用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染的包含含有基于类姜黄色素的化合物和甘草提取物或其级分的复合物的组合物的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染的包含含有基于类姜黄色素的化合物和甘草提取物或其级分的复合物的组合物1.发明背景1.发明领域2.本发明涉及用于预防、改善或治疗猪流行性腹泻(ped)病毒感染的药物组合物、准标准药物组合物、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料和饮用水，其各自包含作为活性成分的含有基于类姜黄色素的化合物和甘草提取物或其级分的复合物。3.2.相关领域的描述4.对于显示功效的功能性物质，使它们吸收入血液内并且维持预定时间期限的持续性是必不可少的。作为水溶性物质的氨基酸、葡萄糖和维生素通过肝到达心脏，并且作为脂溶性物质的脂肪分解而产生的脂肪颗粒，大部分植物化学物质和脂溶性维生素被吸收入心脏。最终，水溶性和脂溶性物质在心脏相遇，并且输送至全身细胞。5.关于与此相关的研究趋势，使用脂溶性物质的磷脂来开发水溶性复合物的研究正在活跃地进行。然而，由于发生多种问题例如物质分解而存在局限性。因此，需要使功效最大化、同时通过使脂溶性物质水溶性化来最大限度地增加吸收率的技术。6.同时，减少产业化动物生产力的主要原因之一在于病毒性肠炎，其在仔猪的繁殖期不可避免地会发生一次以上，并且因降低生长速度和导致死亡而造成持续的经济损失。7.近来，国内外爆发性的变异性猪流行性腹泻(ped)已经造成巨大的经济损失。可以考虑开发疫苗和治疗剂作为用于有效控制变异性ped冠状病毒的手段。目前世界上还没有针对变异性ped冠状病毒的治疗剂，因此，治疗剂的开发在养猪业生产率和附加值方面非常重要，因此，需要开发能够有效控制产业化动物中流行性腹泻病毒的治疗剂。8.本发明人对针对ped冠状病毒感染的新治疗剂已经进行了研究，并且他们发现，基于类姜黄色素的化合物与甘草提取物一起的应用在体内表现出增加基于类姜黄色素的化合物的吸收率的协同作用，从而有效预防和治疗ped冠状病毒感染，由此完成了本发明。9.发明概述10.本发明的一个目的在于提供用于预防或治疗猪流行性腹泻(ped)病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。11.本发明的另一个目的在于提供用于预防或改善ped病毒感染的食物组合物，该食物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。12.本发明的另一个目的在于提供用于预防或改善ped病毒感染的准标准药物组合物，该准标准药物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。13.本发明的另一个目的在于提供用于预防或改善ped病毒感染的饲料添加剂，该饲料添加剂包含作为活性成分的复合物，该复合物包含基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。14.本发明的另一个目的在于提供包含饲料添加剂的饲料。15.本发明的另一个目的在于提供用于预防或改善ped病毒感染的饮用水添加剂，该饮用水添加剂包含作为活性成分的复合物，该复合物包含基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。16.本发明的另一个目的在于提供包含饮用水添加剂的饮用水。17.附图简述18.图1显示通过姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物减少猪流行性腹泻(ped)冠状病毒rna的作用；19.图2显示复合物对ped冠状病毒的核蛋白(n蛋白)的靶蛋白表达抑制活性；20.图3显示复合物对tnf-α的抑制活性；21.图4显示复合物对il-6的抑制活性；22.图5显示复合物对il-8的抑制活性；23.图6显示根据复合物施用的新生猪流行性病毒动物模型的存活率；24.图7显示根据复合物施用的新生猪流行性病毒动物模型的粪便稠度；25.图8显示根据复合物施用的新生猪流行性病毒动物模型的体重改变；26.图9显示减少复合物施用组粪便中病毒rna的作用；27.图10显示减少复合物施用组十二指肠中病毒rna的作用；28.图11显示减少复合物施用组空肠中病毒rna的作用；29.图12显示减少复合物施用组回肠中病毒rna的作用；30.图13显示减少复合物施用组十二指肠中tnf-α、il-6和il-8的作用；31.图14显示减少复合物施用组空肠中tnf-α、il-6和il-8的作用；32.图15显示减少复合物施用组回肠中tnf-α、il-6和il-8的作用；33.图16显示减少复合物施用组肠系膜中tnf-α、il-6和il-8的作用；34.图17显示复合物施用组的小肠的组织病理学检查结果；和35.图18显示有关样本绒毛:隐窝比率的图像(上)和显示绒毛:隐窝比率的示意图(下)。36.优选实施方案的详细描述37.下面将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每种描述和实施方案也可以适用于其它描述和实施方案。也就是说，本公开中公开的多种要素的所有组合均落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下具体描述限制。38.为了实现上述方面，本发明一方面提供了用于预防或治疗猪流行性腹泻(ped)病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含由下式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。39.在本发明中，活性成分可以包括复合物，其包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分；以及由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐和甘草提取物或其级分的混合物。40.如本文所用，术语“猪流行性腹泻(ped)”是指由ped病毒(pedv)引起的传染性猪疾病。特征性总体临床症状包括抑郁、腹泻之前/之后即刻发生的厌食、呕吐以及因严重的水泻引起的脱水和体重减轻。特征性尸检结果为小肠内充满气体和流体、浆膜变薄和肠粘膜襞消失。pedv为冠状病毒的一种类型，并且在本发明中，pedv可以与ped病毒或ped冠状病毒互换使用。41.在本发明中，基于类姜黄色素的化合物可以由下式1表示，但不限于此。42.[式1][0043][0044]r1和r2各自独立地为氢、羟基或c1-c10烷氧基，并且n和m为1≤n≤5和1≤m≤5。[0045]特别地，由式1表示的基于类姜黄色素的化合物可以为由选自式2-4的任一个表示的化合物或其混合物，但不限于此。[0046][式2][0047][0048][式3][0049][0050][式4][0051][0052]式2化合物可以为姜黄素，并且式3和式4化合物可以为姜黄素衍生物。式3化合物可以称作脱甲氧基姜黄素，并且式4化合物可以称作双脱甲氧基姜黄素。[0053]在本发明的目的方面，可以使用属于基于类姜黄色素的化合物的任何化合物以及姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素，但不限于此。本领域技术人员显而易见的是，还可以使用姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素的衍生物或异构体。[0054]如本文所用，术语“衍生物”是指通过用另一个原子或原子组取代部分化合物结构得到的化合物。[0055]如本文所用，术语“异构体”是指具有相同分子式、但分子中组成原子的连接性或空间排列不同的化合物。异构体包括例如结构异构体和立体异构体。[0056]在本发明中，由式1表示的基于类姜黄色素的化合物可以分离自姜黄，但不限于此。[0057]如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何盐，其对于目标个体为生理学上可接受的，并且优选化合物的制剂，其不会消除化合物的生物活性和性质，并且不会对化合物所施用的生物体引起显著的刺激性。药用盐可以包括由可以形成包含药学上可接受的阴离子的无毒性酸加成盐的酸加成盐，例如无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；有机碳酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸、水杨酸等；磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。例如，药学上可接受的羧酸盐包括由锂、钠、钾、钙、镁等形成的金属盐或碱土金属盐，氨基酸盐，例如赖氨酸、精氨酸、胍等，有机盐，例如二环己胺、n-甲基-d-葡糖胺、三(羟基甲基)甲胺、二乙醇胺、胆碱、三乙胺等。[0058]如本文所用，术语“甘草”是指甘草属(glycyrrhiza)植物的根，已知其止咳、退热、舒缓胃和缓解紧急情况。[0059]如本文所用，术语“提取物”包括液体提取物本身和可利用液体提取物形成的任何制剂的提取物，例如通过提取甘草得到的液体提取物、液体提取物的稀释液或浓缩液、通过干燥液体提取物得到的干燥产物、液体提取物的粗纯化产物或纯化产物、或其混合物。[0060]作为制备甘草提取物的方法，可以使用本领域的常规的提取方法，例如超声提取、过滤、回流提取等。甘草提取物优选可以为通过用水、c1-c4醇或其混合溶剂提取通过粉碎甘草(通过洗涤和干燥从其中除去异物)得到的甘草干品得到的提取物，更优选通过用c1-c4醇提取得到的提取物，并且最优选通过用甲醇或乙醇提取得到的提取物。在这方面，提取溶剂优选以2倍-20倍甘草干重的量使用。例如，精细切割甘草干品，然后放入提取容器。向其中加入c1-c4低级醇或其混合溶剂，优选甲醇或乙醇，并且保持在室温预定的时间期限，然后过滤，得到醇提取物。在这方面，提取优选保持在室温1周，随后还可以进行例如浓缩或冷冻干燥这样的方法。可选择的是，可以购买和使用商购可获得的甘草提取物。[0061]甘草提取物的主要组分为甘草酸，其为白色或无色结晶粉末。甘草酸也可以称作甘草皂苷。在本发明中，甘草提取物可以包含7％或更多的甘草皂苷，其为以甘草提取物或粉末形式制备的甘草酸，但不限于此。[0062]如本文所用，术语“级分”是指通过从包含多种组分的混合物中分离特定组分或特定部分的分级方法得到的产物。关于甘草级分，可以通过例如将甘草提取物混悬于水中，然后使用非极性溶剂例如己烷或乙酸乙酯分级分别得到极性溶剂级分和非极性溶剂级分。特别地，可以通过以下得到级分：将甘草粗提物混悬于蒸馏水中，然后加入体积约为混悬液约1-100倍、优选约1-5倍体积的非极性溶剂，例如己烷或乙酸乙酯，并且提取和分离非极性溶剂可溶性层1-10次、优选2-5次，但不限于此。此外，还可以进行常用的分级方法(harborne,j.b.phytochemical methods:a guide to modern techniques of plant analysis,第3版.pp.6-7,1998)。[0063]为了使功能性物质在体内发挥功效，必须使它们吸收入血液中并且维持预定时间期限的持续性。因此，为了使作为功能性难溶性物质的姜黄素的水增溶，在本发明的一个示例性实施方案中，将姜黄素与甘草提取物混合，并且使用微波搅拌提取器(韩国专利no.10-1894087)制备姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物。[0064]如本文所用，术语“水增溶”是指这样一种现象，其中难溶于水的物质的溶解度因存在物质例如表面活性剂而增加。作为水增溶的方法，广泛应用使油溶性维生素或激素增溶使其成为水溶性的方法或加速乳液聚合的方法。在本发明中，甘草提取物用作水增溶剂，并且将本发明的甘草提取物与水溶性差的基于类姜黄色素的化合物混合，形成基于类姜黄色素的化合物-甘草皂苷水溶性复合物，其具有这样的结构，其中基于类姜黄色素的化合物易溶于水(或血液)。[0065]复合物中包含的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐:甘草提取物或其级分的重量比可以为1:1-1:400、1:10-1:400、1:20-1:400或1:30-1:100，特别是1:50-1:70，但不限于此。[0066]如本文所用，术语“预防”是指通过施用组合物抑制或延迟ped病毒感染发作的所有作用，并且术语“治疗”是指通过施用组合物改善或有利地改变ped病毒感染的症状的所有作用。[0067]本发明的药物组合物还可以包含通常用于制备药物组合物的适合的载体、赋形剂或稀释剂。此时，药物组合物中包含的活性成分的量可以为但并不特别地限于0.0001％重量-10％重量，优选0.001％重量-1％重量，基于组合物总重量。[0068]药物组合物可以具有选自片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂、内用溶液剂、乳剂、糖浆剂、灭菌的水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂的任何一种制剂，并且可以具有用于口服或非肠道施用的多种制剂。当配制时，使用常用的稀释剂或赋形剂例如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制备本发明的组合物。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且此类固体制剂通过将一种或多种化合物与一种或多种赋形剂混合来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉等。用于口服施用的液体制剂包括混悬剂、内用溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且除了常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，还可以包括多种赋形剂，例如润湿剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂等。用于非肠道施用的制剂包括灭菌的水溶液剂、非水溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂或助悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、可注射的酯例如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、macrogol、吐温61、可可脂、月桂精脂肪、甘油明胶等。[0069]本发明的药物组合物可以用于口服施用，但不限于此。[0070]本发明的组合物可以以药学有效量施用。[0071]如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可以取决于因素包括个体的类型和严重程度、年龄和性别、疾病类型、药物活性、对药物的敏感性、施用时间和途径、排泄率、治疗期限、同时使用的药物和其它医学领域已知的因素确定。本发明的药物组合物可以单独施用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。组合物可以以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用表现出最大作用而不引起副作用的最小量的组合物，并且可以由本领域技术人员容易地确定该量。本发明的组合物的优选的施用剂量可以取决于患者的病情、体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和期限而不同。然而，为了优选的作用，本发明的组合物可以以0.0001mg/kg-500mg/kg、优选0.001mg/kg-200mg/kg的每日剂量施用。可以将组合物每日1次或几次施用。组合物可以通过多种途径施用于多种哺乳动物，例如大鼠、家畜、人等。包括本领域常规的所有施用模式，但不限于此，例如口服、直肠或静脉内、肌内、皮下、子宫内或脑室内注射。特别地，可以口服施用组合物，但不限于此。[0072]此外，本发明的药物组合物可以以兽药以及应用于人的药的形式使用。在本文中，动物为包括家畜和宠物的概念。[0073]在本发明中，包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐和甘草提取物或其级分的复合物可以通过包括下列步骤的方法制备：a)混合第一种组合物，其包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分；和第二种组合物，其包含甘草提取物或其级分作为活性成分；和b)用微波处理混合物。[0074]在步骤a)中，混合过程中第一种组合物和第二种组合物的重量比可以为1:1-1:400、1:10-1:400、1:20-1:400、1:30-1:100，特别是1:50-1:70，但不限于此。[0075]在步骤b)中，用微波处理的方法可以为但不限于使用微波搅拌提取器(韩国专利号no.10-1894087)在2,200w-24,000w、优选2,200w-12,000w搅拌提取10分钟-120分钟，优选10分钟-60分钟。[0076]如本文所用，术语“微波”是指具有频带为300mhz-300 ghz或波长为1m-1mm的交替信号。此外，该方法还可以包括在完成提取之后用滤纸纯化的步骤，但不限于此。[0077]本发明的另一个方面提供了用于预防或改善ped病毒感染的食物组合物，该食物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。[0078]基于类姜黄色素的化合物、甘草提取物或其级分、ped病毒与如上所述的相同。[0079]特别地，由式1表示的基于类姜黄色素的化合物可以为姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素中的任何一种或其混合物，但不限于此。[0080]可以将本发明的活性成分添加到食物组合物中，目的在于预防或改善ped病毒感染。当本发明的活性成分用作食物添加剂时，活性成分可以原样添加或与另外的食物或成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据使用目的适当地确定，并且食物组合物中包含的活性成分的量可以为但没有特别地限定于0.0001％重量-10％重量，优选0.001％重量-1％重量，基于组合物的总重量。[0081]对本发明的食物的种类没有特别的限制。作为可添加活性成分的食物的实例可以包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、糖食、披萨、方便面、其它面条、口香糖、乳制品包括冰淇淋、多种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和多种维生素制剂。食物可以包括通常意义上的所有食物，并且可以包括用作动物饲料的食物。[0082]此外，本发明的食物组合物可以包含多种营养物、维生素、电解质、矫味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，本发明的食物组合物可以包括用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜汁的果肉。此外，食物可以根据已知的制备方法制备成片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、液体溶液剂、丸剂的形式。除了包含本发明的活性成分，对其它成分没有特别限制，并且可以包含多种常见的矫味剂或天然碳水化合物作为附加成分。[0083]本发明的又一个目的提供了用于预防或改善ped病毒感染的准标准药物组合物，该准标准药物组合物包含作为活性成分的复合物，该复合物包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。[0084]基于类姜黄色素的化合物、甘草提取物或其级分、ped病毒与如上所述的相同。[0085]特别地，由式1表示的基于类姜黄色素的化合物可以为姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素中的任何一种或其混合物，但不限于此。[0086]可以将本发明的活性成分加入到准标准药物组合物中，目的在于预防或改善ped病毒感染。[0087]如本文所用，术语“准标准药物”是指定义为用于治愈、缓解、治疗或预防人或动物疾病的由纤维、橡胶或类似材料制成的制品；对人体有轻微作用或对人体无直接影响的制品，仪器、机器等除外；和属于用于消毒、杀虫和类似用于预防感染目的试剂范围内的制品，并且准标准药物不包括用于诊断、医疗保健、缓解、治疗或预防人或动物疾病目的的产品，不包括器械、机器和设备；或用于对人或动物的结构或功能时发挥药理作用的目的的产品，器械、机器和设备除外。准标准药物可以包括皮肤外用制剂和个人卫生用品。[0088]可以优选将皮肤外用制剂制备成软膏剂、洗剂、喷雾剂、贴剂、乳膏剂、散剂、混悬剂、凝胶制剂或凝胶剂的形式，但不限于此。上述个人卫生用品可以优选为肥皂、美容化妆品、湿巾、卫生纸、洗发水、护肤霜、面霜、牙膏、口红、香水、粉底、腮红、睫毛膏、眼影、防晒露、护发产品、空气清新凝胶或清洁凝胶，但不特别限于此。此外，本发明的准标准药物组合物的另一个实例包括消毒清洁剂、淋浴泡沫、漱口水、湿巾、去污皂、洗手液、加湿器填充剂、面膜、软膏剂或过滤器填充剂。[0089]当将本发明的活性成分添加至准标准药物组合物中用于预防或改善ped病毒感染的目的时，该活性成分可以原样添加，也可以与其它准标准药物组分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据使用目的适当确定，并且准标准药物组合物中包含的活性成分的量可以为0.0001％重量-10％重量，优选0.001％重量-1％重量，基于组合物的总重量，但没有特别限定。[0090]本发明的另一个目的提供了饲料添加剂或饮用水添加剂，用于预防或改善ped病毒感染，饲料添加剂或饮用水添加剂包含作为活性成分的复合物，该复合物包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。[0091]基于类姜黄色素的化合物、甘草提取物或其级分、ped病毒与如上所述的相同。[0092]特别地，由式1表示的基于类姜黄色素的化合物可以为姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素中的任何一种或其混合物，但不限于此。[0093]如本文所用，术语“饲料添加剂”统称为为了营养或特定目的而以痕量添加到饲料中的物质。在本发明中，饲料添加剂是指为预防或改善ped病毒感染目的而添加的物质。[0094]如本文所用，术语“饲料”是指提供维持个体的生命或饲养个体所必需的有机或无机营养物的物质。饲料可以包含消耗饲料的个体所需的营养物，例如能量、蛋白质、脂质、维生素、矿物质等，但不特别地限定于此。饲料可以为基于植物的饲料，例如谷物、坚果、食物加工副产物、藻、纤维、油、淀粉、膳食、谷物副产物等，或基于动物的饲料，例如蛋白质、无机物、脂肪、矿物质、单细胞蛋白质、浮游动物、鱼粉等。[0095]个体是指饲养的个体，并且可以包括任何活的有机体，但不限于此，条件是能够摄取本公开的饲料。例如，个体为包括家畜和宠物的概念。[0096]此外，除了本公开的饲料添加剂之外，饲料还可以包含用于促进个体生长和预防疾病的另外的饲料添加剂，例如氨基酸、维生素、酶、矫味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、提取剂、寡糖等。[0097]本发明的饲料添加剂可以进一步包含粘合剂、乳化剂、防腐剂等，加入它们以防止质量劣化，并且可以进一步包含氨基酸、维生素、酶、益生菌、矫味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂、寡糖等，添加它们以增加作用。此外，饲料添加剂可以包含其它饲料混合物等，但不限于此。[0098]如本文所用，术语“饮用水添加剂”统称为为营养或特定目的而以痕量添加到动物饮用水中的物质。在本发明中，其是指以预防或改善ped病毒感染为目的而添加的物质。在本文中，动物为包括牲畜和宠物的概念。[0099]本发明的另一个目的提供了包含饲料添加剂或饮用水添加剂的饲料或饮用水，其用于预防或改善ped病毒感染，饲料添加剂或饮用水添加剂包含作为活性成分的复合物，该复合物包含由式1表示的基于类姜黄色素的化合物或其药学上可接受的盐；和甘草提取物或其级分。[0100]基于类姜黄色素的化合物、甘草提取物或其级分、ped病毒、饲料添加剂、饲料和饮用水添加剂与如上所述的相同。[0101]在下文中，参照示例性实施方案更详细地描述本公开。然而，这些示例性实施方案仅用于示例本公开，而并不旨在通过这些示例性实施方案限制本公开的范围。[0102]实施例1：制备姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物和粉末的方法[0103]作为基于类姜黄色素的化合物的姜黄素，使用具有约95％或以上纯度的印度姜黄素。甘草提取物(daepyung co.,ltd.,korea)为包含7％或以上的甘草皂苷的提取物，所述甘草皂苷为以甘草提取物或粉末形式制备的甘草酸。[0104]将25kg甘草提取物溶于125l水中，然后加入375g姜黄素，并且与之混合。此后，将混合物放入微波搅拌提取器(韩国专利号no.10-1894087)，并且在12,000w搅拌下提取60分钟。当提取完成时，用滤纸纯化提取物，以制备液体型姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物。此后，通过真空冷冻干燥得到姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物的粉末(下文称作复合物)。[0105]实施例2：复合物对ped冠状病毒的体外功效评价[0106]2-1.减少ped冠状病毒rna的作用[0107]为了研究复合物对减少猪流行性腹泻(ped)冠状病毒的rna作用，用ped冠状病毒以0.001moi感染vero细胞1小时。用每种浓度(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)的复合物处理后24小时，通过实时pcr检查结果。在减少病毒rna能力方面，与病毒感染组相比，20μg/ml、40μg/ml或60μg/ml浓度的复合物施用组以浓度依赖性方式分别表现出1.7倍、2.6倍或6.6倍病毒rna减少(图1)。[0108]为了研究复合物对ped冠状病毒核蛋白(n蛋白)的靶蛋白表达抑制作用，用ped冠状病毒以0.001moi感染vero细胞1小时。用每种浓度的复合物处理后24小时，检查结果。与病毒感染组相比，阳性对照6-阿扎尿苷在10μm显示出6.8倍的抑制作用，并且20μg/ml、40μg/ml或60μg/ml复合物施用组以浓度依赖性方式分别表现出1.3倍、1.6倍或2.2倍的核蛋白合成抑制(图2)。[0109]2-2.减少ped冠状病毒感染中的抗炎因子的作用[0110]为了研究复合物对tnf-α的抑制作用，tnf-α为牵涉促进炎症的促炎细胞因子，按照与实施例2-1中相同的方式进行病毒感染，随后用复合物处理。与病毒感染组相比，阳性对照6-阿扎尿苷在10μm显示出3.8倍的抑制作用，并且20μg/ml、40μg/ml或60μg/ml浓度的复合物施用组分别显示出1.9倍、2.2倍或2.5倍的抗炎活性(图3)。[0111]为了研究复合物对il-6的抑制作用，il-6为牵涉促进炎症的促炎细胞因子，按照与实施例2-1中相同的方式进行病毒感染，随后用复合物处理。与病毒感染组相比，阳性对照6-阿扎尿苷在10μm显示出5.8倍的抑制作用，并且20μg/ml、40μg/ml或60μg/ml浓度的复合物施用组以浓度依赖性方式分别显示出1.4倍、1.5倍或2.4倍的抗炎活性(图4)。[0112]为了研究复合物对il-8的抑制作用，il-8为牵涉促进炎症的促炎细胞因子，按照与实施例2-1中相同的方式进行病毒感染，随后用复合物处理。与病毒感染组相比，阳性对照6-阿扎尿苷在10μm显示出25.4倍的抑制作用，并且20μg/ml、40μg/ml或60μg/ml浓度的复合物施用组以浓度依赖性方式分别显示出3.7倍、4.1倍或6.4倍的高抗炎活性(图5)。[0113]实施例3：新生猪流行性病毒动物模型的构建和复合物的功效评价[0114]3-1.新生猪流行性病毒动物模型的构建[0115]当使用未接种针对ped病毒的疫苗的母体分娩的3日龄新生仔猪进行分组时，将具有类似平均体重的仔猪分类，并且喂食乳代用品。给未接种病毒并且未施用复合物的阴性对照组口服施用等量的αmem培养基(eagles mem的α改进)。给复合物施用的试验组(5n)口服施用200mg/kg/天的复合物，持续5天，然后以2ml 1×102pfu/ml pedv(aram strain,choongang vaccine laboratories co.,ltd.)口服攻击哺乳仔猪，并且与腹泻诱导的(pid2)仔猪(1n)共同饲养，从而相应地构建导致腹泻的流行病模型。[0116]3-2.存活结果[0117]评价组由模拟感染组、病毒感染组和试验组(共同饲养，并且施用200mg/kg/天)组成。将试验组的仔猪(1n)与模拟感染仔猪(5n)共同饲养并且测定根据14天施用的流行性腹泻模型的存活率。[0118]作为结果，模拟感染组的存活率为100％，直至测试期结束，而病毒感染组显示存活率为40％。相反，复合物施用组显示存活率为80％，表明比病毒感染组的存活率增加了2倍(图6)。[0119]3-3.粪便稠度观察和结果[0120]在本试验过程中，每天观察粪便稠度，并且记录每个个体的粪便评分并且求平均值。将粪便稠度评分如下：正常(0)、糊样(1)、半液体(2)和液体(3)。[0121]作为结果，接种病毒并且未施用复合物的阳性对照组(病毒)显示粪便评分为3，直至接种后10天。相反，在病毒接种后的第10天，施用200mg/kg/天复合物的试验组显示与正常对照组相同的粪便稠度，表明复合物对猪流行性腹泻具有非常高的改善和治疗功效(图7)。[0122]3-4.体重[0123]在实施例3-2的流行病模型中检查了根据复合物施用的体重改变14天。作为结果，模拟感染组显示体重从测试期开始到结束时增加1.5倍，而病毒感染组显示体重无显著性差异。相反，复合物施用组显示体重增加1.5倍，表明即使感染体重也增加(图8)。[0124]3-5.复合物减少粪便/小肠中病毒rna的作用[0125]3-5-1.粪便[0126]病毒感染组和试验组(共同饲养，并且施用200mg/kg/天)在感染后第3天(pid3)至感染后第14天(pid14)粪便中病毒rna趋向于逐渐下降，但模拟感染组除外。在病毒感染组中，检测到病毒，直至测试期结束。相反，在复合物施用组中，从感染后第11天(pid11)到结束日期均未检测到病毒rna，表明改善和治疗猪流行性腹泻的高功效(图9)。[0127]3-5-2.十二指肠[0128]病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)在感染后第3天(pid3)至感染后第14天(pid14)十二指肠中病毒rna趋向于逐渐下降，但模拟感染组除外。在测试期结束时(pid14)，与病毒感染组相比，复合物施用组十二指肠中的病毒rna显示约5倍下降，表明改善和治疗猪流行性腹泻的高功效(图10)。[0129]3-5-3.空肠[0130]病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)在感染后第3天(pid3)至感染后第14天(pid14)空肠中病毒rna趋向于逐渐下降，但模拟感染组除外。在测试期结束时(pid14)，与病毒感染组相比，复合物施用组空肠中的病毒rna显示约6倍下降，表明改善和治疗猪流行性腹泻的高功效(图11)。[0131]3-5-4.回肠[0132]病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)在感染后第3天(pid3)至感染后第14天(pid14)回肠中病毒rna趋向于逐渐下降，但模拟感染组除外。在测试期结束时(pid14)，与病毒感染组相比，复合物施用组回肠中的病毒rna显示约6倍下降，表明改善和治疗猪流行性腹泻的高功效(图12)。[0133]3-6.复合物减少小肠/肠系膜中促炎因子的作用[0134]3-6-1.十二指肠[0135]检查了模拟感染组、病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)的十二指肠中促炎因子减少的作用。作为结果，观察到tnf-α、il-6和il-8分别约14倍下降、约19倍下降和约5倍下降，表明复合物对猪流行性腹泻病毒感染具有极高的抗炎活性(图13)。[0136]3-6-2.空肠[0137]检查了模拟感染组、病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)的空肠中促炎因子减少的作用。作为结果，观察到tnf-α、il-6和il-8分别约21倍下降、约13倍下降和约21倍下降，表明复合物对猪流行性腹泻病毒感染具有极高的抗炎活性(图14)。[0138]3-6-3.回肠[0139]检查了模拟感染组、病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)的回肠中促炎因子减少的作用。作为结果，观察到tnf-α、il-6和il-8分别约45倍下降、约60倍下降和约45倍下降，表明复合物对猪流行性腹泻病毒感染具有极高的抗炎活性(图15)。[0140]3-6-4.肠系膜[0141]检查了模拟感染组、病毒感染组和试验组(共同饲养，施用200mg/kg/天)的肠系膜中的促炎因子减少的作用。作为结果，观察到tnf-α、il-6和il-8分别约36倍减少、约82倍减少和约60倍减少，表明复合物对猪流行性腹泻病毒感染具有极高的抗炎活性(图16)。[0142]3-7.总体临床症状[0143]阴性对照组的仔猪在试验期间没有显示临床症状包括腹泻，并且它们维持正常的肠形态和小肠屏障。相反，阳性对照组(病毒)从病毒接种第一天到试验结束或死亡持续显示腹泻症状。特征性总体临床症状为抑郁、腹泻前/后即刻厌食、呕吐和由于严重的水泻引起的脱水和体重减轻。特征性尸检结果为小肠内充满流体和由于气胀和浆膜变薄导致的肉眼可见的内容物。在共同饲养后的第3天，施用复合物200mg/kg/天的试验组的小肠显示小肠壁变薄，并且由于水性流体和气体引起的膨胀，但维持了粘膜襞的形态，与病毒感染组类似。在共同饲养后的第10天，施用低或高浓度复合物的试验组的小肠维持了正常的肠形态和小肠屏障，并且粘膜襞明显，与模拟感染组类似(图17)。[0144]在试验期间，除阴性对照组外，所有试验组显示在接种后的期限内随着时间的推移，摄取降低。特别地，阳性对照组(病毒)在共同饲养后第3天显示急剧降低的摄取率。然而，与病毒感染组相比，复合物施用组维持了约30％或更高的摄取率，表明复合物治疗对由病毒感染引起的厌食和体力下降具有改善的功效。[0145]3-8.组织病理学检查[0146]在试验结束时，对每个个体实施安乐死和尸检，并且收集小肠(十二指肠、空肠、回肠)并且分成小块，在10％中性福尔马林中固定，并且按常规方法制备病理组织样本以制备每个组织的苏木精和伊红染色载玻片，其用于对小肠绒毛萎缩进行组织病理学检查。通过获得绒毛:隐窝比来比较小肠的绒毛萎缩。[0147]作为结果，在阴性对照组的小肠中，绒毛呈正常的手指样形状，并且隐窝大小正常。相反，在阳性对照组的仔猪中，病毒在小肠的绒毛上皮细胞中增殖，并且绒毛上皮细胞脱落。作为结果，绒毛萎缩和融合发生，并且明显观察到隐窝增殖取代脱落的绒毛。此外，粘膜固有层中观察到充血和出血，并且观察到单核细胞浸润。与阳性对照组相比，200mg/kg/天复合物治疗的试验组显示绒毛总长度增加，并且绒毛呈正常手指样形状，并且隐窝大小也正常(图18)。[0148]如上所述，姜黄素-甘草皂苷水溶性复合物，其中使用甘草提取物增加了基于类姜黄色素的化合物姜黄素的水溶性，对ped冠状病毒表现出极佳的抑制功效。单独使用姜黄素或单独使用甘草提取物(甘草皂苷)的一些生理作用已有报道，但它们对ped冠状病毒没有抑制作用。[0149]基于上述描述，本领域技术人员可以理解，本公开在不改变其技术思想或必要特征的情况下，可以以不同的具体形式实施。在这方面，应当理解，上述实施方案在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。本公开的范围由所附权利要求定义，而不由在其之前的描述定义，并且由此所有落入权利要求范围和边界内的改变和修饰或这类范围和边界的等效方案均旨在被权利要求所涵盖。[0150]本发明的效果[0151]本发明的包含基于类姜黄色素的化合物和甘草提取物或其级分的组合物表现出这些组分之间的协同作用，并且由此在体内的吸收率增加，抗病毒作用显著改善，并且不存在副作用。因此，尽管使用少量，也可以有效预防、治疗和改善猪流行性腹泻(ped)病毒感染。因此，该组合物可以应用于药物组合物、准标准药物组合物、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料或饮用水，用于预防、改善或治疗ped病毒感染。









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