一种疫苗佐剂及其制备

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种疫苗佐剂及其制备方法。背景技术：2.佐剂的最基础的作用是能够保护抗原并且对抗原有一定缓释作用，现有的疫苗佐剂多为铝盐佐剂和白油佐剂，存在注射后难降解、易引发炎症的问题。因此需要研发一种能够发挥佐剂作用的同时能够在体内降解且不对机体产生损害的新型佐剂。3.天然多糖来源广泛，生物相容性强、活性高。且安全无毒具有良好的生物兼容性。纳米粒的研究是近年来研究热点之一，利用纳米粒作为药物载体是目前医学上多种药物的重要研究方向。但多糖本身大多以链状存在，进入体内后极易被降解，而结构过于稳定的纳米粒不利于抗原的释放，因此可以通过将多糖制备成纳米粒的方式，减缓多糖的降解速度，同时对抗原起到缓释作用。因此以天然多糖为基础材料作为疫苗佐剂的开发具有一定优势。技术实现要素：4.本发明考虑以上问题，提供一种疫苗佐剂及其制备方法。5.为实现上述目的，本实验采用的技术方案为：6.一种疫苗佐剂，疫苗佐剂为天然多糖-季铵化壳聚糖以聚电解质复合形成的纳米粒，所述粒径为316.4nm、电位为31.1mv的纳米粒；所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。7.所述天然多糖为肝素；所述季铵化壳聚糖为分子量200kda的环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖。8.一种制备方法所得天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒的应用，所述天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒在制备具有免疫刺激作用的疫苗佐剂中的应用。9.一种包裹抗原的免疫刺激剂，疫苗佐剂为权利要求1所述天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒，多糖与抗原按质量比为0.5-2：1的比例混合。10.将带正电的季铵化壳聚糖与抗原混合均匀后，加入带负电的天然多糖，通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫刺激剂。11.所述正电荷季铵化壳聚糖及抗原在室温，以500r-700r磁力搅拌5-10min,而后加入负电荷多糖后持续搅拌至20-40min，通过静电吸附作用制备包裹抗原的纳米粒，过滤后得到刺激剂，4℃保存。12.进一步的说，利用所述壳聚糖衍生物纳米粒，通过对小鼠免疫实验结果测定，表明纳米粒能够较好的提高抗原的免疫刺激性，能够更好的促进小鼠分泌免疫球蛋白igg以及il-17免疫因子。从而表明纳米粒具有作为免疫刺激性的疫苗佐剂的潜力且能够发挥较好的免疫佐剂作用。13.本发明所具有的优点：14.1.本发明疫苗佐剂使用带有负电荷的天然多糖和带有正电荷的壳聚糖衍生物，在不引入交联剂的条件下进行纳米粒的制备，去除了交联剂的毒副作用，保证其在生物体内的安全。15.2.利用本发明免疫佐剂负载抗原，用于小鼠免疫实验结果测定，表明本发明免疫佐剂能够较好的负载抗原并提高抗原的免疫刺激性，促进小鼠分泌免疫球蛋白igg以及il-17免疫因子。在制备高效且无副反应免疫佐剂方面具有良好应用价值。附图说明16.图1为本发明实施例1中获得的壳聚糖季铵盐衍生物的红外图谱。17.图2为本发明实施例2中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的电位(a)和粒径(b)表征图；(a)为电位图，(b)为粒径图。18.图3为本发明实施例2中获得的带负电荷的天然多糖-壳聚糖衍生物纳米粒的扫描电镜图。19.图4为本发明实施例3获得的小鼠免疫后分泌免疫球蛋白igg以及免疫因子il-17图；(a)为igg1，(b)为igg2，(c)为il-17。具体实施方式20.下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。21.本发明以带负电荷的天然多糖和带正电荷的季铵化多糖为原料基础，进行免疫佐剂的制备并测定其对小鼠免疫水平的影响，最终制得具有疫苗佐剂作用的带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒。22.具体方法如下：将带有负电荷的天然多糖和带有正电荷的分子量为200kda季铵化壳聚糖通过聚电解质复合法进行负载抗原的纳米粒的制备，通过纳米粒度分析仪测定，筛选出粒径和电位均一且稳定的负载抗原的纳米粒，再经过动物实验，测定纳米粒对小鼠注射后的免疫效果，确定具有免疫活性的纳米粒，由以上原料和条件下所制备的纳米粒，无毒副作用，且能够发挥较好免疫和载体双重效果。为近年来天然多糖作为疫苗免疫佐剂的研究提供一定的方法和指导。23.实施例1季铵化壳聚糖的制备24.取5g分子量在200kda左右的壳聚糖和10g 2、3-环氧丙基三甲基氯化铵。并向其中加入70ml蒸馏水，80℃水浴、转速为200r/min条件下进行搅拌，反应时间为24h。将得到的反应液在透析袋中使用蒸馏水透析72h，后在冻干机中-80℃条件下冻干，得到季铵化壳聚糖样品。所得壳聚糖季铵盐采用红外光谱进行表征，结果如图1。由图1可见，红外谱图在1478cm-1处出现新的吸收峰，表明季铵盐壳聚糖成功合成。且所合成季铵盐壳聚糖分子量为200kda左右。25.实施例2带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒的制备26.试剂：使用双蒸馏水为溶剂，无菌条件下依次配置，1.0mg/ml的壳聚糖季铵盐溶液a，1.5mg/ml的带负电荷的天然多糖溶液b以及2.0mg/ml标准抗原ova溶液m；27.取a溶液5ml在25毫升烧杯中，置于磁力搅拌器中转速为300r/min。搅拌开始向其中滴加2ml抗原m溶液，搅拌10min后向其中再滴加b溶液。继续以该搅拌速率搅拌30min。过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存，获得负载抗原的纳米粒(参见图2和3)，其理化性质表征如表1所示；测定该纳米粒的粒径为：316.4nm、电位31.1mv。28.由电位和粒径结果可知，为保证纳米粒稳定性以及在细胞和后续动物体内发挥更好载体和释放作用，得到粒径在316.4nm及电位在31.1mv，分散度为0.171的纳米粒。29.表1带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒的理化性质：30.样品分散度pdi电位(mv)粒径(nm)肝素-季铵化壳聚糖0.17131.1316.431.实施例3带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒对免疫水平的影响，以上述所制备纳米粒，肝素-季铵化壳聚糖(hs-hacc-ova)以及pbs(control)，阴性对照，ova(阳性对照)，进行检测。32.1)带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒对小鼠体内分泌免疫球蛋白igg水平的影响。33.免疫球蛋白igg在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。也是机体中最重要的抗体成分，其中igg1和igg2均是最主要的组成部分。两者含量的高低很大程度上能够说明体液免疫与细胞免疫水平的高低。34.实验中使用索莱宝elisa试剂盒对小鼠免疫后血清中的igg1和igg2含量进行测定，测定步骤按照试剂盒说明，具体方法如下：35.igg1含量测定：36.1.实验前20min,拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，洗板2次并甩干。37.2.加入100μl标准品及检测样本至反应孔中,同时每孔加入50μl酶标抗体工作液，封板后室温(25±2℃)过夜反应15h，400rpm振荡。38.3.拍板、洗板4次后，加入100μl显色底物至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)避光显色5-20min。39.4.加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量od值(5分钟内)40.igg2含量测定：41.1.实验前30min,拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，洗板3次并甩干。42.2.加入100μl标准品及检测样本至反应孔中,封板后室温(25±2℃)振荡孵育120min。43.3.拍板、洗板4次后，加入100μl生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)振荡孵育60min。44.4.拍板、洗板4次后，加入100μl酶结合物工作液至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)振荡孵育30min。45.5.拍板、洗板5次后，加入100μl显色底物至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)避光显色5-20min46.6.加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量od值(5分钟内)。47.测定结果igg1(图4a)和igg2(图4b)如柱状图中所示，相比较单独使用抗原以及空白对照组纳米粒能够促进小鼠更高水平的分泌免疫球蛋白igg1和igg2。48.2)带负电荷的天然多糖-季铵化壳聚糖纳米粒对小鼠免疫因子il-17分泌的影响。49.il-17因子是由cd4+t细胞分泌，具有促进炎症趋化因子、急性期蛋白、中性粒细胞聚集的作用，从而在机体免疫和自身免疫性疾病中发挥作用。il-17在细胞中激活notch信号通路，能参与细胞增殖以及调节细胞炎性细胞因子表达。同样使用elisa法对小鼠免疫后血清中il-17含量进行测定，测定步骤按照试剂盒操作说明具体方法如下：50.1.实验前30min,拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，洗板3次并甩干。51.2.加入100μl标准品及检测样本至反应孔中,封板后室温(25±2℃)振荡孵育120min。52.3.拍板、洗板4次后，加入100μl生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)振荡孵育60min。53.4.拍板、洗板4次后，加入100μl酶结合物工作液至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)振荡孵育30min。54.5.拍板、洗板5次后，加入100μl显色底物至反应孔中，封板后于室温(25±2℃)避光显色5-20min55.6.加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量od值(5分钟内)。56.测定结果如图4c中柱状图中所示，相比较单独使用抗原以及空白对照组纳米粒能够促进小鼠更高水平的分泌免疫因子il-17。57.综上可知，天然肝素能够作为负电荷多糖与正电荷物质进行纳米粒的制备，所制备出来的纳米粒粒径316.4nm、电位31.1mv，比较稳定，在进行动物免疫后，相比较单独使用抗原ova以及对照组能够更好的促进小鼠分泌免疫球蛋白igg以及免疫因子il-17。表明其具有作为疫苗佐剂的潜力，为目前疫苗佐剂存在的在体内难降解造成炎症等问题提供可借鉴思路。









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