一种C7orf50基因或蛋白的抑制剂的用途

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种c7orf50基因或蛋白的抑制剂的用途技术领域1.本发明涉及一种c7orf50基因或蛋白的抑制剂的用途，属于分子生物技术领域。背景技术：2.尽管肝癌作为当前世界第六大最常见肿瘤和第三大癌症死因，却只有5–10％的肝癌患者可以进行手术切除。由于其症状在早期阶段并不明显，因此大多数患者被诊断时已经处于疾病晚期，可用治疗手段极其有限。肝癌的致病机制复杂，其发生和发展是一个多因素过程，受各种遗传和非遗传因素的累积驱动。抑癌基因(如p53)的异常失活，原癌基因(如k-ras)的异常激活，信号通路(如pi3k，mapk，jak/stat，nf-κb，wnt/β-catenin)的异常改变，表观遗传事件的异常调节等均可参与肝癌的发展和进程。肝癌从异常生长到威胁生命的转移性肿瘤的发展过程中亦伴随着各种因子改变的积累。因此，本领域迫切需要对肝癌发生发展调控分子机理的研究，从而更好地了解肝癌的发病机理，开发出有效治疗肝癌或抑制肝癌转移的药物。技术实现要素：3.本发明解决的技术问题是：如何开发有效治疗肝癌的分子靶标和能够有效治疗肝癌或抑制肝癌转移的药物的技术问题。4.为了解决上述问题，本发明提供了一种c7orf50基因或蛋白的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗肝癌的药物和/或用于制备抑制肝癌转移的药物。5.优选地，所述药物包括医学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述活性成分为c7orf50基因或蛋白的抑制剂。6.优选地，所述c7orf50基因或蛋白的抑制剂包括c7orf50基因特异性的rnai、c7orf50基因特异性的microrna、c7orf50基因的shrna、c7orf50基因的sirna、c7orf50蛋白的抗体或c7orf50蛋白的活性抑制剂。7.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：8.本发明公开了未知功能的c7orf50基因或蛋白的功能，并基于c7orf50基因或蛋白在肝癌增殖和转移中的调节作用，通过rnai敲减c7orf50基因可有效抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移，并抑制肝癌肺转移，提供了能够有效治疗肝癌的分子靶标，为肝癌的新药研发和临床诊断与治疗提供了新的方向。附图说明9.图1a为从tcga数据库中提取的c7orf50基因在肝癌组织中的表达图示；10.图1b为从tcga数据库中提取的c7orf50基因表达与肝癌预后关系的图示；11.图1c为c7orf50基因在20对临床肝癌样本中的表达量的图示，其中t为癌组织，p为癌旁组织；12.图1d为pcr检测c7orf50基因在肝癌细胞系中的表达量的结果图；premix ex taq(takara，中国大连)进行实时聚合酶链反应(qpcr)。36.5.稳转株构建37.通过吉凯基因公司合成c7orf50的过表达和敲低病毒，然后进行肝癌细胞株转染及嘌呤霉素筛选。38.6.细胞增殖，迁移和侵袭分析39.(1)细胞增殖实验：采用cck-8试剂盒，按照说明书操作，将细胞置于96孔板中，分别第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天加入cck-8溶液，观察并记录od值，制作生长曲线。40.(2)细胞克隆形成实验：将细胞接种于六孔板中，细胞培养箱中培养，14天后使用多聚甲醛进行固定和结晶紫染液染色后，拍照并统计数据。41.(3)transwell小室迁移侵袭实验：按照transwell滤室(bd biosciences,usa)说明书的操作，放置或不放置matrigel胶于上室中，然后取600μl完全培养基置于二十四孔板(即下室)中，取200μl的无血清细胞置于上室，置于常规培养箱中进行培养，48小时后，取出小室，使用清水进行漂洗，后将其置于多聚甲醛中固定和结晶紫染液中染色，使用棉签小心擦拭上室贴壁的细胞并用清水漂洗后，置于显微镜下观察下室穿过的细胞，并进行细胞计数及拍照。42.(4)划痕实验：将细胞接种于六孔板中，细胞培养箱中培养，长满后进行划痕，分别于0h，24h，48h拍照并记录细胞生长情况。。43.7.动物模型44.四到六周大的雄性裸鼠(balb/c nu/nu)购自中国科学院上海物质医学研究所，所有动物均保持在无特定病原体动物(spf)条件下。给小鼠皮下注射3×106肝癌细胞。在指定的时间间隔测量肿瘤体积。接种后30天处死具有肿瘤的小鼠，并取出肿瘤以进一步研究。所有实验均须经上海癌症研究所动物保护和使用委员会批准。45.实施例146.验证c7orf50基因或蛋白与肝肿瘤转移能力和预后相关：47.1.1通过tcga数据库提取c7orf50基因在肝癌组织和癌旁组织中的表达，如图1a所示，c7orf50基因在癌组织中的表达高于在癌旁组织中的表达；并提取c7orf50基因表达量与患者预后的关系，如图1b所示，表面c7orf50基因表达量与患者预后密切相关。从既往收集的肝癌样本中随机抽取20例病例检测c7orf50蛋白表达水平，如图1c所示，c7orf50蛋白在大多数样本(16/20)中呈高表达。48.1.2采用rt-qpcr检测方法检测c7orf50 mrna在转移潜能不同的肝癌细胞系中的表达量，结果如图1d所示，c7orf50 mrna在高转移潜能细胞系(hcclm3、mhcc97h和mhcc97l)呈相对高表达，在低转移潜能细胞系(hepg2和plc/prf/5)呈相对低表达，在正常肝细胞系l0-2呈最低表达；采用免疫印迹法进一步检测c7orf50蛋白在转移潜能不同的肝癌细胞系中的表达量，如图1e所示，c7orf50蛋白在高转移潜能细胞系(hcclm3、mhcc97h和mhcc97l)呈相对高表达，在低转移潜能细胞系(hepg2和plc/prf/5)呈相对低表达，在正常肝细胞系l0-2呈最低表达。说明c7orf50基因或蛋白与肝肿瘤转移能力有关。49.实施例250.rnai敲减c7orf50基因可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力，并能抑制肝癌肺转移：51.2.1利用慢病毒在hcclm3中构建了c7orf50基因的敲减、敲减后回补稳转细胞株，利用慢病毒在plc/prf/5中构建了c7orf50基因的过表达稳转细胞株，检测稳转细胞株中c7orf50 mrna的表达水平，如图2a所示，检测稳转细胞株中c7orf50蛋白表达水平，如图2b所示。52.2.2使用细胞计数试剂盒8(cck-8)(dojindo，日本)测量hcclm3和plc/prf/5细胞稳转株的体外增殖能力，按照cck-8的说明书进行操作，实验结果显示在hcclm3细胞中c7orf50基因的敲低降低了为肝癌细胞的增殖能力，而敲低后挽救回补c7orf50基因的hcclm3细胞的增殖能力却得到明显恢复，在plc/prf/5细胞中过表达c7orf50基因，过表达c7orf50基因的plc/prf/5细胞的增殖能力亦得到明显增强，如图2c所示。53.2.3细胞克隆形成实验可以检测细胞群体依赖性和增殖能力，取如图2d所示各组相同数目的对数生长期细胞于培养皿中，2周后固定细胞，结晶紫染色拍照记录克隆数，结果显示敲低c7orf50基因能有效抑制肝癌细胞的增殖，如图2d所示。54.2.4细胞迁移侵袭实验(transwell滤室，bd biosciences,usa)与划痕实验可以检测肝癌细胞的侵袭与迁移能力，结果表明敲低c7orf50基因会抑制肝癌细胞的侵袭与迁移能力，而过表达c7orf50会增强肝癌细胞的侵袭与迁移能力，细胞迁移侵袭实验结果如图2e所示，划痕实验结果如图2f所示。55.实施例356.rnai敲减c7orf50基因可有效抑制肝肿瘤的生长和肝癌肺转移：57.3.1利用慢病毒在hcclm3中构建了c7orf50基因的敲减、敲减后回补稳转细胞株，利用慢病毒在plc/prf/5中构建了c7orf50基因的过表达稳转细胞株，然后将构建的c7orf50基因的敲减、敲减后回补的稳转细胞株注射到小鼠皮下，以注射正常hcclm3细胞株为对照组，将构建的c7orf50基因过表达的稳转细胞株注射到小鼠皮下，以注射正常plc/prf/5细胞株为对照组，成瘤后将小块皮下肿瘤原位移植到裸鼠的肝脏中(小鼠原位瘤模型)。小鼠原位瘤模型的活体成像结果如图3a所示，敲减c7orf50基因的hcclm3细胞株的肿瘤体积明显小于对照hcclm3细胞株的肿瘤体积，而敲减后回补c7orf50基因组的肿瘤体积较c7orf50敲减组有所增加，过表达c7orf50基因的plc/prf/5细胞株的肿瘤体积明显大于对照plc/prf/5细胞株的肿瘤体积，表明rnai敲减c7orf50可抑制肝肿瘤的生长。c7orf50基因敲减或过表达的肝原位瘤的荧光定量结果如图3c所示，c7orf50基因敲减或过表达的肝原位瘤的重量定量结果如图3e所示，c7orf50基因敲减组的肝原位瘤的重量明显低于对照组和回补组，进一步说明rnai敲减c7orf50可抑制肝癌的增殖和肝肿瘤的生长。58.3.2取肝癌小鼠的肺组织进行he染色，结果如图3b所示，c7orf50基因敲减组的原位瘤的肺转移能力明显小于对照组，而敲减后回补c7orf50基因的原位瘤的肺转移能力较c7orf50敲减组有所增加，而过表达c7orf50基因的原位瘤相对于对照组出现了明显的肺部转移。c7orf50基因敲减或过表达的肺转移灶的荧光定量结果如图3d所示，c7orf50基因敲减或过表达的肺转移结节定量结果如图3f所示，c7orf50基因敲减组的肺转移结节的数量明显少于对照组和回补组，进一步说明rnai敲减c7orf50可有效抑制肝癌肺转移。59.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。









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