硝酸盐吸收相关蛋白在调控玉米对硝酸盐吸收中的应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物技术领域中硝酸盐吸收相关蛋白在调控玉米对硝酸盐吸收中的应用。背景技术：2.氮素是植物生长发育过程中必不可少且需求量最大的矿质元素之一，约占植物干重的1％-5％(li et al.,2009)。在所有必需的营养元素中，氮是限制植物生长和产量形成的首要因素。氮在植物细胞、组织、器官及产量建成过程中起着中心作用，因此被称为生命元素。植物吸收的氮素在体内通过同化代谢，产生多种形态的含氮化合物，如氨基酸、蛋白质、核酸、激素等，参与到光合作用、呼吸作用等重要生理过程中(williams et al.,2001)。3.玉米是世界主要农作物之一，在很多国家被广泛种植。作为关键农作物之一，玉米长期以来都是人类生存的基本食物来源和主要的动物饲料原料；此外众多生活用品的加工也少不了玉米做原料；近年来，利用玉米制取乙醇燃料，更是成为新能源开发的一大趋势。这些迫切需要提高玉米种植面积和单位产量；而玉米产量的提高需要氮肥的大量投入，因此提高玉米的氮效率十分必要。玉米是旱地作物，以吸收利用土壤硝态氮为主。植物从土壤中吸收硝酸盐是其同化利用硝态氮的第一步，对该过程的研究是提高作物氮素吸收利用能力的关键，这将有助于找到氮肥高效利用的限制因子(garnett et al.,2013；plett et al.,2010)。研究玉米吸收利用硝酸盐的过程和规律可以为通过分子手段培育氮高效的玉米新品种提供理论依据和基因资源。4.硝态氮既作为营养元素，又作为信号对植物的代谢和生长有重要的影响。土壤中no3-浓度水平变化大,差异程度可达100倍(lark et al.,2004)。植物根系需要不同的硝酸盐吸收系统来应对土壤no3-浓度水平的变化来高效吸收氮素。在模式植物拟南芥中，atnrt1.1基因编码了一个双亲和性的硝酸盐转运蛋白，它能通过感知环境中硝酸盐的浓度水平而进行高亲和性和低亲和硝转运活性的转换。蛋白硝亲和性的改变是通过氨基酸序列上的第101位苏氨酸(thereonine,thr)的磷酸化进行调控的(martin et al.,2008)。当外界硝酸盐浓度低时，thr101磷酸化，促使atnrt1.1具有高亲和硝酸盐转运的活性；当外界硝酸盐浓度高时，thr101去磷酸化，使atnrt1.1具有低亲和硝酸盐转运的活性。5.中科院遗传所储成才课题组发现osnrt1.1b能改良粳稻氮肥利用效率(hu et al.,2015)。通过图位克隆策略从籼稻中克隆到高氮利用效率基因osnrt1.1b，osnrt1.1b在籼粳稻间只存在一个氨基酸的差别(t327m)，导致籼稻比粳稻具有更高的硝酸盐吸收及转运活性。将籼稻型osnrt1.1b导入粳稻品种中，田间试验的结果表明，含有籼稻型osnrt1.1b的粳稻品种在一半施肥条件下，与对照相比增产30-33％，氮肥利用效率提高30％；在正常施氮条件下，增产7-13％，氮肥利用效率提高约10％。技术实现要素：6.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物在低氮环境下氮的吸收利用。7.为了解决以上技术问题，本发明提供了硝酸盐吸收相关蛋白或调控所述硝酸盐吸收相关蛋白含量或活性的物质在调控植物对硝酸盐吸收或在制备调控植物对硝酸盐吸收产品中的应用，所述基因编码硝酸盐吸收相关蛋白，所述硝酸盐吸收相关蛋白是如下a1、a2或a3的蛋白质：8.a1、氨基酸序列是序列表中序列3或序列4中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质；9.a2、将序列表中序列3或序列4中任一种所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物白粉病抗性和/或纹枯病抗性相关的蛋白质；10.a3、在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。11.上述应用中，序列表中的序列3由608个氨基酸残基组成，序列表中的序列4由595个氨基酸残基组成。12.上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。13.上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。14.上述应用中，所述硝酸盐吸收相关蛋白可来源于玉米。15.上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物，所述双子叶植物为十字花科植物；更进一步，所述禾本科植物为玉米，所述十字花科植物为拟南芥。16.本发明的第二个目的是调控基因表达的物质在调控植物对硝酸盐吸收中的应用或在制备调控植物对硝酸盐吸收产品中的应用，所述基因编码所述硝酸盐吸收相关蛋白。17.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：b1)在所述基因转录水平上进行的调控；b2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；b3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；b4)对所述基因的翻译进行的调控；b5)对所述基因的mrna降解进行的调控；b6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。18.上述应用中，所述调控基因表达的物质为与所述的硝酸盐吸收相关蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述c1-c3中的任一种：19.c1、编码所述硝酸盐吸收相关蛋白的核酸分子；20.c2、提高所述硝酸盐吸收相关蛋白表达的核酸分子；21.c3、含有c1或c2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。22.上述应用中，c1或c2所述的核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。23.上述应用中，c1所述核酸分子具体可为如下d1或d2所示的基因：24.d1、编码链的编码序列(orf)是序列表序列1或序列表序列2所示的dna分子；25.d2、核苷酸序列是序列表序列1或序列表序列2所示的dna分子。26.上述应用中，所述调控基因表达可为提高所述基因表达。27.为了解决上述技术问题，本发明提供了促进植物对硝酸盐吸收的植物试剂，含有上述硝酸盐吸收相关蛋白、或上述调控基因表达的物质，所述植物试剂是促进植物对氮的吸收利用的植物试剂。28.上述试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的硝酸盐吸收效果确定。29.为了解决上述技术问题，本发明还提供一种促进植物对硝酸盐吸收的方法，包括如下步骤：提高受体植物中所述硝酸盐吸收相关蛋白的表达、提高所述硝酸盐吸收相关蛋白的丰度，得到在低氮环境下硝酸盐吸收率高于所述受体植物的目的植物。30.上述方法中，具体包括将编码上述蛋白质的核酸导入受体植物中，得到硝酸盐吸收率高于所述受体植物的目的植物。31.上述方法中，硝酸盐吸收可为低氮环境下的硝酸盐吸收。所述低氮环境中的硝酸盐浓度为0-0.2mm/l。32.上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物，所述双子叶植物为十字花科植物；更进一步，所述禾本科植物为玉米，所述十字花科植物为拟南芥。33.本发明提供调控基因表达的物质在提升植物对硝酸盐吸收中的应用或在制备提升玉米对硝酸盐吸收产品中的应用，所述基因编码硝酸盐吸收相关蛋白，为zmnrt1.1a基因和zmnrt1.1b基因。将zmnrt1.1a基因和zmnrt1.1b基因分别导入拟南芥及玉米的转基因实验均证明，过表达zmnrt1.1a基因或zmnrt1.1b基因的转基因植物与受体植物相比，显著促进了低氮环境下玉米对硝态氮的吸收利用，说明zmnrt1.1a基因和zmnrt1.1b基因是与氮的吸收利用相关的基因，zmnrt1.1a基因和zmnrt1.1b基因可用于促进植物对氮的吸收利用，提高植物产量。附图说明34.图1为实施例1中zmnrt1.1a/b与其它禾本科来源的同源基因的共线性图谱分析及进化树分析图。其中，图1的a为共线性图谱分析，图1的b为进化树分析图。35.图2为实施例1中zmnrt1.1a/b基因在玉米b73缺氮后恢复供硝酸盐不同时长的表达特性以及在不同硝酸盐浓度下长期培养的表达水平分析。其中，图2的a为zmnrt1.1a/b基因在玉米b73缺氮后恢复供硝酸盐不同时长的表达特性；图2的b为在不同硝酸盐浓度下长期培养的玉米b73中zmnrt1.1a/b基因的表达水平分析图；利用荧光实时定量pcr(qpcr)分析zmnrt1.1a/b基因在玉米b73中的转录水平表达情况。36.图3为实施例2中扩增获得完整的玉米zmnrt1.1a/b的开放阅读框的扩增结果。图中，右侧泳道m是dna分子量标准，左侧泳道依次为是zmnrt1.1a、zmnrt1.1b开放阅读框序列的扩增结果。37.图4为实施例3中过表达zmnrt1.1a基因或过表达zmnrt1.1b基因的转基因系拟南芥植株的rt-pcr分子验证结果及高低氮下15no3-瞬时吸收结果。图4的a图为转基因株系的基因表达量；图4的b图为转基因株系在不同氮浓度下(0.2mm kno3、5mm kno3)的硝酸盐吸收速率。其中，chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#4、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#11、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#13属于chl1-5背景下转zmnrt1.1a基因的拟南芥株系chl1-5-p35s::zmnrt1.1a；chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#5、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#13、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#14属于chl1-5背景下转zmnrt1.1b基因的拟南芥株系chl1-5-p35s::zmnrt1.1b。数据表示为平均值±标准差，重复数为4，不同小写字母表示存在显著性差异。38.图5为过表达zmnrt1.1a基因或过表达zmnrt1.1b基因玉米植株的基因表达量及生理表型。图a为转zmnrt1.1a玉米植株的基因表达量；图b为转zmnrt1.1b玉米植株的基因表达量；图c为转zmnrt1.1a玉米株系地上部生物量(g/株)统计结果；图d为转zmnrt1.1b玉米株系地上部生物量(g/株)统计结果；图e为转zmnrt1.1a玉米株系地上部吸氮量(mg/株)统计结果；图f为转zmnrt1.1b玉米株系地上部吸氮量(mg/株)统计结果。其中，a1-oe、a2-oe、a3-oe均为转zmnrt1.1a玉米株系，b1-oe、b2-oe、b3-oe均为转zmnrt1.1b玉米株系。wt为野生型株系；数据表示为平均值±标准差，重复数为12，*表示显著性分析结果为p＜0.05。具体实施方式39.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。40.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。41.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。42.1、载体43.下述实施例中克隆载体pgem t-easy为promega公司产品。44.下述实施例中植物表达载体pptkan和pcambia1301记载于非专利文献“sutter et al.,selective mobility and sensitivity to snares is exhibited by the arabidopsis kat1k1 channel at the plasma membrane，2006，plant cell 18:935-954”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。45.下述实施例中载体ppt-hyg记载于非专利文献“gu et al.,characterization of amt-mediated high-affinity ammonium uptake in roots of maize，2013，plant cell physiology:1515-1524”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。46.下述实施例中载体p1301-ubi-ppt记载于非专利文献“zhao et al.,over expression ofthe maize zmamt1；1a gene enhances root ammonium uptake efficiency under low ammoniumnutrition，2018，plantbiotechnology reports 12:47-56”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。47.2、菌株48.下述实施例中的大肠杆菌dh5α属于大肠杆菌(escherichia coli)，购自天根生化科技有限公司。49.下述实施例中的根癌农杆菌菌株gv3101与eha105均属于根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)，均购自天根生化科技有限公司。50.3、植物品系51.下述实施例中的拟南芥chl1-5突变体记载于非专利文献“ho et al.,chl1 function as a nitrate sensor in plants,2009，cell：1184-1194”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。52.下述实施例中的拟南芥col-0野生型记载于非专利文献“ho et al.,chl1 function as a nitrate sensor in plants,2009，cell：1184-1194”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。53.下述实施例中的玉米自交系b73记载于非专利文献“schnable et al.,the b73 maize genome:complexity,diversity,and dynamics，2009，science:1112-1114.”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。54.下述实施例中的玉米杂交种hiii记载于非专利文献“an et al.,transcriptional regulation of expression ofthe maize aldehyde dehydrogenase 7gene(zmaldh7b6)in response to abiotic stresses，2014，journal ofintergrative agriculture:1900-1908.”。公众可从中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。55.下述实施例中的玉米品种ph6wc为杜邦先锋公司自交系，记载于非专利文献“刘继国等，先玉335母本系ph6wc，2010，新农业：30”。公众可从种质库或中国农业大学获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。56.4、试剂57.下述实施例中，各种限制性内切酶均为promega公司产品；cdna文库构建试剂盒为invitrogen公司产品；各种taq酶和trizol rna小量提取试剂盒为takara公司产品；dntp混合物为上海生工产品；t4 dna连接酶为promega公司产品；氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、壮观霉素(spe)、利福平(rif)均为欣经科公司产品。58.下述实施案例中，拟南芥水培用hoagland营养液为将k2so4、mgso4.7h2o、kh2po4、h3bo3、mnso4.h2o、znso4.7h2o、cuso4.5h2o、na2moo4.2h2o、nafe-edta、nh4no3(氮源)、cacl2.2h2o溶于无菌水获得的ph为5.8-6.0的溶液。拟南芥水培用hoagland营养液中，k2so4的浓度为0.25mm、mgso4.7h2o的浓度为1mm、kh2po4的浓度为1mm、h3bo3的浓度为30μm、mnso4.h2o的浓度为5μm、znso4.7h2o的浓度为1μm、cuso4.5h2o的浓度为1μm、na2moo4.2h2o的浓度为1μm、nafe-edta的浓度为0.1mm、nh4no3的浓度为2mm、cacl2.2h2o的浓度为0.25mm。59.下述实施案例中，玉米水培用hoagland营养液为将k2so4、mgso4.7h2o、kh2po4、h3bo3、mnso4.h2o、znso4.7h2o、cuso4.5h2o、na2moo4.2h2o、nafe-edta、ca(no3)2(氮源)、cacl2.2h2o(用来配平钙离子)溶于无菌水获得的ph为5.8-6.0的溶液。玉米水培用hoagland营养液中，k2so4的浓度为1mm，mgso4.7h2o的浓度为0.6mm，kh2po4的浓度为0.1mm，h3bo3的浓度为30μm，mnso4.h2o的浓度为0.5μm，znso4.7h2o的浓度为0.5μm，cuso4.5h2o的浓度为0.2μm，na2moo4.2h2o的浓度为0.07μm，nafe-edta的浓度为0.1mm，ca(no3)2的浓度按照no3-的终浓度为0.04mmol/l、0.4mmol/l、4mmol/l设置，cacl2.2h2o用来配平钙离子。60.5、pcr扩增引物61.p-a-1-f:5'-atggtcggactcctcccc-3'；62.p-a-1-r:5'-tcagtggagcgtgggc-3'；63.p-b-1-f:5'-atggcctccgtcctgcc-3'；64.p-b-1-r:5'-tcagtggccgacggc-3'；65.p-a-2-f:5'-ctctagaatggtcggactcctcccc-3'(下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)；66.p-a-2-r:5'-ccgctcgagtcagtggagcgtgggct-3'(下划线指示的序列为xho i酶识别位点序列)；67.p-b-2-f:5'-ctctagaatggcctccgtcctgccg-3'(下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)；68.p-b-2-r:5'-ccgctcgagtcagtggccgacggcaatag-3'(下划线指示的序列为xho i酶识别位点序列)；69.p-a-3-f:5'-tcgagctcatggtcggactcctcccc-3'(下划线指示的序列为sac i酶识别位点序列)；70.p-a-3-r:5'-tcgagctctcagtggagcgtgggct-3'(下划线指示的序列为sac i酶识别位点序列)；71.p-b-3-f:5'-cgggatccatggcctccgtcctgccg-3'(下划线指示的序列为bamh i酶识别位点序列)；72.p-b-3-r:5'-cgggatcctcagtggccgacggcaatag-3'(下划线指示的序列为bamh i酶识别位点序列)；73.p-a-4-f:5'-tcctccagcaagaagagcaagc-3'；74.p-a-4-r:5'-ttcacctcctccacgtccgt-3'；75.p-b-4-f:5'-tgctgctgccagtgccacaa-3'；76.p-b-4-r:5'-acacgttaattagctcgacctgcg-3'；77.pt-f:5'-gctatcctgtgatctgccctga-3'；78.pt-r:5'-cgccaaacttaataacccagta-3'。79.以上引物均由北京擎科公司合成合成。80.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。81.下述实施例中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值，*表示显著性分析结果为p＜0.05。82.实施例1、玉米硝酸盐转运蛋白zmnrt1.1a/zmnrt1.1b表达分析83.一、zmnrt1；1s基因进化分析84.目前已报道的，与模式植物atnrt1.1基因同源的nrt1.1s基因在玉米中有4个(zmnrt1.1a/b/c/d)，水稻中有3个(osnrt1.1a/b/c)，高粱有3个(sbnrt1.1a/b/c)，二穗短柄草有4个(bdnrt1.1a/b/c/d)(plett et al.,2010,the plos one)。在phytozome/maizegdb数据库中进行基因信息查找，得到zmnrt1.1a/b/c/d的核苷酸序列、氨基酸序列及相应的基因表达数据。转录组数据显示基因zmnrt1.1a/b主要在根系中表达，基因zmnrt1.1c/d表达量极少，可能是冗余基因。85.图1为zmnrt1.1s的共线性图谱分析(图1的a)及进化树分析(图1的b)。由共线性图谱可知，zmnrt1.1b与zmnrt1.1d是在进化过程中由于全基因组加倍产生的，而zmnrt1.1b与zmnrt1.1c是由于基因组串联重组产生的。由进化树分析图可知，zmnrt1.1b与osnrt1.1b同源性较高；zmnrt1.1a则与osnrt1.1a同源性较高。86.二、荧光实时定量pcr(real-time pcr)分析玉米根系zmnrt1.1s基因的表达模式87.进行如下两组实验处理：88.(1)将玉米自交系b73植株先在2mm nh4no3水溶液中培养8天，后缺氮4天，然后分别恢复供4mm kno31小时/3小时/6小时/18小时/72小时，用液氮收取玉米根系。89.(2)将玉米自交系b73植株分别种在0mm/0.04mm/4mm/10mm kno3水溶液中培养12天，用液氮收取玉米根系。90.用trizol法提取各个处理玉米根部总rna。所得总rna用反转录试剂盒经过去除总rna中的dna后，再反转录成cdna。利用real-time pcr的方法，以引物p-a-4-f和p-a-4-r扩增玉米zmnrt1；1a基因，以引物p-b-4-f和p-b-4-r扩增玉米zmnrt1；1b基因，以pt-f和pt-r扩增玉米zmtub1基因作为内参对照，用同一样品中的zmnrt1.1a/zmnrt1.1b基因的表达量除以zmtub1基因的表达量作为zmnrt1.1a/zmnrt1.1b基因的相对表达量，研究zmnrt1.1a/zmnrt1.1b基因在玉米不同组织部位中表达特性。91.上述的real-time pcr操作步骤如下：92.1、用trizol试剂盒(takara公司，目录号:9109)提取不同样品中的总rna。93.2、取1.5μg总rna，用反转录试剂盒(takara公司，目录号:rr047a)去除基因组dna，方法如下：94.反应体系1(10μl):95.5x gdna eraser bufferꢀꢀꢀꢀꢀ2μl96.gdna eraserꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1μl97.rnase free dh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ至终体积10μl；98.42℃反应5分钟。99.3、常规方法反转录合成cdna第一链，方法如下：100.反应体系2(20μl):[0101][0102]42℃反应60分钟；95℃反应5分钟。[0103]4、real-time pcr检测基因丰度，试剂选用takara公司的sybr green realtime pcr master mix(目录号:rr820a)，定量pcr仪器型号iq5，反转产物稀释10倍作为real-time pcr模板[0104]反应体系：[0105][0106]pcr反应程序：50℃2分钟，95℃2分钟，40个循环(95℃15秒，61℃15秒，72℃30秒)；[0107]融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；[0108]以zmtub1为内参，采用相对定量算法计算zmnrt1.1s基因在玉米不同组织部位中的相对表达量。结果如图2所示，玉米zmnrt1；1b基因受到硝酸盐的诱导，zmnrt1；1a基因不受硝酸盐的诱导。玉米zmnrt1；1a基因和zmnrt1；1b基因的表达量均随着氮浓度的增加而增加。[0109]实施例2、zmnrt1；1s基因的克隆及其拟南芥表达载体的构建[0110]一、zmnrt1.1a基因和zmnrt1.1b基因的cds的扩增[0111]根据生物信息学得到的zmnrt1.1a/zmnrt1.1b的序列，设计引物：扩增zmnrt1.1a的引物对由上游引物p-a-1-f和下游引物p-a-1-r组成。扩增zmnrt1.1b的引物对由上游引物p-b-1-f和下游引物p-b-1-r组成。其中p-a-1-f和p-b-1-f均恰好包含翻译起始密码子atg，p-a-1-r和p-b-1-r均包含与翻译终止密码子tga反向互补的序列。[0112]以玉米根总rna反转录的cdna(参见实施例1的步骤(2))为模板，使用高保真酶primer star(takara公司，目录号:r010q)扩增，分别获得包含完整开放阅读框架的zmnrt1；1a基因片段和zmnrt1；1b基因片段。[0113]扩增体系如下：[0114][0115]补h2o至50μl。[0116]pcr反应条件：98℃预变性2分钟；然后98℃10秒，65℃10秒，72℃3分钟30秒，30个循环；之后加入1μl taq酶，72℃延伸和加尾20分钟。[0117]各取8μl pcr产物，于1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，检测结果如图2所示，zmnrt1.1a的mrna序列由2492个碱基组成，其开放阅读框(orf)为自5′末端第326-2153位碱基，片段大小为1827bp；zmnrt1.1a的mrna序列由2286个碱基组成，其开放阅读框(orf)为自5′末端第187-1975位碱基，片段大小为1788bp。电泳结果见图3，右侧泳道m是dna分子量标准，左侧泳道依次为是zmnrt1.1a开放阅读框(orf)序列、zmnrt1.1b开放阅读框(orf)序列的扩增结果。[0118]回收目的条带，连接回收产物于pgem t-easy载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，提取质粒并测序验证。测序结果表明，分别获得了1827bp(zmnrt1.1a)和1788bp(zmnrt1.1b)的开放读码框，比对发现这一序列与网上数据库得到的序列可以完全匹配。zmnrt1；1a的核苷酸序列如序列表中序列1所示；其编码的氨基酸序列如序列表中序列3所示。zmnrt1；1b的核苷酸序列如序列表中序列2所示；其编码的氨基酸序列如序列表中序列4所示。[0119]二、植物表达载体的构建[0120]1、转拟南芥zmnrt1；1a基因过表达载体(ppt-zmnrt1；1a)和转拟南芥zmnrt1；1b基因过表达载体(ppt-zmnrt1；1b)的构建[0121]选取步骤一中测序正确的目的基因，用含有xba i酶识别位点序列的上游引物以及含有xho i酶识别位点序列的下游引物重扩目的基因，具体为：以p-a-2-f(含有xba i酶识别位点序列)和p-a-2-r(含有xho i酶识别位点序列)扩增目的基因zmnrt1；1a；以p-b-2-f(含有xba i酶识别位点序列)和p-b-2-r(含有xho i酶识别位点序列)扩增目的基因zmnrt1；1b。扩增产物分别浓缩至10μl，并用xba i酶酶切，跑电泳回收，并浓缩为10μl，分别得到zmnrt1；1a基因目的片段和zmnrt1；1b基因目的片段。[0122]同时进行载体ppt-hyg的xba i酶切，并且回收得到线性ppt-hyg质粒dna，然后进行载体的去磷酸化。去磷酸化的具体操作为在一新离心管中加入如下试剂：[0123]线性ppt-hyg质粒dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5μg[0124]10x cipa reaction bufferꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10μl[0125]diluted ciap(0.01u/μl)ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5μl[0126]加水补足到100μl。[0127]pcr仪中进行以下程序：[0128][0129]取上步得到的去磷酸化产物，加入100μl的tris饱和酚和100μl三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min。吸取上清到另一管中，加同体积的三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min；吸取上清到另一管中，加1/10体积的3m醋酸铵，3倍体积的无水冷乙醇，混匀，-80℃沉淀1小时，4℃，12000转，离心10min，弃去上清，加700μl的70％乙醇洗一次，10μl水溶解，即得到去磷酸化后的载体片段。[0130]取酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体片段进行连接反应，反应体系(10μl)如下：[0131][0132]16℃连接16-20小时后，转入50μl dh5α感受态细胞中，涂布在含卡那霉素的lb平板上，37℃培养12小时，收集所有菌体，提取质粒dna经酶切验证后，并为测序公司测序确认序列正确的载体，其携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。[0133]其中，以zmnrt1；1a基因目的片段和载体片段连接后转染得到的序列正确的载体为ppt-zmnrt1；1a，以zmnrt1；1b基因目的片段和载体片段连接后转染得到的序列正确的载体为ppt-zmnrt1；1b。[0134]2、转玉米zmnrt1；1a基因的过表达载体(p1301-bar-zmnrt1.1a)和转玉米zmnrt1；1b基因的过表达载体(p1301-bar-zmnrt1.1b)的构建[0135]选取测序正确的质粒ppt-zmnrt1；1a，用含有sac i酶识别位点序列的引物p-a-3-f和p-a-3-r重扩目的基因zmnrt1；1a，回收目的片段zmnrt1；1a。用saci酶酶切目的片段zmnrt1；1a，跑电泳回收。用saci酶酶切载体p1301-ubi-ppt，并且进行回收，然后进行载体的去磷酸化。[0136]选取测序正确的质粒ppt-zmnrt1；1b，用含有bamh i酶识别位点序列的引物p-b-3-f和p-b-3-r重扩目的基因zmnrt1；1b；回收目的片段zmnrt1；1b。用bamh i酶酶切目的片段zmnrt1；1b，跑电泳回收。用bamh i酶切载体p1301-ubi-ppt，并且进行回收，然后进行载体的去磷酸化。[0137]载体的去磷酸化，具体操作为在一新离心管中加入如下试剂：[0138]线性p1301-ubi-ppt质粒dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5μg[0139]10x cipa reaction bufferꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10μl[0140]diluted ciap(0.01u/μl)ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5μl[0141]加水补足到100μl。[0142]pcr仪中进行以下程序：[0143][0144]取上步得到的去磷酸化产物，加入100μl的tris饱和酚和100μl三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min。吸取上清到另一管中，加同体积的三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min；吸取上清到另一管中，加1/10体积的3m醋酸铵，3倍体积的无水冷乙醇，混匀，-80℃沉淀1小时，4℃，12000转，离心10min，弃去上清，加700μl的70％乙醇洗一次，10μl水溶解，即得到去磷酸化后的载体片段。[0145]取酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体片段进行连接反应，反应体系(10μl)如下：[0146][0147]16℃连接16-20小时后，转入50μl dh5α感受态细胞中，涂布在含卡那霉素的lb平板上，37℃培养12小时，收集所有菌体，提取质粒dna经酶切验证后，并为测序公司测序确认序列正确的载体，其携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。[0148]其中，以目的片段zmnrt1；1a和载体片段连接后转染得到的序列正确的载体，是将zmnrt1；1a基因(如序列表中序列1所示)插入p1301-ubi-ppt载体的限制性核酸内切酶saci酶切位点的片段，保持p1301-ubi-ppt载体的其它序列不变，得到转玉米zmnrt1；1a基因的过表达载体，命名为p1301-bar-zmnrt1.1a。[0149]以目的片段zmnrt1；1b和载体片段连接后转染得到的序列正确的载体，是将zmnrt1；1b基因(如序列表中序列2所示)插入p1301-ubi-ppt载体的限制性核酸内切酶bamh i酶切位点的片段，保持p1301-ubi-ppt载体的其它序列不变，得到转玉米zmnrt1；1b基因的过表达载体，命名为p1301-bar-zmnrt1.1b。[0150]实施例3、过表达zmnrt1.1a和zmnrt1.1b的转基因植物的表型鉴定[0151]一、过表达zmnrt1；1a转基因系拟南芥材料和过表达zmnrt1；1b转基因系拟南芥材料15n瞬时吸收的表型实验[0152]为了研究过表达zmnrt1.1a基因或过表达zmnrt1.1b基因后是否能提高植株氮吸收效率，以实施例2中的过表达载体构建转基因拟南芥，具体如下：[0153]以拟南芥缺失atnrt1.1基因的chl1-5突变体为转化受体，采用农杆菌介导的遗传转化方法利用p1301-bar-zmnrt1.1a转化chl1-5突变体，潮霉素抗性筛选得到t0代转基因植株。对获得的t0代转基因植株进行pcr鉴定，扩增得到1827bp条带的为阳性转zmnrt1.1a植株。将所得阳性转zmnrt1.1a植株经过自交加代、筛选和鉴定，获得3个t3代转zmnrt1.1a株系(chl1-5-p35s::zmnrt1.1a)：chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#4、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#11、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#13。以rt-pcr验证zmnrt1.1a的基因表达量(对照为chl1-5)，引物为p-a-4-f与p-a-4-r，结果见图4的a图左侧，表明3个株系中zmnrt1.1a基因的相对表达量均显著高于对照chl1-5。[0154]以拟南芥chl1-5突变体为转化受体，采用农杆菌介导的遗传转化方法利用利用p1301-bar-zmnrt1.1b转化chl1-5突变体，潮霉素抗性筛选得到t0代转基因植株。对获得的t0代转基因植株进行pcr鉴定，扩增得到1788bp条带的为阳性转zmnrt1.1b植株。将阳性转zmnrt1.1b植株经过自交加代、筛选和鉴定，获得3个t3代转zmnrt1.1b株系(chl1-5-p35s::zmnrt1.1b)：chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#5、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#13、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#14。以rt-pcr验证zmnrt1.1b的基因表达量(对照为chl1-5)，引物为p-b-4-f与p-b-4-r，结果见图4的a图右侧，表明3个株系中zmnrt1.1b基因的相对表达量均显著高于对照chl1-5。[0155]水培转入zmnrt1.1a转基因的拟南芥t3代纯合体(chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#4、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#11、chl1-5-p35s::zmnrt1.1a#13)，在15no3-浓度0.2mmol/l及5mmol/l no3-条件下测定根系硝酸盐吸收速率。以chl1-5突变体以及col-0野生型作为对照。[0156]水培转入zmnrt1.1b转基因的拟南芥t3代纯合体(chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#5、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#13、chl1-5-p35s::zmnrt1.1b#14)，在15no3-浓度0.2mmol/l及5mmol/l no3-条件下测定根系硝酸盐吸收速率。以chl1-5突变体以及col-0野生型作为对照。[0157]拟南芥水培方式：先用拟南芥水培用hoagland营养液培养6周，每3天换一次营养液。后在含0.2mmol/l及5mmol/l kno3hoagland营养液(除n源变化外，其他成分不变)中培养1周。再在含0.2mmol/l及5mmol/l k15no3hoagland营养液(除n源变化外，其他成分不变)中培养10分钟，用饱和caso4浸泡1min后收取拟南芥根部样品，通过质谱分析测定15n丰度，计算在不同处理条件下拟南芥根系的瞬时硝酸盐吸收速率。[0158]结果如图4的b图所示，在5mm k15no3为氮源条件下，转基因系chl1-5-p35s::zmnrt1.1a(图4的b图左侧)和转基因系chl1-5-p35s::zmnrt1.1a(图4的b图右侧)的15n瞬时吸收速率均明显高于chl1-5；在0.2mm k15no3为氮源条件下，转基因系chl1-5-p35s::zmnrt1.1a(图4的b图左侧)和转基因系chl1-5-p35s::zmnrt1.1a(图4的b图右侧)的15n瞬时吸收速率均明显高于chl1-5。这些结果说明了zmnrt1；1a基因或zmnrt1；1b基因转入拟南芥chl1-5突变体可以提高拟南芥的硝酸盐吸收能力。[0159]证明在拟南芥中表达外源玉米基因zmnrt1；1a与zmnrt1；1b可以增强拟南芥对硝酸盐的吸收。因此具有潜在地提高作物硝态氮吸收利用效率的应用价值。[0160]二、过表达zmnrt1；1a转基因系玉米材料和过表达zmnrt1；1b转基因系玉米材料不同氮浓度的表型实验[0161]为了研究过表达zmnrt1.1a基因或过表达zmnrt1.1b基因后是否能提高玉米植株氮吸收效率，以实施例2中的过表达载体构建转基因拟南芥，具体如下：[0162]以玉米杂交种hiii(自交系a188×b73)为转化受体，采用农杆菌介导的遗传转化方法利用p1301-bar-zmnrt1.1a转化玉米杂交种hiii，草甘膦抗性筛选得到t0代转基因植株。对获得的t0代转基因植株进行pcr鉴定，扩增得到1827bp条带的为阳性转zmnrt1.1a植株。经过回交(回交亲本为ph6wc)、自交、筛选和鉴定，获得3个bc3f3代转zmnrt1.1a株系：a1-oe、a2-oe、a3-oe。以rt-pcr验证zmnrt1.1a的相对表达量(对照为bc3f3自交分离后代中未含有p1301-bar-zmnrt1.1a片段的玉米，即野生型对照bc3f3的亲本hiii未经转基因处理)，引物为p-a-4-f与p-a-4-r，结果见图5的a图，表明3个株系中zmnrt1.1a基因的相对表达量均显著高于对照。[0163]以玉米杂交种hiii(自交系a188×b73)为转化受体，采用农杆菌介导的遗传转化方法利用p1301-bar-zmnrt1.1b转化玉米杂交种hiii，草甘膦抗性筛选得到t0代转基因植株。对获得的t0代转基因植株进行pcr鉴定，扩增得到1788bp条带的为阳性转zmnrt1.1b植株。经过回交(回交亲本为ph6wc)、自交、筛选和鉴定，获得3个bc3f3代转zmnrt1.1b株系：b1-oe、b2-oe、b3-oe。以rt-pcr验证zmnrt1.1b的相对表达量(对照为bc3f3自交分离后代中未含有p1301-bar-zmnrt1.1b片段的玉米，即野生型对照bc3f3的亲本hiii未经转基因处理)，引物为p-b-4-f与p-b-4-r，结果见图5的b图，表明3个株系中zmnrt1.1b基因的相对表达量均显著高于对照。[0164]水培转zmnrt1.1a基因的玉米bc3f3代纯合体(a1-oe、a2-oe、a3-oe)，在0.04mmol/l、0.4mmol/l、4mmol/l no3-条件下培养14天，测定植株的生物量及氮浓度。以自交分离后代中未含有p1301-bar-zmnrt1.1a片段的玉米为对照。[0165]水培转入zmnrt1.1b基因的玉米bc3f3代纯合体(b1-oe、b2-oe、b3-oe)，在0.04mmol/l、0.4mmol/l、4mmol/l no3-条件下培养14天，测定植株的生物量及氮浓度。以自交分离后代中未含有p1301-bar-zmnrt1.1b片段的玉米为对照。[0166]玉米水培方式：用不同no3-浓度(0.04mmol/l、0.4mmol/l、4mmol/l)的hoagland营养液培养14天，每2天换一次营养液。[0167]地上部生物量及吸氮量统计结果如图5所示，在0.2mm或2mm ca(no3)2为唯一氮源条件下，转基因系地上部生物量和氮含量与野生型对照无明显差异；而在0.02mm ca(no3)2条件下，转基因系地上部生物量和氮含量明显高于与野生型对照。[0168]这些结果说明了提高zmnrt1；1a基因或zmnrt1；1b基因的表达可以提高转基因玉米在低氮环境下对硝酸盐的吸收和利用能力，从而提高植株在低氮环境下的氮效率，而对转基因玉米在正常氮环境下对硝酸盐的吸收和利用能力则无影响。[0169]在水稻中的研究发现，osnrt1.1a在高氮及低氮条件下均能显著提高水稻的氮效率，同时在高氮下还能促进早熟；而osnrt1.1b存在着优良的等位变异，该等位变异在不同氮环境下也均能提高水稻的氮效率。从进化关系中发现，zmnrt1.1a/zmnrt1.1b基因是osnrt1.1a/osnrt1.1b基因在玉米中的同源基因。但与水稻不同的是，osnrt1.1a/osnrt1.1b在不同氮环境下均能提高水稻的氮效率，而zmnrt1.1a/zmnrt1.1b只在低氮环境下提高玉米的氮效率。这体现出了同源基因的相似性及物种间的特异性。本发明证明在玉米中过表达zmnrt1.1a或zmnrt1.1b基因均可以提高玉米在低氮条件下的生物量及氮含量。因此具有低氮下提高氮肥利用效率的应用价值，具有潜在的育种价值。[0170]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









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