且本文使用的引物是kf2和kr(表1)。72.[表1][0073]pcr引物[0074][0075][0076][0077]使用2.5mm的每种dntp、10pmol的每种引物、200至500ng的模板dna、1.25u的primestar hs dna聚合酶(takara bio inc.，日本)和50μl的反应体积制备pcr反应溶液，并且pcr进行30个循环，每个循环包括三个步骤：98℃ 10秒、60℃ 5秒、以及72℃min/kb。在用bamhi和hindiii双重消化pcr条件下产生的约0.8kb的dna片段之后，将dna片段用klenow片段填充以形成平端，然后使用t4 dna连接酶与先前过程中制备的3.2kb dna片段连接。将该反应溶液转化到大肠杆菌c2984h中以制备phex1.1，其中将选择标记amp取代为km。[0078]在bioneer中合成包含启动子、rbs和转录终止子的表达模块tpb1bv1.3(图1)(seq id no:1)。在phex1.3上加载表达模块tpb1bv1.3的过程如下。在体外将通过使用表达模块tpb1bv1.3作为模板以及tpb_f和tpb_r作为引物(表1)的pcr扩增获得的dna片段(1255bp)与通过使用phex1.1作为模板以及phex_f和phex_r作为引物的pcr扩增获得的dna片段(4561bp)经由不依赖于连接的克隆(lic；jeong等人,appl environ microbiol.78,5440-3,2012)在示于表2中的条件下组装在一起，并且将所得产物转化到大肠杆菌c2984h中以制备phex1.3(图2)。[0079][表2][0080]lic反应溶液[0081] 物料浓度线性化载体100ng插入物140ng插入物2(如有必要)40ngt4 dna聚合酶(neb)1uh2o直到10μl[0082]lic反应条件：将载体用限制酶消化，或通过pcr产生线性dna片段。使用pcr制备插入物。将载体与如示于上表中的插入物混合，然后在室温下反应2分30秒。[0083]实施例1.2：crm197基因的构建[0084]在genscript中合成最佳表达于大肠杆菌中的crm197的核苷酸序列(crm197ec)(seq id no:2)。由crm197ec编码的氨基酸序列是seq id no:3。[0085]实施例1.3：信号序列基因的构建[0086]用于将crm197蛋白分泌到大肠杆菌的周质中的信号序列示于下表3中(seq id no:13至21)。为了优化在大肠杆菌中的表达，在考虑密码子背景和二级结构的情况下，合成了seq id no:4至12的dna(表3)。[0087][表3][0088]用于本发明的信号序列[0089][0090][0091]实施例1.4：过表达crm197的质粒的构建[0092]如图3中所示，制备用于在大肠杆菌中过表达crm197并将crm197分泌到周质中的质粒。在将phex1.3用bsai和drai双重消化之后，使用琼脂糖电泳分离约5kb长的dna片段。通过使用表1中所示的引物和模板的pcr对信号序列l1至l9进行扩增。通过使用表1中所示的引物和模板的pcr对使用lic方法融合了crm197基因与每种信号序列的crm197dna片段进行扩增。在体外将用bsai和drai消化的phex1.3、每个信号序列片段以及与其相容的crm197片段使用上文所述的lic条件组装在一起，然后将所得产物转化到大肠杆菌c2984h中，以制备包含与对应信号序列融合的crm197的质粒phex-l1-crm、phex-l2-crm、phex-l3-crm、phex-l4-crm、phex-l5-crm、phex-l6-crm、phex-l7-crm、phex-l8-crm和phex-l9-crm。[0093]实施例2：crm197蛋白在大肠杆菌中的表达[0094]在考虑表达水平和细胞生长程度的情况下，从实施例1中制备的质粒中选择phex-l3-crm和phex-l5-crm。在将phex-l3-crm和phex-l5-crm转化到下表4的大肠杆菌菌株中之后，评价crm197蛋白的表达和表达位置。[0095][表4][0096]本发明中使用的大肠杆菌菌株[0097][0098]培养方法如下。将在固体培养基(10g/l大豆蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l nacl，15g/l琼脂)上产生的菌落在含有100mm磷酸钾(ph 7.5)、km 50μg/ml和0.2％乳糖的lb液体培养基中摇动培养，对所有细胞进行sds-page，然后使用考马斯染色和蛋白质印迹分析crm197表达(图4)。对于l3融合物，crm197蛋白在所有使用的菌株中表达，而对于l5融合物，在转化到origamitm2中时在液体培养基中的生长是不可能的。在其他菌株中，观察到crm197蛋白表达。[0099]实施例2.1：通过l5的crm197表达[0100]将含有phex-l5-crm的bl21(de3)在含有100mm磷酸钾(ph 7.5)和km 50μg/ml的lb液体培养基(50ml/500ml挡板烧瓶)中培养，直至od600达到0.4至0.6。然后，添加0.2％、0.4％或0.6％乳糖或0.02mm、0.2mm或2mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)作为诱导剂诱导表达。培养温度为25℃或30℃。在培养后，将细胞回收，悬浮在50mm磷酸钾(ph 7.0)中，然后通过超声处理破碎。在破碎后，进行离心以将上清液(可溶性级分)与沉淀物(不溶性级分)分离。在每个样品的sds-page之后，使用考马斯染色和蛋白质印迹分析crm197蛋白的表达(图5)。当添加诱导剂(乳糖，iptg)并然后在25℃下进行培养时，大多数表达的crm197蛋白以可溶性形式存在，并且具有与参照crm197相同的分子量，这表明表达的蛋白质是去除了l5信号序列的成熟crm197(图5a)。另一方面，当使用乳糖作为诱导剂并在30℃下进行培养时，在不溶性级分中发现约50％的crm197蛋白，并且当添加iptg作为诱导剂时，大多数crm197蛋白被发现于不溶性级分中(图5b)。[0101]使用渗透压冲击回收周质级分，以检测crm197表达的位置。过程如下。将含有phex-l5-crm的bl21(de3)在25℃下培养，然后离心以回收细胞。将细胞重悬浮于质膜诱导缓冲液[30mm tris-hcl(ph 8.0)，20％蔗糖，1或10mm edta，1mm pmsf(苯甲基磺酰氟)]中，直至细胞浓度达到od600为10，并在室温下搅拌0.5至1小时。然后，通过以4,000x g离心15分钟收集细胞，并添加相同量的30mm冷(4℃或更低)tris-hcl(ph 8.0)，随后在室温下搅拌0.5至1小时。然后，将细胞以4,000x g离心15分钟以获得上清液(周质级分，p2)。在用质膜诱导缓冲液处理之后，使用sds-page展开上清液(p1)、周质级分(p2)和细胞质级分，然后使用考马斯染色和蛋白质印迹评价crm197的表达和所表达crm197的位置(图5)。发现l5可以成功地将crm197分泌到周质中(图6)。作为质膜诱导缓冲液的edta在10mm下比在1mm下更有效。[0102]实施例2.2：通过l3的crm197表达[0103]在与实施例2.1中相同的条件下表达含有phex-l3-crm的bl21(de3)。发现与l5不同，通过l3诱导的crm197在所有条件下以可溶性形式存在(图7)，并分泌到周质中(图8)。[0104]实施例3：大肠杆菌bl21(de3)的培养[0105]使用以下方法培养含有phex-l3-crm或phex-l5-crm的bl21(de3)菌株。在主要培养期间，使用恒定ph方法进行进料，并且使用进料溶液(600g/l葡萄糖，30g/l酵母提取物)和碱溶液(14％-15％氨)将ph保持在7.3。用于培养的溶液和培养基的组成示于表5和表6中。[0106][表5][0107]用于本发明中的培养的溶液和培养基的组成[0108][0109][表6][0110]用于本发明的培养的微量金属的组成[0111] 微量金属(100x,/l)edta840mgcocl2·6h2o250mgmncl2·4h2o1.5gcucl2·2h2o150mgh3bo3300mgna2moo4·2h2o250mgzn(ch3coo)2·2h2o1.3g柠檬酸铁(iii)10g[0112]将在改良的lb琼脂培养基[改良的luria-bertani(lb)琼脂：10g/l大豆蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，15g/l琼脂，50mg/l卡那霉素]中形成的单菌落接种到种子培养基中，随后在30℃孵育18小时。再次将所得种子培养物以1％(v/v)的比率接种在主要培养基(3l/5l发酵罐)中并在30℃下培养。通过向种子培养基中添加0.1％的灭菌消泡剂来获得主要培养基。在培养溶液的吸光度达到30-40后，将温度降至25℃。然后，添加10mm iptg，并在培养溶液吸光度达到100至120之后终止培养。[0113]在5l发酵罐中含有phex-l3-crm的大肠杆菌bl21(de3)的培养行为示于图9中，并且含有phex-l5-crm的大肠杆菌bl21(de3)的培养行为示于图10中。crm197在5l发酵罐中发酵时的表达行为示于图11中，并且对于l3融合物，表达产率为1.1至1.2g/l，而对于l5融合物，表达产率为3.0至3.7g/l。sds-page/考马斯染色之后，通过使用密度计(gs-900tm，bio-rad laboratories ins.，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)与参照crm197比较相对量来测量crm197的量。[0114]实施例4：蛋白质纯化[0115]实施例4.1：从细胞培养物中产生周质级分[0116]从5l发酵罐中培养的细胞中回收周质级分的程序如下。将细胞培养基在4℃和4,000x g下离心15分钟以沉淀细胞。基于100的吸光度将细胞沉淀物重悬浮于修饰的蛋白质的质膜诱导缓冲液(表7)中，并在室温下搅拌0.5至1小时。[0117][表7][0118]用于制备本发明的周质级分的缓冲溶液的组成[0119][0120]然后，通过以4,000x g离心15分钟收集细胞，并添加相同量的30mm冷(在4℃或更低)tris-hcl(ph 8.0)，随后在室温下搅拌0.5至1小时。然后，将细胞以4,000x g离心15分钟以获得上清液，并使用mf去除杂质。通过上述过程从含有phex-l3-crm的大肠杆菌bl21(de3)回收的周质级分的sds-page分析示于图12(a)中，并且从含有phex-l5-crm的大肠杆菌bl21(de3)回收的周质级分的sds-page分析示于图12(b)中。发现存在于周质级分中的crm197蛋白的量对于l3菌株为1.2g/l，而对于l5菌株为2.3g/l(表8)。[0121][表8][0122]通过本发明的培养获得的crm197蛋白的量[0123][0124]实施例4.2：crm197蛋白的纯化[0125]使用tff系统用10kda截止膜将phex-l3-crm培养基的周质级分浓缩两次，并使用十个体积的10mm磷酸钠溶剂(ph 7.2)进行超滤。通过使用akta纯(ge healthcare)系统的两个柱过程完成纯化。第一柱过程是阴离子交换色谱(二乙基氨基乙基琼脂糖速流树脂，deae)，并用于去除核酸和杂质蛋白质。deae树脂带负电荷(-)，并与带正电荷(+)的蛋白质结合。将未结合的蛋白质和杂质主要通过deae色谱从经超滤的样品中提取并去除，然后将具有低结合能力的除了crm197之外的不纯蛋白质通过随后基于盐浓度的洗涤过程去除。然后，通过增加盐浓度仅洗脱crm197。在使用deae色谱的纯化过程期间对样品进行sds-page分析，并且结果示于图13(a)中。首先，将未结合的杂质和蛋白质主要以流通方式从经受deae色谱的样品中使用羟基磷灰石(ha)色谱去除，并且将crm197用100mm磷酸钾和100mm nacl溶剂洗脱。洗脱的crm197的sds-page的结果示于图13(b)中。[0126]实施例5：与使用棒状杆菌产生的crm197的比较[0127]分析了最终纯化的crm197的品质和特征。sec-hplc分析的结果是，发现纯度为99％以上(图14)。sds-page和蛋白质印迹分析显示，条带出现在与使用棒状杆菌产生的crm197相同的位置处(图15)。[0128]此外，发现构成crm197的535个氨基酸的整个序列为100％相同的，并且分子量测量的结果为鉴定出58,409da的主峰，其对应于理论分子量(图16)。通过圆二色(cd)分析鉴定高级结构，并且发现与使用棒状杆菌产生的crm197的高级结构没有差异(图17)。荧光光谱分析显示，最大发射波长为338nm，与使用棒状杆菌产生的crm197的最大发射波长相同(图18)。[0129]上述结果显示，使用大肠杆菌phex-l3菌株产生的crm197在物理化学和免疫学方面与使用棒状杆菌产生的crm197相同。[0130]实用性[0131]本发明对于crm197蛋白产生非常有用，因为具有与从亲本细菌中分离的蛋白质相同的物理化学/免疫特性的crm197蛋白可以在一般的未调节氧化还原电位的大肠杆菌中表达，并且具有到周质中的高分泌效率的crm197蛋白可以在不变动培养基的ph的情况下产生，以增加到周质中的分泌。[0132]尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应当解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。[0133]序列表自由文本[0134]附有电子文件。









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