花斑曲霉ZJUTE2及其在制备杂色曲霉毒素中的应用

有机化合物处理,合成应用技术花斑曲霉zjute2及其在制备杂色曲霉毒素中的应用(一)技术领域1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株冬虫夏草定殖真菌及其在制备杂色曲霉毒素中的应用，具体涉及一种花斑曲霉zjute2及其在微生物发酵法制备杂色曲霉毒素中的应用，有助于解决高纯度杂色曲霉标准物质制备这一行业难题。(二)背景技术：2.杂色曲霉毒素(sterigmatocystin，st)是由杂色曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、皱曲霉、赤曲霉、焦曲霉、爪曲霉、四脊曲霉、毛曲霉、寄生曲霉等曲霉属真菌产生的一种有毒次级代谢产物，分子式c18h12o6，相对分子质量324，熔点246℃，可溶于大多数非极性溶剂，不溶于水，难溶于极性溶剂。st具有双氢呋喃苯并呋喃骨架，与黄曲霉毒素b1非常相似，是黄曲霉毒素生物合成过程的中间体，其化学结构如式(i)所示：[0003][0004]与黄曲霉毒素类似，st同样具有肝、肾毒性，对实验动物均显示了强致癌性，可诱发肝癌和胃癌。st中毒，国内又称“黄肝病”或“黄染病”。st在自然界中分布非常广泛，易存在于饲草、小麦、花生、玉米等农产品，甚至在潮湿的房屋内也可检出st的污染。研究发现，我国各地粮食中st的污染非常普遍，尤以小麦最为明显，污染率可达100％(孙长武等.中国公共卫生,2005,21(12):1532)。st污染词料以及农产品后会直接或间接进入人类食物链，进而给人类生命健康带来巨大威胁。在肝癌高发区所食用的食物中，st污染较为严重，可导致人类食物中毒和产生毒性损伤效应。目前，世界各国及国际机构正密切关注st这一重要污染物，不断完善食品、中药中的真菌毒素限量和检测方法，并积极研究st的致毒机理和降解方法。[0005]无论是薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等st检测方法，还是针对st的药理学和毒理学研究，均需要用到高纯度st标准品或对照品作为原料。目前，包括st在内的多种真菌毒素标准品或对照品均依赖于进口，尚未实现国产化。由于st结构中存在复杂的多环体系和连续手性中心，化学合成法制备st存在较大难度，目前尚无文献报道。鉴于st可由多种真菌产生，从真菌中筛选st高产菌株，并开发经济、便捷的微生物发酵法制备st生产工艺对于解决st标准品或对照品制备这一行业难题具有较大意义。[0006]cn 112280693 a公开了一株分离自玉米的曲霉属真菌gw13及其在制备st中的应用。然而，该专利未报道st的产率，且其制备过程需用反复使用硅胶柱层析、凝胶柱层析及制备液相等手段，工艺相对繁琐，成本较高。(三)技术实现要素：[0007]本发明的目的是提供一株新菌株‑‑花斑曲霉(aspergillus versicolor)zjute2及其在制备杂色曲霉毒素中的应用，本发明针对现有技术存在的缺陷，另辟蹊径，以特殊生境真菌——冬虫夏草定殖真菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到菌株zjute2，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，以高产率获得高纯度st，解决了现有技术的缺陷。[0008]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：[0009]本发明提供一株冬虫夏草定殖真菌新菌株‑‑花斑曲霉(aspergillus versicolor)zjute2，是从冬虫夏草中分离获得，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为cctcc no:m2022064，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。[0010]本发明还提供了一种花斑曲霉zjute2在制备杂色曲霉毒素(st)中的应用，所述应用的方法为：(1)将花斑曲霉zjute2接种至大米固体培养基，在20-30℃条件下暗培养15-30天，获得大米发酵产物；所述大米固体培养基为大米和蒸馏水的混合物，其中蒸馏水用量以大米质量计为1-5ml/g(优选1.35ml/g)；(2)将大米发酵产物(优选捣碎)中加入有机溶剂，室温浸提，提取液浓缩至无液体流出，获得粗提物浸膏；(3)将步骤(2)粗提物浸膏用水悬浮，以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(4)将步骤(3)萃取物浸膏进行mci chp20p柱层析，以体积浓度30-100％甲醇-水为洗脱液，收集体积浓度90％的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(5)将步骤(4)所得浓缩物以体积比为5:1的石油醚-丙酮混合溶剂溶解，于室温重结晶，过滤，得晶体，即得到式(ⅰ)所示杂色曲霉毒素；[0011][0012]优选的，步骤(1)所述花斑曲霉zjute2接种至大米固体培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积浓度0.1-1％的接种量接种大米固体培养基，所述活化是指将花斑曲霉zjute2接种至马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用体积浓度2％无菌吐温80水溶液重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1×105-1×108个/ml，优选1×106个/ml；所述pda培养基组成为马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。[0013]优选的，步骤(1)中发酵培养条件为：28℃条件下暗培养20天。[0014]优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮；所述有机溶剂体积用量以大米固体培养基中大米干重计为2～8ml/g(优选5-6ml/g)；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3～5天。[0015]优选的，步骤(3)中所述水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5ml/g(优选3.1ml/g)；所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-2；萃取3-5次，每次萃取用的有机溶剂与水体积比优选1:1。[0016]优选的，步骤(4)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速10-20ml/min(优选15ml/min)；收集体积比90:10的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。[0017]优选的，步骤(5)石油醚-丙酮混合溶剂体积用量以浓缩物质量计为25-35ml/g(优选28-29ml/g)。[0018]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：[0019]本发明提供一种经多年实验筛选获得的保藏编号为cctcc m 2012064的冬虫夏草定殖真菌新菌株‑‑花斑曲霉zjute2，并首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度st的方法，使得st产率达到2.04g/kg大米，纯度达到99.41％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度st标准品或对照品长期依赖进口这一行业问题具有重要意义。(四)附图说明[0020]图1是aspergillus versicolor zjute2的菌落照片。[0021]图2是杂色曲霉毒素的1h-nmr谱图。[0022]图3是杂色曲霉毒素的13c-nmr谱图。[0023]图4是杂色曲霉的高效液相色谱图。(五)具体实施方式[0024]本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。[0025]本发明所述室温是指25-30℃。所述pda培养基组成为马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。[0026]实施例1、冬虫夏草定殖真菌‑‑杂色曲霉aspergillus versicolor zjute2的分离[0027](1)冬虫夏草的采集[0028]冬虫夏草于2019年5月采自西藏那曲，由浙江工业大学杨开教授鉴定为麦角菌科虫草属真菌cordyceps sinensis sacc.寄生于蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体复合物。样品(编号为cs-zjut-201905)保存于浙江工业大学天然药物研究所。[0029](2)菌株的分离[0030]用无菌水将冬虫夏草表面洗净，将洗净的植物样品浸入装有75％乙醇的容器中，2min后取出，并以无菌水冲洗5次，再浸入装有0.1％升汞水溶液的容器中，维持1min后取出，用大量无菌水冲洗除去残留升汞溶液。在无菌操作条件下，用无菌镊子和刀片将冬虫夏草切成长度2mm的组织段，接种于pda培养基上，于28℃暗培养。同时将表面消毒过的冬虫夏草不作切割，在pda培养基上反复滚动数次后，同条件培养作为对照。[0031]培养4天后，见组织段的断面边缘有菌丝长出后(对照无菌丝长出)，即挑取前端菌丝转入pda平板上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的pda培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，记为菌株zjute2。[0032]将菌株zjute2接入pda培养基斜面，28℃暗培养7天后(图1)，转至4℃冰箱内保存备用。如图1所示，培养起初，菌株zjute2的菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养7天，菌落即铺满整皿，菌落呈土灰色、干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。[0033]实施例2、菌株zjute2的分子生物学鉴定[0034](1)基因组dna的提取[0035]使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型，北京擎科生物科技有限公司)提取菌株zjute2基因组dna，具体步骤如下：[0036]1)将spin column置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12000rpm离心1min活化硅胶膜；[0037]2)挑取实施例1平板上菌株zjute2单克隆菌于1.5ml离心管内，加入400μl buffer gp1，涡旋振荡1min，65℃水浴20min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；[0038]3)加入150μl buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；[0039]4)12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；[0040]5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin column中，12000rpm/min离心30s，弃废液；[0041]6)向spin column中加入500μl buffer pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；[0042]7)向spin column中加入500μl wash buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；[0043]8)重复操作步骤7；[0044]9)将spin column放回collection tube中，12000rpm离心2min，开盖晾干1min；[0045]10)取出spin column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加75μl te buffer(65℃预热te buffer)，20℃放置2min，12,000rpm离心2min，获得基因组dna。[0046](2)its区序列的pcr扩增[0047]1)引物序列如下：[0048]its1:5’tccgtaggtgaacctgcgg 3’[0049]its4:5’tcctccgcttattgatatgc 3’[0050]2)pcr反应体系[0051]pcr体系(50μl)构成为：基因组dna模板(10p)1μl，primer 1(10p)2μl，primer 2(10p)2μl，1×tse101金牌mix 45μl。[0052]3)pcr程序设定为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸5min。[0053]4)pcr扩增产物电泳纯化与测序[0054]将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300v电压下12分钟。由pcr产物电泳结果切割所需dna目的条带，经dna凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。纯化产物由北京擎科生物科技有限公司采用sanger法测序，测得its碱基序列(seq id no.1)为：[0055]ccctttggaagtaaaaaatcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggctgcctccgggcgcccaacctcccacccgtgactacctaacactgttgcttcggcggggagccctctcgggggcgagccgccggggactactgaacttcatgcctgagagtgatgcagtctgagtctgaatataaaatcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgattagggccggccgggcgccagccgacgtctccaaccattttcttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcataaagcgggaaggaaat。[0056](3)数据处理[0057]序列数据在美国国立生物信息中心(national center for biotechnology information usa，ncbi)的genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与genbank中的序列比较，鉴定该菌株为花斑曲霉(aspergillus versicolor)，命名为花斑曲霉(aspergillus versicolor)zjute2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年1月13日，保藏编号为cctcc no:m2022064，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。[0058]实施例3、花斑曲霉zjute2发酵制备杂色曲霉毒素[0059]1、菌株活化[0060]取出保存于-80℃冰箱的aspergillus versicolor zjute2菌株冻存管，于4℃解冻后，在超净台内用无菌棉棒从冻存管蘸取适量孢子悬液，接种至pda培养基，于28℃恒温培养箱中静置培养7天，进行菌种活化。[0061]2、菌株发酵[0062]活化7天后，用10ml含有体积浓度2％吐温80的无菌水溶液将菌株孢子洗下，置于装有100ml含体积浓度2％吐温80的无菌水中，得到孢子悬液(孢子浓度为1×106个/ml)；分别移取1ml孢子悬液，接种至50个装有大米培养基(大米100g，蒸馏水135ml，于121℃高温灭菌20min后，冷却)的1l三角瓶中，于28℃恒温暗培养20天。[0063]3、杂色曲霉毒素的提取分离[0064]1)菌株发酵培养20天后，将50个三角瓶中的培养物混合并捣碎，加入95％乙醇20升，室温浸提4天，过滤，滤饼重复浸提3次(每次加入3升95％乙醇，每次4天)，合并提取液并减压浓缩至干，得粗提物浸膏475g。[0065]2)将步骤1)粗提物浸膏(475g)用1.5l蒸馏水悬浮，用乙酸乙酯萃取，每次1.5l，共萃取3次，合并乙酸乙酯相，并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏45g。[0066]3)将步骤2)乙酸乙酯萃取物浸膏45g溶解于100ml甲醇后进行mci chp20p柱层析(直径d＝4cm，高h＝60cm)，依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1.5l(2个柱体积)，流速15ml/min；收集甲醇/水＝90:10(v/v)的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得浓缩物13.8g。[0067]4)将步骤3)中的浓缩物13.8g加入400ml石油醚/丙酮＝5:1(v/v)混合溶剂，加热至50℃溶解，于室温进行重结晶，过滤，收集晶体，黄色固体，即得式(i)所示化合物10.2g，产率达到2.04g/kg大米。[0068]4、步骤3制备的黄色固体产物的结构鉴定[0069]杂色曲霉毒素：黄色固体。如图2、图3所示，其1h-nmr和13c-nmr数据如下：1h-nmr(600mhz,cdcl3)δh 13.21(1h,s,8-oh),7.50(1h,t,8.3,h-7),6.83(1h,d,1.2,h-5),6.82(1h,m,h-1’),6.75(1h,dd,8.3,0.9,h-6),6.50(1h,m,h-4’),6.43(1h,s,h-2),5.45(1h,t,2.6,h-3’),4.80(1h,dt,7.1,2.2,h-2’),3.99(3h,s,h-14)。13c-nmr(150mhz,cdcl3)δc 181.5(c-9),164.7(c-3),163.5(c-1),162.5(c-8),155.1(c-13),154.2(c-10),145.5(c-5),135.8(c-1′),113.4(c-6),111.4(c-7),109.1(c-4),106.7(c-11),106.1(c-12),106.0(c-4′),102.7(c-3′),90.7(c-2),56.9(1-och3),48.2(c-2′)。以上波谱数据与文献(zhang,s.s.；zhu,a.；bai,x.；zhu,h.j.；cao,f.alkaloids and polyketides from the marine-derived fungus aspergillus versicolor.chem.nat.compds.2020,56,964-967.)报道的杂色曲霉毒素一致。因此，步骤3制备的晶体即得式(i)所示杂色曲霉毒素。[0070]5、杂色曲霉毒素的纯度检测[0071]1)将上述步骤3制备所得的杂色曲霉毒素用乙腈溶解，定量稀释配制成浓度为30μg/ml的样品溶液。[0072]2)取样品溶液进行高校液相色谱分析，色谱条件如下。仪器：agilent 1200series；色谱柱：cosmosil 5c18-paq(4.6mm i.d.×250mm)；流动相：乙腈-水(40:60,v/v)；流速：1ml/min；检测波长：349nm；进样量：20μl；柱温：室温。检测记录色谱图。[0073]3)待测样品的高效液相色谱检测结果如图4所示。杂色曲霉毒素的保留时间为10.791min，峰面积分析其纯度达99.41％。[0074]以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。









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