一种同时适用于新型烟草产品中酚类化合物及尿液中酚类化合物的代谢物的分析方法与流程

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于理化检验技术领域，具体涉及一种同时适用于新型烟草产品中酚类化合物及尿液中酚类化合物的代谢物的分析方法。背景技术：2.6,6,9-三甲基-3-戊基-6h-二苯并(b,d)吡喃-1-酚(cbn)、2-[(1r,6r)-3-甲基-6-丙基-1-烯-2-环己烷基-2-烯-1-基]-5-戊基苯-1,3-二醇(cbd)和6h-二苯并[b,d]吡喃-1-醇,6a,7,8,10a-四氢化-6,6,9-三甲基-3-戊烷基(thc)是影响中枢神经的化合物，其中cbn和cbd具有较强的生理活性，thc是作用最强的精神活性物质，对中枢神经有兴奋作用，可使人产生幻觉和愉快的感受。当thc进入人体后，很快被代谢为(6ar,10ar)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-戊烷基-6a,7,8,10a-四氢苯[c]呋喃-2-羧酸(thca)，因此很难在人体中检测到thc，但thc的代谢物-thca在一个月内都能在尿液中被检出。基于此，也将thca用作检测服用thc的主要指标。然而，目前食品安全和预防非法添加领域的检测对象主要集中在cbn、cbd和thc，反兴奋剂服用领域则主要检测thca，尚未公开能够同时适用于检测以上四种化合物的方法。为了完整地监测人体服用cbn、cbd和thc等酚类化合物并固定证据链，有必要建立一种同时适用于分析以上酚类化合物和及其代谢物-thca的方法。[0003]电子烟是一种新型烟草产品，其通过雾化烟液产生烟雾而让使用者在吸食时产生一种类似抽烟的感觉。然而，一些不法生产者为了获取非法利润而在电子烟烟液中添加含上述酚类化合物的植物提取物，吸食者误用或使用含某些植物提取物的电子烟烟液后将产生极大的健康风险。因此，建立一种能同时适用于电子烟烟液和尿液中酚类化合物和/或thca分析的方法，具有重要意义。[0004]现有已公开的免疫检测法具有选择性高、操作程序简单等优势，是对酚类化合物和thca进行快速定性、定量分析的一种方法。然而，其在灵敏度和检测范围等方面存在一定的局限性，只能作为初步筛查手段来用。目前，对酚类化合物和thca进行准确定量的分析检测方法主要有气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)。其中，为了提高检测灵敏度和分离效果，气相色谱分析需要对目标分析物进行加热衍生处理，thca会在此过程中发生脱羧反应，从而影响分析。即使不进行衍生化反应而直接进行气相色谱分析，气相色谱进样口的高温环境同样会使thca发生脱羧反应。[0005]现有文献还报道了食用油、尿液和运动营养品等多种样品中的酚类化合物和thca的检测，但是这些检测方法都存在以下问题：一是检测的化合物的种类最多为三种(cbd、cbn和thc)，没有同时适用于分析cbd、cbn、thc和thca的方法；二是检测的样品对象只有一种。技术实现要素：[0006]为了克服现有技术的缺陷，本发明建立了一种灵敏准确、抗干扰能力强、能同时适用于电子烟烟液和尿液中酚类化合物和/或thca的测定的方法，该方法能够对电子烟烟液和尿液中的酚类化合物和/或thca实现准确定性定量，具有简单快速、灵敏准确、测定目标物种类多和适用范围广的优点。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：[0007]一种同时适用于电子烟烟液中cbd、cbn和thc及尿液中thca的检测方法，所述方法采用液相色谱-质谱联用来进行，其中：[0008]所述液相色谱采用的色谱条件包括：色谱柱为hisep c18-t；色谱温度为40℃；进样量为10μl；流动相为甲醇/水，其中流动相中甲醇与水的体积比为(75～90):(10～25)，优选地，流动相中甲醇与水的体积比为85:15；流速为0.2ml/min；[0009]所述质谱采用的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；电离模式为负离子；离子源温度为500℃；离子源电压为-4500v；雾化气压力、辅助雾化气压力和气帘气压力分别为50psi、50psi和20psi；[0010]优选地，在所述质谱中，目标分析物及内标的多反应监测参数如下：[0011][0012]优选地，所述检测方法还包括a)标准工作溶液的配制，其中所述标准工作溶液的配制包括如下步骤：[0013]a-1)以甲醇为溶剂，配制cbd、cbn和thc的同位素内标cbn-d3、cbd-d3和thc-d3的混合标准溶液，在所述混合标准溶液中，每种同位素内标的浓度均为100ng/ml；[0014]a-2)以甲醇为溶剂，分别配制cbd、cbn、thc和thca的储备液，在所述储备液中，相应化合物的浓度均为1000ng/ml；[0015]a-3)以甲醇/水(90/10,v/v)为溶剂，配制含同位素内标的系列标准工作溶液，其中所述系列标准工作溶液中cbn和thca的浓度梯度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，cbd和thc的浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，其中同位素内标的浓度均为1.0ng/ml；[0016]优选地，所述检测方法还包括b)样品的前处理，其中，当样品为电子烟烟液时，所述前处理包括如下步骤：b-1)称取1.0g电子烟液样品于15-ml具塞离心管中，依次加入100μl步骤a-1)配制的混合标准溶液和10ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm速度离心3min后取上清液；或[0017]当样品为尿液时，所述前处理包括如下步骤：b-2)在1.0ml尿液中加入1.0ml浓度为1.0mol/l的naoh溶液，80℃下水解30min，加入100μl步骤a-1)配制的混合标准溶液后用1.0ml浓度为2.0mol/l的hcl溶液调节ph值，再加入8.0ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm的速度离心3min后取上清液；[0018]可选地，所述检测方法还包括计算目标分析物的含量的步骤，其中，通过目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行计算；进一步地，所述计算目标分析物的含量包括如下步骤：[0019]d-1)以系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线；[0020]d-2)将在样品中测得的分析物与内标峰面积的比值代入如下的线性回归方程，即可求得样品中目标分析物的含量；[0021][0022]其中x为目标物与内标物的峰面积之比，m为样品中目标物的含量(ng/g或ng/ml)，a和b为工作曲线中的斜率和截距，v为样品溶液最终的体积(ml)，n为样品质量或体积(g或ml)；[0023]在本发明的一些具体实施方案中，提供了一种同时适用于电子烟烟液中cbd、cbn和thc及尿液中thca的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：[0024]a)标准工作溶液的配制：[0025]a-1)以甲醇为溶剂，配制cbd、cbn和thc的同位素内标cbn-d3、cbd-d3和thc-d3的混合标准溶液，在所述混合标准溶液中，每种同位素内标的浓度均为100ng/ml；[0026]a-2)以甲醇为溶剂，配制cbd、cbn、thc和thca的储备液，在所述储备液中，相应化合物的浓度均为1000ng/ml；[0027]a-3)以甲醇/水(90/10,v/v)为溶剂，配制含同位素内标的系列标准工作溶液，其中所述系列标准工作溶液中cbn和thca的浓度梯度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，cbd和thc的浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，其中同位素内标的浓度均为1.0ng/ml；[0028]b)样品前处理：[0029]其中，当样品为电子烟烟液时，所述前处理包括如下步骤：b-1)称取1.0g电子烟液样品于15-ml具塞离心管中，依次加入100μl步骤a-1)配制的混合标准溶液和10ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm速度离心3min后取上清液；或[0030]当样品为尿液时，所述前处理包括如下步骤：b-2)在1.0ml尿液中加入1.0ml浓度为1.0mol/l的naoh溶液，80℃下水解30min，加入100μl步骤a-1)配制的混合标准溶液后用1.0ml浓度为2.0mol/l的hcl溶液调节ph值，再加入8.0ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm速度离心3min后取上清液；[0031]c)、将含内标的系列标准工作溶液和样品溶液在相同条件下进行液相色谱-串联质谱测定，其中所述液相色谱采用的色谱条件包括：色谱柱为hisepc18-t；色谱柱温度为40℃；进样量为10μl；流动相为甲醇/水(85/15,v/v)；流速为0.2ml/min；[0032]所述质谱采用的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；电离模式为负离子；离子源温度为500℃；离子源电压为-4500v；雾化气压力、辅助雾化气压力和气帘气压力分别为50psi、50psi和20psi；其中，目标分析物及内标的多反应监测参数如下：[0033][0034][0035]d)结果计算：d-1)以系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线；[0036]d-2)将在样品中测得的分析物与内标峰面积的比值代入如下的线性回归方程，即可求得样品中目标分析物的含量；[0037][0038]其中x为目标物与内标物的峰面积之比，m为样品中目标物的含量(ng/g或ng/ml)，a和b为工作曲线中的斜率和截距，v为样品溶液最终的体积(ml)，n为样品质量或体积(g或ml)。[0039]本发明针对现有技术的缺陷，专门设计了一种同时适用于电子烟烟液和尿液中酚类化合物(cbd、cbn和thc)和thca分析的方法，该方法通过将样品进行前处理，然后进行液相色谱-串联质谱分析。与现有技术相比，本发明提供的方法的有益效果至少包括以下方面：[0040]1)克服了现有测定技术中无法同时适用于多种样品的问题。本技术的发明人针对电子烟烟液和尿液样品的不同特点，选择了特定的前处理方案。具体地，由于电子烟烟液是以丙二醇/丙三醇(约为1/2,v/v)为溶剂，同时添加烟碱、香精等提取物制得，因此考虑以甲醇和乙腈作为提取液。然而，乙腈的毒性比甲醇大，同时后续分析是以甲醇为流动相，因此为了样品提取时的安全和避免色谱分析时的溶剂效应，最终选择以甲醇作为提取溶剂。另外，由于大部分thca在体内会迅速与葡萄糖形成醛酸甙结合物，所以发明人在选择尿液样品的前处理方案时，首先选择采用碱水解来破坏其结合态，再通过酸的加入使游离的目标分析物呈现中性并被提取出来。[0041]2)将同时测定的目标化合物的数量增加至4种，对完善分析结果、合理推断与解释具有重要作用：尿液中的thca是确定食用thc的重要证据，同时分析三种酚类化合物和thca更可帮助判断使用时间。[0042]3)以液相色谱-串联质谱技术为检测手段，避免复杂的衍生化过程和thca的转化分解。本专利同时对影响分析的质谱参数和色谱参数进行了优化，最终得到的本发明的方法具有灵敏度高、抗干扰能力强、线性范围宽的优点。附图说明[0043]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：[0044]图1为负离子模式下4种目标化合物的一级质谱图，其中图a-d分别对应cbd、cbn、thc和thca的结果，基峰均为分子离子峰，内嵌图为相应的结构式；[0045]图2为正离子模式下4种目标化合物的一级质谱图，其中图a-d分别对应cbd、cbn、thc和thca的结果，加粗的离子对应为分子离子峰；[0046]图3为负离子模式下4种目标化合物的二级质谱图及可能的碎片离子，其中图a-d分别对应cbd、cbn、thc和thca的结果；[0047]图4为负离子模式下4种目标化合物的碰撞能优化结果，其中图a-d分别对应cbd、cbn、thc和thca的结果；[0048]图5为负离子模式下4种目标化合物的去簇电压优化结果，其中图a-d分别对应cbd、cbn、thc和thca的结果；[0049]图6为流动相中甲醇比例的优化结果，其中从上至下，流动相中甲醇所占的体积百分比依次为75％、80％、85％和90％。具体实施方式[0050]本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。[0051]实施例1:电子烟烟液样品中cbd、cbn、thc和thca的检测[0052]a)、标准工作溶液的配制：a-1)以甲醇为溶剂，配制三种酚类化合物的同位素内标(cbn-d3、cbd-d3和thc-d3)混合标准溶液，其中每种内标的浓度均为100ng/ml；a-2)再以甲醇为溶剂，配制三种酚类化合物和thca的储备液，其中每种化合物的浓度均为1000ng/ml；a-3)再以甲醇/水(90/10,v/v)为溶剂，配制含内标的系列混合标准溶液，其中所述混合标准工作溶液中cbn和thca的浓度梯度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml、cbd和thc的浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，其中内标的浓度均为1.0ng/ml；[0053]b)、样品前处理：b-1)称取1.0g电子烟烟液样品于15-ml具塞离心管中，依次加入100μl内标混合标准溶液和10ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm速度离心3min后取上清液，待测；[0054]c)、仪器测定：将含内标的系列标准工作溶液和样品溶液在相同条件下进行液相色谱-串联质谱测定，其中液相色谱条件为：色谱柱为hisep c18-t(维泰克科技(武汉)有限公司，150mm×2.0mm,5μm)；色谱柱温度为40℃；进样量为10μl；流动相为甲醇/水(85/15,v/v)；流速为0.2ml/min；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；电离模式：负离子；离子源温度：500℃；离子源电压：-4500v；雾化气压力、辅助雾化气压力和气帘气压力分别为50psi、50psi和20psi；目标分析物及内标的多反应监测参数如表1所示(其中黑色标注的子离子用于定量)；[0055]表1 目标分析物和内标的多反应参数[0056][0057][0058]d)、结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量，具体方法是d-1)以系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线。其中，纵坐标代表目标分析物峰面积和内标峰面积之比，横坐标表示目标分析物的浓度。d-2)对样品液进行测定时，将测得分析物与内标峰面积的比值代入相应的线性回归方程，即可求得样品中目标分析物的含量。其计算公式为[0059]其中x为目标物与内标物的峰面积之比，m为样品中目标物的含量(单位为ng/g)，a和b为工作曲线中的斜率和截距，均由工作曲线求出，v为样品溶液最终的体积(单位为ml)，n为样品质量(单位为g)。[0060]按照上述方法对电子烟液a进行分析，结果表明样品中不含本专利方法研究的三种酚类化合物和thca。为了进一步验证方法的适用性和准确性，在样品中添加三种酚类化合物和thca的标准品，添加浓度为0.5ng/ml，之后按照上述方法进行分析。结果表明，目标分析物与干扰物分离良好，干扰物质不影响目标物的定量。如表2所示，样品中目标分析物的相对回收率介于90.6-106.1％之间，表明方法的准确性良好，可以满足日常电子烟液样品中酚类化合物和thca的分析要求。[0061]表2 电子烟液样品a中目标分析物的加标回收率和精密度[0062][0063]实施例2：市售电子烟烟液样品检测[0064]按实施例1所述的测定方法，选取另外1种市售电子烟烟液，测定其中三种酚类化合物和thca的含量，结果表明该样品中不含本专利方法研究的三种酚类化合物和thca。在样品中添加三种酚类化合物和thca的标准品，添加浓度为0.5ng/ml，之后按照实施例1所述方法进行分析。结果表明，在优化的条件下，目标分析物与干扰物分离良好，干扰物质不影响目标物的定量。如表3所示，样品中目标分析物的相对回收率介于89.5-104.8％之间。[0065]表3 电子烟液样品b中目标分析物的加标回收率和精密度[0066][0067]实施例3:尿液中三种酚类化合物和thca的测定[0068]a、标准工作溶液的配制：a-1)以甲醇为溶剂，配制三种酚类化合物的同位素内标(cbn-d3、cbd-d3和thc-d3)混合标准溶液，其中每种内标的浓度均为100ng/ml；a-2)再以甲醇为溶剂，配制三种酚类化合物和thca的储备液，其中每种化合物的浓度均为1000ng/ml；a-3)再以甲醇/水(90/10,v/v)为溶剂，配制含内标的系列混合标准溶液，其中所述混合标准工作溶液中cbn和thca的浓度梯度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml、cbd和thc的浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0ng/ml，其中内标的浓度均为1.0ng/ml；[0069]b)、样品前处理：b-2)在1.0ml尿液中加入1.0ml naoh溶液(1.0mol/l)，80℃下水解30min，加入100μl内标混合标准溶液后用1.0ml hcl溶液(2.0mol/l)调节ph值，再加入8.0ml甲醇后涡旋振荡1min混匀，超声提取10min后，以8000rpm速度离心3min后取上清液，待测；[0070]c)、仪器测定：将含内标的系列标准工作溶液和样品溶液在相同条件下进行液相色谱-串联质谱测定，其中液相色谱条件为：色谱柱为hisep c18-t(维泰克科技(武汉)有限公司，150mm×2.0mm,5μm)；色谱柱温度为40℃；进样量为10μl；流动相为甲醇/水(85/15,v/v)；流速为0.2ml/min；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；电离模式：负离子；离子源温度：500℃；离子源电压：-4500v；雾化气压力、辅助雾化气压力和气帘气压力分别为50psi、50psi和20psi；目标分析物及内标的多反应监测参数如实施例1的表1所示(其中黑色标注的子离子用于定量)；[0071]d)、结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量，具体方法是d-1)以系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线。其中，纵坐标代表目标分析物峰面积和内标峰面积之比，横坐标表示目标分析物的浓度。d-2)对样品液进行测定时，将测得分析物与内标峰面积的比值代入相应的线性回归方程，即可求得样品中目标分析物的含量。其计算公式为其中x为目标物与内标物的峰面积之比，m为样品中目标物的含量(单位为ng/ml)，a和b为工作曲线中的斜率和截距，均由工作曲线求出，v为样品溶液最终的体积(单位为ml)，n为样品体积(单位为ml)。[0072]按照上述方法对尿液进行分析，结果表明样品中不含本专利方法研究的三种酚类化合物和thca。为了进一步验证方法的适用性和准确性，在样品中添加三种酚类化合物和thca的标准品，添加浓度为0.5ng/ml，之后按照上述方法进行分析。结果表明，目标分析物与干扰物分离良好，干扰物质不影响目标物的定量。如表4所示，样品中目标分析物的相对回收率介于88.6-100.5％之间，表明方法的准确性良好，可以满足日常尿液样品中酚类化合物和thca的分析要求。[0073]表4 尿液样品中目标分析物的加标回收率和精密度[0074][0075][0076]实施例4：[0077]本发明所提供的方法的检测限和定量限为目标分析物信噪比(s/n)为3和10时所对应的浓度。以目标分析物的峰面积和内标峰面积之比对目标分析物浓度作图，得到其工作曲线。其中cbd、cbn、thc和thca所使用的内标分别是cbn-d3、cbd-d3、thc-d3和thc-d3。cbd、cbn、thc和thca的线性范围、工作曲线、检测限和定量限等见表5。从表5可以看出，本技术中4种化合物的检出限和定量限介于0.0025～0.0083ng/ml和0.0085～0.028ng/ml之间，定量限低于文献报道，可以满足样品中痕量目标物的分析。4种目标物的线性范围为0.01～10ng/ml或0.05～10ng/ml，在相应的线性范围内工作曲线的r值不小于0.9982，说明方法的线性关系良好。[0078]表5 本发明方法中目标化合物的线性范围、工作曲线、检出限和定量限[0079][0080]实施例5：本发明方法的重复性和准确性考察[0081]我们通过分析三种不同浓度(低、中、高3种浓度分别为0.05、0.5和5.0ng/ml)下的目标分析物来考察方法的重复性和准确性，1d内重复分析5次，通过标准工作曲线计算得到实际检测值，并计算不同浓度下的回收率和日内相对标准偏差；以连续3d制备的样品进行测定，计算不同浓度下的回收率和日间相对标准偏差。结果如表6所示，[0082]表6 种目标分析物在不同浓度下的准确度和精密度[0083][0084]从表6可以看出，目标分析物在不同浓度下的回收率为99.3％～102.1％，日内及日间精密度分别不大于5.2％和6.5％。以上说明该方法的重复性和稳定性等可以满足三种酚类化合物和thca的日常检测需求。[0085]实施例6：电离模式的优化[0086]为了获得较高的灵敏度，我们对影响分析结果的仪器参数和条件进行了优化和考察，具体包括影响检测灵敏度的电喷雾电离模式、多反应参数、去簇电压和影响分离效果流动相条件。图1和图2分别为负离子和正离子模式下4种目标化合物的一级质谱图。通过比较图1和图2可以发现：①负离子模式下4种目标化合物的基峰均为各自的分子离子峰且强度较其它碎片离子也较高，而正离子模式下只有cbn的基峰为其分子离子峰，且强度较其它碎片离子也不高；②负离子模式下各化合物的分子离子峰周围干扰较少，而正离子模式下相对较多；③负离子模式下各化合物的响应强度高于正离子模式，说明负离子模式下各目标物的质谱电离行为好于正离子模式。因此，后续实验选择负离子电离模式。[0087]实施例7：[0088]在负离子模式下，以4种化合物的分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，结果如图3所示。我们以响应较高的两个碎片离子作为子离子，并对其可能的结构进行了推测。确定了4种化合物的子离子和母离子后，我们又对碰撞能进行了优化，结果如图4所示。可以发现，4种化合物的两个离子对强度在优化的范围内均是呈现先上升后下降的趋势。最后，为了防止已经离子化的粒子再次团聚在一起，同时也为了避免源内裂解，我们对去簇电压进行了优化，结果如图5所示。综合上述优化结果，4种目标分析物和相应内标的多反应监测参数如下：[0089][0090]实施例8：[0091]流动相的组成不仅会影响到目标分析物的色谱保留时间和峰形，而且还会对目标分析物的离子化效率和灵敏度造成影响。液相色谱-串联质谱常用的流动相体系为甲醇-水和乙腈-水。由于甲醇的毒性比乙腈小，因此采用甲醇-水体系作为流动相。我们优化了流动相中甲醇的比例，结果如图6所示。可以发现，当流动相中甲醇的比例从75％提高至90％时，4种目标物的分析时间从35分钟减少至10分钟。流动相中甲醇的比例为85％时，cbn和cbd的分离效果好于甲醇的比例为90％，色谱分离的时间增加也不多(约1分钟)。因此，后续实验中选择的流动相为甲醇/水(85/15,v/v)，在11分钟内可实现4种目标分析物的分离检测。









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