包载两种药物的聚合物纳米胶束及其制备方法和用途

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于生物医药领域，具体涉及包载两种药物的聚合物纳米胶束及其制备方法和用途。背景技术：2.癌症仍是全世界广泛关注的公共卫生问题，在美国癌症已成为第二位死因，预计在接下来几年将超过心血管疾病成为首位死因。其中乳腺癌是20-59岁女性癌症死亡的首要原因，2015年乳腺癌的新发病例将占据所有新发癌症病例29％。化学药物治疗作为乳腺癌治疗的常规手段，可以降低肿瘤复发转移风险，提高患者的总生存率，是乳腺癌综合治疗中不可或缺的一部分。然而大部分化疗药物属于细胞毒类药物，杀伤肿瘤细胞的同时也会对机体正常组织造成损伤，引起不同程度的毒副反应。同时一些有效的化疗药物水溶性差，体内代谢速度快，需增加给药频率或加大给药剂量以维持有效的血药浓度，促使化疗药物有效剂量高又潜在地加大药物对正常组织的损害。因此如何解决疗效与毒副作用之间的矛盾是当前肿瘤化疗中的一个科学难题，换言之如何提高药物在肿瘤部位的分布和减少药物在正常组织中的分布是解决这个难题的关键。为了解决上述问题，各式各样的药物传递系统应运而生，如聚合物-药物共聚物、脂质体、胶束、纳米凝胶、微球和纳米球，旨在提高肿瘤组织中的药物浓度和减少药物暴露在正常宿主组织，从而提高治疗效果和降低药物毒性。3.近年来生物可降解的聚合物纳米胶束作为纳米药物传递系统研究中的重要组成部分，在解决肿瘤化疗这些关键性科学问题中显现出了巨大的潜能，为研究创新药物提供了新的思路，受到了高度关注。而且已有大量研究证明聚合物纳米胶束的靶向药物传输技术能够提高化疗药物在肿瘤部位的分布，显著提高药物抗肿瘤效果。聚合物纳米胶束通常是由两亲性嵌段共聚物自组装形成的核/壳结构。疏水段形成胶束内核用于包载疏水性药物，而亲水性外壳一般由聚乙二醇(peg)组成，旨在增加水溶性、延长血液循环时间、减少蛋白质吸附及单核吞噬系统的识别。此外，聚合物纳米胶束最重要的一个优势就是对肿瘤组织的被动靶向作用。而这个被动靶向的发挥是依赖于实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，epr)。不同于正常组织中的血管，肿瘤新生血管相邻内皮细胞的间隙达到200-1200nm，而且肿瘤组织的淋巴循环障碍，这就从而使我们的纳米胶束可以从血管中溢出，并且长时间的蓄积在肿瘤组织中。4.然而由于肿瘤细胞的异质性，绝大部分肿瘤在可耐受的剂量下很难被单一化疗药物所治愈。联合应用不同的药物，既可以使每种药物发挥在人体允许的范围内达到的最大细胞杀伤作用，也能对有异质性的肿瘤细胞具有更广泛的作用，还能防止或减慢耐药性的产生。因此，目前大多数肿瘤的标准治疗方案中都包括两种或多种抗肿瘤药。但药物之间的物理化学特性不尽相同，如溶解度的不同，应用时通常需要使用多种溶剂或药物载体，使药物无法同时到达肿瘤组织中。因此亟需一个多功能药物传递系统可以运载不同的理化性质的化疗药物，使药物同时到达肿瘤组织联合发挥抗肿瘤作用。尽管近几年多种载药体系如胶束，脂质，以及无机纳米粒子等，已被设计运载多种药物，但运载具有不同溶解特性的化疗药物仍不易实现，且由于药物的不同特性，胶束的设计和制备往往较为繁琐和复杂，更增加了研究的难度。5.因此，研究能够共递送两种及以上药物的载药纳米胶束，协同增强抗肿瘤药物的抗肿瘤能力，具有重要意义。技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种包载两种药物的聚合物纳米胶束。将水溶性的阿霉素和疏水性的姜黄素同时包载在聚合物纳米胶束中，使阿霉素和姜黄素可同时到达肿瘤组织，联合发挥抗肿瘤作用。7.本发明提供了一种包载两种药物的聚合物纳米胶束，其特征在于，它由下列原料制备而成：mpeg-pcl、阿霉素和姜黄素；所述mpeg-pcl的数均分子量为3000～5000。8.进一步地，上述聚合物纳米胶束由阿霉素、姜黄素和mpeg-pcl按照(0.5～1.5):(1～2):(50～70)的质量比投料制备而成；优选地，阿霉素、姜黄素和mpeg-pcl质量比为1:1.5:60。9.更进一步地，上述mpeg-pcl的数均分子量为4000。10.本发明还提供了包载两种药物的聚合物纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：11.(1)称取姜黄素和mpeg-pcl，溶解于有机溶剂中，蒸发除去有机溶剂，加水溶解，即得cur-m胶束溶液；12.(2)向步骤(1)得到的cur-m胶束溶液中加入pbs溶液得混合溶液，搅拌的同时向混合溶液中滴加盐酸阿霉素的水溶液，滴毕，搅拌，即得。13.进一步地，步骤(1)所述有机溶剂为醇，优选为乙醇；和/或所述cur-m胶束溶液中姜黄素浓度为1～2mg/ml，mpeg-pcl浓度为50～70mg/ml；优选地，所述cur-m胶束溶液中姜黄素浓度为1.5mg/ml，mpeg-pcl浓度为60mg/ml。14.进一步地，步骤(1)所述蒸发为在60℃真空条件下，以100rpm/min的转速旋转蒸发；和/或所述搅拌时间为0.5～1.5h，优选为1h。15.进一步地，步骤(2)所述pbs溶液的ph为7.4；所述盐酸阿霉素水溶液的浓度为3～7mg/ml，优选为5mg/ml；和/或所述pbs溶液cur-m胶束溶液和盐酸阿霉素水溶液的体积比为1:(5～10):(1～5)，优选为1:7:2。16.进一步地，步骤(2)所述滴加盐酸阿霉素的水溶液为在1分钟内滴加完毕。17.本发明还提供了上述包载两种药物的聚合物纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的用途。18.进一步地，上述抗肿瘤药物是促进肿瘤细胞凋亡，和/或抑制肿瘤细胞增殖，和/或抑制肿瘤细胞血管生成的药物。19.实验结果表明，本发明包载两种药物的聚合物纳米胶束无毒、粒径小、稳定、包封率高，药物释放行为可控，相比于包载单种药物的胶束，对4t1乳腺癌细胞的毒性和促凋亡作用明显增强，能够有效抑制肿瘤生长和转移，抑制肿瘤血管生成。本发明使用生物可降解的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl)聚合物纳米胶束同时包载阿霉素和姜黄素，制备过程简易，并且制备过程中未使用没有任何表面活性剂或添加剂，确保了在临床应用中的安全性，具有优异的临床应用前景。20.本发明所述mpeg-pcl是指甲氧基聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物。21.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明23.图1为dox-cur-m胶束的制备示意图。24.图2为dox-cur-m胶束的粒度分布图。25.图3为dox-cur-m胶束的透射电镜照片。26.图4为空白mpeg-pcl(a)、dox-m(b)、cur-m(c)及dox-cur-m(d)胶束溶液的样品示意图。27.图5为姜黄素(a)和阿霉素(b)的标准曲线。28.图6为姜黄素从cur-m和dox-cur-m胶束在ph 7.4的pbs溶液(a)或含有10％fbs的pbs溶液(c)的释放；阿霉素从dox-m和dox-cur-m胶束在ph 7.4的pbs溶液(b)或含有10％fbs的pbs溶液(d)的释放。29.图7为dox-cur-m胶束对体外4t1乳腺癌细胞的细胞毒性。(a)不同浓度梯度的cur-m、dox-m及dox-cur-m胶束样品作用4t1乳腺癌细胞48小时后的细胞存活率。(b)不同浓度梯度的空白mpeg-pcl胶束作用于4t1乳腺癌细胞和l929小鼠成纤维细胞48小时后的细胞存活率。30.图8为dox-cur-m胶束对体外4t1乳腺癌细胞的凋亡作用。荧光显微镜下生理盐水(ns)(a)、空白mpeg-pcl胶束(b)、cur-m(c)、dox-m(d)及dox-cur-m(e)胶束各个治疗组hoechst33258核染色图片及各治疗组的平均凋亡指数(f)。标尺＝100μm。31.图9为体外4t1乳腺癌细胞对阿霉素的摄取。游离阿霉素组、游离阿霉素和姜黄素组、dox-m组、dox-m和游离姜黄素组及dox-cur-m组作用4t1乳腺癌细胞2小时(a)和4小时(b)，通过流式细胞仪定量分析各治疗组肿瘤细胞2小时(c)和4小时(d)含阿霉素的阳性细胞比例及2小时(e)和4小时(f)阿霉素的平均荧光强度。32.图10为荧光显微镜下4t1乳腺癌细胞对阿霉素摄取的图片。空白mpeg-pcl胶束、dox-m及dox-cur-m胶束作用肿瘤细胞2小时和4小时后，核通过hoechst33258染色发出蓝色荧光，肿瘤细胞摄取各治疗组的阿霉素定位于核中发出红色荧光。标尺＝100μm。33.图11为4t1乳腺癌皮下模型中生理盐水(对照)、空白mpeg-pcl胶束、cur-m、dox-m和dox-cur-m的抗肿瘤作用。(a)第30天各治疗组肿瘤的图片(标尺＝1cm)；(b)各治疗组的肿瘤生长曲线；(c)各治疗组皮下瘤的重量。34.图12为4t1乳腺癌自发肺转移模型中生理盐水(对照)、空白mpeg-pcl胶束、cur-m、dox-m和dox-cur-m的抑制肿瘤转移作用。(a)各治疗组自发肺转移的图片(标尺＝2cm)；(b)各治疗组肺脏的肿瘤转移结节数目；(c)各治疗组肺脏的重量。35.图13为生理盐水(a)、空白mpeg-pcl胶束(b)、cur-m(c)、dox-m(d)和dox-cur-m组(e)肿瘤组织tunel染色的免疫荧光图片(标尺＝100μm)；(f)各治疗组的凋亡指数(apoptotic index)。36.图14为生理盐水(a)、空白mpeg-pcl胶束(b)、cur-m(c)、dox-m(d)和dox-cur-m组(e)肿瘤组织ki-67染色的免疫组化图片(标尺＝100μm)；(f)各治疗组的ki-67阳性率(ki-67 li)。37.图15为生理盐水(a)、空白mpeg-pcl胶束(b)、cur-m(c)、dox-m(d)和dox-cur-m组(e)肿瘤组织cd31染色的免疫荧光图片(标尺＝100μm)；(f)各治疗组的微血管密度(mvd)。具体实施方式38.1、所用原料与设备39.mpeg-pcl(mn＝4000)，由四川大学国家重点生物治疗实验室合成提供；40.盐酸阿霉素，浙江海正药业公司，中国；41.姜黄素，sigma公司，美国；42.色谱纯甲醇，fisher公司，美国；43.色谱纯乙腈，fisher公司，美国；44.乙醇，分析纯，成都市科龙化工试剂厂，中国；45.tween-80，分析纯，成都市科龙化工试剂厂，中国；46.dmso，分析纯，成都市科龙化工试剂厂，中国；47.微孔滤膜，0.22um，merck millipore，德国；48.透析袋，md34mm 3500k，美国。49.旋转蒸发仪，r-201成都市新蜀西科实验设备有限公司，中国；50.循环水式多用真空泵，shb-3，成都市新蜀西科实验设备有限公司，中国；51.恒温水浴锅，w201d，成都市新蜀西科实验设备有限公司，中国；52.透射电镜，日立h-600iv型，日本；53.粒度/zeta电位测定仪，nano2s malvern，英国；54.waters alliance 2695高效液相色谱分析仪，美国；55.台式离心机，tdl-50c，上海安亭科学仪器厂，中国。56.4t1小鼠乳腺癌细胞和l929小鼠成纤维细胞来自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)，由四川大学国家重点生物治疗实验室保存。57.dmem培养基和rpmi 1640培养基，gibco公司，美国；58.胎牛血清，gibco公司，美国；59.mtt试剂(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)，sigma公司，美国；60.hoechst33258染料，sigma公司，美国。61.酶标仪mutiscan mk3，赛默飞世尔仪器有限公司；62.荧光显微镜mutiscan mk3，德国leica公司；63.流式细胞仪facs calibur型，美国becton dickinson公司。64.balb/c小鼠(spf级别，雌性，6-8周，体重18g左右)，由四川大学华西实验动物中心提供。65.细胞凋亡试剂盒(deadendtm tunel荧光法检测系统)，promega公司，美国；66.兔抗鼠ki-67抗体，gene tech公司，美国；67.生物素标记羊抗鼠免疫球蛋白，bd biosciences pharmingen公司，美国；68.cd31抗体，bd pharmingen tm公司，美国；69.fitc标记的第二抗体，abcam公司，美国。70.实施例1、本发明同时包载两种药物的聚合物纳米胶束的制备71.同时包载阿霉素和姜黄素的mpeg-pcl聚合物纳米胶束(dox-cur-m)通过两步获得。72.步骤1：通过固体分散方法制备包载姜黄素的mpeg-pcl胶束(cur-m)：称取姜黄素和mpeg-pcl聚合物，加入5ml乙醇中完全溶解。然后使用旋转蒸发仪，在60℃，转速100rpm/min及负压条件下，旋转蒸发10分钟除去乙醇，形成透明薄膜后加入蒸馏水置于水浴锅中60℃水化，得到cur-m胶束溶液，溶液中姜黄素浓度为1.5mg/ml，mpeg-pcl聚合物浓度为60mg/ml73.步骤2：通过ph诱导的自组装法将阿霉素包载到cur-m胶束中。首先将0.1ml的pbs(10×，ph 7.4)加入到0.7ml的cur-m胶束溶液中，然后在温和地搅拌下将0.2ml的5mg/ml的盐酸阿霉素水溶液逐滴加入上述溶液中，在1分钟内将阿霉素滴加完毕后继续搅拌一小时，一小时后，便可得到载双药的mpeg-pcl聚合物纳米胶束(dox-cur-m)(图1)。得到dox-cur-m胶束溶液后13000rpm离心10分钟除去游离姜黄素，然后通过带有截流分子量为3kda的透析膜的离心管20000rpm离心5分钟，分离未包载的阿霉素。74.对比例1、包载单药阿霉素的mpeg-pcl聚合物纳米胶束(dox-m)的制备75.包载单药阿霉素的mpeg-pcl聚合物纳米胶束的制备(dox-m)参照实施例1的步骤2，同样通过ph诱导的自组装法获得，将上述的cur-m胶束溶液置换成空白mpeg-pcl聚合物胶束溶液(60mg/ml)。得到胶束后通过带有截流分子量为3kda的透析膜的离心管20000rpm离心5分钟，分离未包载的阿霉素。76.对比例2、包载单药姜黄素的mpeg-pcl聚合物纳米胶束(cur-m)的制备77.包载单药姜黄素的mpeg-pcl聚合物纳米胶束(cur-m)的制备参照实施例1的步骤1，得到cur-m胶束溶液后13000rpm离心10分钟除去游离姜黄素。78.以下通过实验例证明本发明聚合物纳米胶束的有益效果。79.实验例1、本发明dox-cur-m胶束的理化性质表征80.1、实验方法81.1.1dox-cur-m胶束粒径的测定82.以下所有进行试验的dox-cur-m胶束均为实施例1制备的dox-cur-m胶束。83.dox-cur-m胶束的水合粒径和分布是通过动态光散射(dls)，使用激光散射粒度仪(nano-zs，malvern instrument，uk)测量；样品的测试温度为25℃，重复测试3次，取平均值。84.1.2透射电镜观察实dox-cur-m胶束形态85.dox-cur-m胶束的形态使用透射电镜(tem)进行观察。观察前，将一滴稀释的施例1的dox-cur-m胶束滴到铜网上，然后使用磷钨酸溶液进行负染，干燥后置于电镜下进行观察其形态。86.1.3dox-cur-m胶束的稳定性考察87.dox-cur-m胶束溶液制备后分别存放于4℃或25℃观察其稳定性。若溶液均匀、透亮说明胶束溶液稳定，若出现沉淀，说明其不稳定。88.2、结果89.应用动态光散射研究dox-cur-m胶束的粒径分布如图2所示，结果显示dox-cur-m胶束的平均粒径为25.3±0.2nm，且dox-cur-m胶束的粒度分布是单分散的(pdi＝0.065±0.011)。90.通过透射电镜表征dox-cur-m胶束的形态，如图3所示，dox-cur-m胶束颗粒大小均匀，平均粒度约为25nm。因此通过透射电镜观察到dox-cur-m胶束的粒径大小与动态光散射所研究得到的结果大致相同。91.制备得到的空白mpeg-pcl、dox-m、cur-m及dox-cur-m胶束溶液如图4所示，澄清透亮且均匀。将dox-cur-m胶束溶液分别放置4℃或25℃观察其稳定性，结果发现dox-cur-m胶束溶液放置25℃时可稳定20天左右，放置4℃时可稳定1月以上未有沉淀的生成。92.以上结果说明，本发明同时包载姜黄素和阿霉素的聚合物纳米胶束dox-cur-m粒径小、分散性好且稳定，有利于细胞摄取和长时间储存。93.实验例2、hplc分析方法的建立和包封率、载药量测定94.1、实验方法95.1.1色谱条件96.waters alliance 2695高效液相色谱仪，色谱柱inertsil/wondasil c18(4.6x250mm，5um)，柱温30℃，进样量20μl，流速：1.0ml/min，检测姜黄素的流动相为乙腈：1％的醋酸溶液(60/40，v/v)，检测波长420nm；检测阿霉素的流动相为甲醇：乙腈：1％的醋酸溶液(40/10/50，v/v)，检测波长252nm。97.1.2姜黄素和阿霉素的标准曲线98.使用电子秤精密称取10mg的姜黄素置于100ml的容量瓶，加入100ml甲醇溶解得储备液。通过稀释得到不同浓度0.1、0.4、0.8、0.8、1、4、8、10、40、80μg/ml的姜黄素甲醇标准溶液。将上述浓度的标准溶液按3.1的色谱条件进样分析，测定姜黄素的峰面积，以峰面积(a)和浓度(c)进行线性回归，得到姜黄素含量测定用的标准曲线。采用同样的方法绘制阿霉素的标准曲线方程。99.1.3包封率和载药量的测定100.参照上述方法制备实施例1的dox-cur-m胶束母液(药物浓度为1mg/ml)，使用甲醇稀释后的溶液按照3.1的色谱条件进行测定。载药量(dl)和包封率(ee)分别用如下公式计算:：[0101][0102][0103]2、结果[0104]按照上述色谱条件，测得了不同浓度姜黄素和阿霉素溶液的峰面积。通过对峰面积(a)和浓度(c)进行线性回归，分别得出了姜黄素和阿霉素的回归方程：acur＝127593c–40969(r＝0.9995)；adox＝47010c+7851.3(r＝0.9996)说明姜黄素在0.1-80μg/ml、阿霉素在0.1-40μg/ml范围内具有良好的线性关系。姜黄素和阿霉素的标准曲线如图5所示。[0105]标准曲线得出后，使用hplc对dox-cur-m胶束中姜黄素和阿霉素的药物含量进行定量分析，结果显示dox-cur-m胶束中姜黄素包封率为99.32±0.47％，载药量为4.97±0.02％；阿霉素包封率为96.77±0.30％，载药量为4.85±0.01％。[0106]以上结果说明，本发明同时包载姜黄素和阿霉素的聚合物纳米胶束dox-cur-m载药量和包封率都很高。[0107]实验例3、本发明dox-cur-m胶束的体外释放研究[0108]1、实验方法[0109]首先，分别将1ml的cur-m(对比例2)、dox-m(对比例1)及dox-cur-m胶束(实施例1)加入到截流分子量为3.5kda的透析袋中，然后将透析袋放入10ml的释放介质中。释放介质有两种，分别是含0.5wt％tween80或含10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)的ph 7.4pbs溶液。透析袋放入上述释放介质时，释放介质需预热到37℃。释放实验在恒温震荡箱中进行，温度为37℃，振荡速度为100rpm/min。分别于1，2，4，8，24，48，72，120，168小时取样1ml并贮存在-20℃，然后将剩余释放介质倒掉重新加入预热到37℃新鲜的释放介质。每种胶束在不同释放介质的释放实验做五个平行。释放实验结束后使用hplc测定样品中姜黄素和阿霉素的浓度。[0110]2、实验结果[0111]如图6所示。图6的a和c表明姜黄素从dox-cur-m胶束中的释放，不管在中性pbs中还是在含有10％fbs的pbs中，相比从cur-m胶束中的释放都要相对缓慢。分析原因可能与姜黄素和阿霉素要竞争性地从dox-cur-m胶束中释放有关。第7天时，姜黄素从cur-m胶束在无血清和有血清的释放介质中的释放率分别大约36％和78％，而从dox-cur-m胶束在无血清和有血清的释放介质中的释放率分别大约为17％和50％。[0112]图6的b和d可以看出，和姜黄素相比阿霉素从dox-m和dox-cur-m胶束中的释放呈现两个阶段：第一阶段为相对快速的突释，这可能由于包裹在胶束核心的阿霉素其亲水段的配糖类和胶束的亲水段发生反应促进阿霉素的释放；第二阶段为相对缓慢的持续释放，未和胶束亲水段发生反应的阿霉素与姜黄素竞争性地从dox-cur-m胶束释放。阿霉素从dox-cur-m胶束在无血清和有血清的释放介质中的累积释放率分别为49.71±3.33％和50.62±0.72％，而dox-m胶束中阿霉素在这两种释放介质中的累积释放率分别为57.43±3.36％和70.43±0.87％。[0113]上述结果表明，本发明同时包载姜黄素和阿霉素的聚合物纳米胶束dox-cur-m能够实现阿霉素、姜黄素的有效缓释，缓释效果优于单载阿霉素的聚合物纳米胶束dox-m和单载姜黄素的聚合物纳米胶束cur-m。[0114]实验例4、本发明dox-cur-m胶束的体外抗肿瘤研究[0115]4.1dox-cur-m胶束对体外肿瘤细胞的细胞毒性研究[0116]1、实验方法[0117]通过mtt方法研究dox-cur-m胶束对4t1乳腺癌细胞的细胞毒性作用。首先将4t1乳腺癌细胞接种到96孔板中，其中每孔100μl约3000个细胞，放入37℃培养24小时。然后在每孔加入100μl不同浓度梯度的空白mpeg-pcl胶束、cur-m(对比例2)、dox-m(对比例1)及dox-cur-m胶束(实施例1)样品，在37℃下培养48小时。其中dox-cur-m和dox-m中阿霉素的浓度是相同的，同样dox-cur-m和cur-m中姜黄素的浓度相同。最后通过mtt法测定细胞的存活率。实验重复六次，取平均值。[0118]空白mpeg-pcl胶束对4t1乳腺癌细胞和l929小鼠成纤维细胞的细胞毒性同样是通过上述mtt方法测定。[0119]2、结果[0120]采用mtt法评估同时包载阿霉素和姜黄素的聚合物纳米胶束与包载单药的姜黄素或阿霉素的聚合物纳米胶束相比，对4t1乳腺癌细胞的细胞毒性是否增强。从图7a中可以看出，dox-cur-m的半数致死浓度(ic50)明显低于dox-m，其中dox-m和dox-cur-m的ic50分别是0.94和0.34μg/ml。然而cur-m的ic50为9.7μg/ml，当2.5μg/ml的cur-m作用于4t1乳腺癌细胞时细胞活性仍非常高。[0121]同样通过mtt法评估空白mpeg-pcl胶束对4t1乳腺癌细胞和l929小鼠成纤维细胞的细胞毒性。如图7b所示，当空白mpeg-pcl胶束的终浓度为1000μg/ml时，4t1乳腺癌细胞和l929小鼠成纤维细胞的仍然有着相当高的存活率。[0122]上述结果表明，mpeg-pcl胶束具有良好的生物相容性，基本无毒性，是一种安全的药物载体。本发明dox-cur-m胶束相比于单载药的聚合物纳米胶束cur-m和dox-m对肿瘤细胞的细胞毒性明显增强。[0123]4.2dox-cur-m胶束对体外肿瘤细胞的凋亡作用评价[0124]1、实验方法[0125]通过hoechst33258核染色观察细胞形态来评价dox-cur-m胶束(实施例1)对4t1乳腺癌细胞的凋亡作用。首先将无菌的盖玻片置入6孔板中，再将4t1乳腺癌细胞接种到6孔板中，其中每孔1ml约5×104个细胞，放入在37℃培养过夜。第二天每孔加入生理盐水(ns)、空白mpeg-pcl胶束、cur-m、dox-m及dox-cur-m胶束样品培养48小时。取出细胞爬片，迅速置入70％冷乙醇固定，pbs冲洗，使用hoechst33258染色，将盖玻片固定在载玻片上，使用荧光显微镜观察细胞形态。采用双盲法在每个治疗组随机选出5个等大视野，计算出每个视野的凋亡细胞数目和总细胞数目。凋亡指数(apoptotic index)(％)＝凋亡细胞数目/总细胞数目×100％，根据公式计算得出每个组的平均凋亡指数。[0126]2、结果[0127]采用hoechst33258核染色评估同时包载姜黄素和阿霉素的聚合物纳米胶束对4t1乳腺癌细胞的凋亡作用。细胞凋亡时细胞核碎裂和染色体凝聚，因此在荧光显微镜下凋亡细胞相比正常细胞蓝色荧光非常强烈。图8展示了生理盐水(ns)、空白mpeg-pcl胶束、cur-m、dox-m及dox-cur-m胶束作用于4t1乳腺癌细胞48小时后的细胞图片。从图8中发现dox-cur-m组与dox-m组相比，凋亡细胞明显增多。而空白mpeg-pcl胶束和cur-m组肿瘤细胞发出均匀的荧光，几乎很少有核的碎裂。如图8f展示的，dox-cur-m胶束组的凋亡指数最高，为38.30±2.26％，高于dox-m(14.13±0.28％，p《0.001，anova)、cur-m(3.86±0.34％，p《0.001，anova)、空白mpeg-pcl胶束(1.86±0.10，p《0.001，anova)及生理盐水组(2.14±0.17％，p《0.001，anova)。而且凋亡指数在生理盐水、空白mpeg-pcl胶束及cur-m组之间没有统计学差异。[0128]上述结果说明本发明dox-cur-m聚合物纳米胶束对体外4t1肿瘤细胞的凋亡作用相比于单载药聚合物纳米胶束dox-m和cur-m明显增强。[0129]4.3体外肿瘤细胞对阿霉素的摄取研究[0130]1、实验方法[0131]使用流式细胞仪定量分析不同阿霉素样品溶液中肿瘤细胞对阿霉素的摄取。首先将处于对数期生长的4t1乳腺癌细胞接种到在6孔板中，其中每孔1ml约2×105个细胞，放入37℃培养24小时。吸出孔中培养基丢弃，然后每孔加入不含血清的空白mpeg-pcl胶束、游离阿霉素、游离阿霉素和姜黄素、dox-m(对比例1)、dox-m(对比例1)和游离姜黄素及dox-cur-m(实施例1)胶束样品溶液。其中上述溶液中姜黄素和阿霉素的浓度均为500ng/ml。2小时和4小时后，收集细胞，立即用pbs洗涤2次，然后通过流式细胞仪(coulter elite esp，coulter，hialeah，fl)每个样品定量收集1×104个细胞，检测细胞中阿霉素的红色荧光。激发波长为488nm，发射波长在564nm与606nm之间。[0132]dox-m及dox-cur-m胶束作用于肿瘤细胞时，使用荧光显微镜观察肿瘤细胞对阿霉素的摄取。首先将无菌的盖玻片置入6孔板中，再将4t1乳腺癌细胞接种到6孔板中，其中每孔1ml约2×105个细胞，放入在37℃培养24小时。然后每孔加入不含血清的空白mpeg-pcl胶束、dox-m及dox-cur-m胶束样品培养。2小时和4小时过后，取出细胞爬片，迅速置入70％冷乙醇固定，pbs冲洗，使用hoechst33258染色，将盖玻片固定在载玻片上，使用荧光显微镜观察细胞。[0133]2、结果[0134]通过流式细胞仪分析，图9展示了不同阿霉素溶液作用于肿瘤细胞时，肿瘤细胞对阿霉素的摄取水平。从图9a、c、e中可以发现，游离阿霉素作用于肿瘤细胞2小时后，肿瘤细胞对阿霉素的摄取很少，甚至没有。然而在其他4组中的肿瘤细胞出现了不同程度的阿霉素的积累。而且不管在含阿霉素阳性细胞比例上还是在阿霉素的平均荧光强度上dox-cur-m组(62.63±5.17％，51.57±0.90)都高于dox-m和游离姜黄素组(49.44±8.40％，48.73±0.90，p《0.05，anova)、dox-m组(17.32±3.44％，44.66±0.77，p《0.001，anova)、游离阿霉素和姜黄素组(3.46±0.47％，41.73±0.31，p《0.001，anova)及游离阿霉素组(0.21±0.06％，41.26±0.19，p《0.001，anova)。如图9b、d、f所示，每个治疗组作用肿瘤细胞4小时后，肿瘤细胞对阿霉素的摄取相比2小时得到不同程度的增加。然而dox-cur-m组与游离阿霉素组、游离阿霉素和姜黄素组及dox-m组相比，肿瘤细胞对阿霉素的摄取是最多的。因为不管是含阿霉素的阳性细胞比例还是阿霉素的平均荧光强度，dox-cur-m组相比上述三组都是最高的(p《0.001，anova)。培养4小时后虽然dox-cur-m组的含阿霉素阳性细胞比例和阿霉素的平均荧光强度都高于dox-m和游离姜黄素组，但两组之间没有统一学差异(p》0.05，anova)。[0135]图10展示了空白mpeg-pcl胶束、dox-m及dox-cur-m胶束作用4t1乳腺癌细胞2小时和4小时后，在荧光显微镜下上述治疗组肿瘤细胞的图片。细胞核通过hoechst33258染料发出蓝色荧光，在图10中发现阿霉素发出的红色荧光同样定位于核中。空白mpeg-pcl胶束作用于2小时和4小时后，未见肿瘤细胞发出红色荧光。当dox-m胶束作用肿瘤细胞2小时后，肿瘤细胞中阿霉素发出的红色荧光微弱，而dox-cur-m胶束组的肿瘤细胞发出的红色荧光迅速增强。治疗组作用肿瘤细胞4小时后，肿瘤细胞中的阿霉素不断积累，发出的红色荧光也逐渐增强。dox-cur-m胶束组与dox-m胶束相比，肿瘤细胞发出的红色荧光仍然较强。[0136]上述结果说明，本发明dox-cur-m胶束中的姜黄素能够促进肿瘤细胞对阿霉素的摄取。[0137]以上所有实验数据，经spss17.0统计软件处理，采用单因素方差分析(anova)，治疗组之间的两两比较用snk-q检验。检验水准定为0.05，p《0.05认为差异有统计学意义。所得的数据用均数±标准差表示。[0138]试验例5、本发明dox-cur-m胶束的体内抗肿瘤研究[0139]5.1dox-cur-m胶束的体内抗肿瘤作用研究[0140]1、实验方法[0141]建立皮下4t1乳腺癌模型研究实施例1的dox-cur-m胶束的体内抗肿瘤作用。第0天，在每只6-8周雌性balb/c小鼠右侧背部皮下接种0.1ml的4t1乳腺癌细胞悬液(约含5×105个细胞)。第4天在注射点附近可扪及肿瘤，然后将这些荷瘤小鼠分成如下5组(每组5只)：生理盐水组(control)，空白mpeg-pcl胶束组、对比例2的cur-m胶束组(姜黄素的剂量为1mg/kg)、对比例1的dox-m胶束组(阿霉素的剂量为1mg/kg)及实施例1的dox-cur-m胶束组(姜黄素和阿霉素的剂量均为1mg/kg)。在第4，第7和第10天，通过尾静脉注射给药，共三次。注射药物后每天观察肿瘤的大小，每三天使用游标卡尺测量并记录肿瘤纵横直径大小(单位：mm)。每次测量皮下瘤的最长(length)和最短(width)直径，根据以下公式并计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝0.52×length(mm)×width(mm)×width(mm)。第30天,对照组的小鼠开始死亡。通过断颈处死其它小鼠，并立即取下小鼠的肿瘤称重。由于4t1乳腺癌细胞在balb/c小鼠体内易通过血管转移至肺部并形成转移瘤，因此收集每个治疗组小鼠肺脏，称重，并且两名观察员通过双盲法记录每个肺脏上的转移结节。[0142]2、结果[0143]为了比较dox-cur-m胶束组与dox-m、cur-m及空白mpeg-pcl胶束组之间的体内抗肿瘤作用，我们建立4t乳腺癌皮下模型。如图11a和b所示，dox-cur-m胶束组抑制肿瘤生长作用强于dox-m和cur-m胶束组(p《0.05和p《0.001，anova)。然而空白mpeg-pcl胶束组和生理盐水组相比没有抗肿瘤作用(p》0.05，anova)。图11c展示了每个治疗组的肿瘤重量，可以看出dox-cur-m胶束组的肿瘤重量(0.51±0.22g)远远低于dox-m(1.27±0.67g，p《0.05，anova)，cur-m(2.67±1.10g，p《0.001，anova)，空白mpeg-pcl胶束组(4.39±0.93g，p《0.001，anova)，和生理盐水组(4.09±0.80g，p《0.001，anova)。[0144]从上述结果可以得出，dox-cur-m胶束有着强大的抑制肿瘤生长的作用，效果优于单载药聚合物纳米胶束cur-m和dox-m。[0145]由于4t1乳腺癌细胞在balb/c小鼠体内易通过血管转移至肺部并形成转移瘤，因此我们研究dox-cur-m胶束组是否对4t乳腺癌自发的肺转移有抑制效应。如图12a和b所示，dox-cur-m胶束组肺脏的肿瘤转移结节数目(6.0±3.2)明显低于dox-m(15.2±4.5，p《0.05，anova)、cur-m(26.4±6.2，p《0.001，anova)、空白mpeg-pcl胶束组(49.4±20.8，p《0.001，anova)和生理盐水组(46.2±12.8，p《0.001，anova)。从图12c中可以看出，dox-cur-m胶束组与其余四组相比，肺脏的重量是最轻的。[0146]从上述结果可以得出，dox-cur-m胶束有着强大的抑制肿瘤转移的作用，效果优于单载药的聚合物纳米胶束cur-m和dox-m[0147]5.2评估dox-cur-m胶束对体内肿瘤细胞的凋亡作用[0148]1、实验方法[0149]4t1乳腺癌皮下瘤收集后固定在4％多聚甲醛中，再将肿瘤组织包埋在石蜡中。将组织切片后按照原位细胞死亡检测试剂盒上的步骤进行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色(tunel)。染色完成后在荧光显微镜高倍镜(200×)下，2名观察员采用双盲法在每个治疗组随机选取5个等大的视野，观察并记录每个视野的凋亡细胞和总细胞数目。凋亡指数(apoptotic index)(％)＝凋亡细胞数目/总细胞数目×100％，根据公式计算得出每个组的平均凋亡指数。[0150]2、结果[0151]通过tunel免疫荧光染色，探讨dox-cur-m胶束是否对体内4t1肿瘤细胞有促进凋亡的作用。图13中细胞核染为绿色的细胞，预示着凋亡。因此从图13中发现相同的视野下dox-cur-m胶束组发生凋亡的细胞明显多于对比例1的dox-m，对比例2的cur-m，空白mpeg-pcl胶束及生理盐水组。图13f展示了各个治疗组的凋亡指数(apoptotic index)，其中dox-cur-m胶束组的凋亡指数(21.86±2.42％)大于dox-m(11.06±2.05％，p《0.001，anova)、cur-m(5.86±1.28％，p《0.001，anova)、空白mpeg-pcl胶束(3.18±0.97％，p《0.001，anova)及生理盐水组(2.38±0.99％，p《0.001，anova)。[0152]以上结果可以说明dox-cur-m胶束有着强大的促进肿瘤细胞凋亡的作用，且效果优于单载药的聚合物纳米胶束cur-m和dox-m。[0153]5.3评估dox-cur-m胶束对体内肿瘤细胞增殖的影响[0154]1、实验方法[0155]采用ki-67染色评估实施例1的dox-cur-m胶束对体内肿瘤组细胞增殖的影响。首先将肿瘤组织包埋在石蜡中，再将肿瘤组织切成5μm厚度以备ki-67染色。染色完成后于高倍镜(200×)下，2名观察员采用双盲法随机观察每个治疗组5个视野，记录ki-67阳性表达的细胞和总细胞数目。ki-67阳性率(ki-67 li)(％)＝ki-67阳性细胞数/细胞总数×100％，根据公式计算得出每个治疗组的平均ki-67阳性率。[0156]2、结果[0157]通过ki-67免疫组化染色，研究dox-cur-m胶束是否对4t1肿瘤细胞有抑制增殖的作用。图14中细胞核为棕色的细胞为ki-67阳性细胞，从图中可以发现在治疗组中dox-cur-m胶束组的ki-67阳性细胞是最少的。从图14f中可以得知，dox-cur-m胶束组ki-67的阳性率(ki-67 li)只有18.6±6.5％，明显低于对比例1的dox-m(40.4±6.7％，p《0.001，anova)、对比例2的cur-m(58.6±9.8％，p《0.001，anova)、空白mpeg-pcl胶束(70.4±11.32％，p《0.001，anova)及生理盐水组(76.2±8.0％，p《0.001，anova)。[0158]以上结果说明dox-cur-m胶束有着强大的抑制肿瘤细胞增殖的作用，且效果优于单载药的聚合物纳米胶束cur-m和dox-m。[0159]5.4评估dox-cur-m胶束对体内肿瘤组织血管生成的影响[0160]1、实验方法[0161]为了评估dox-cur-m胶束对肿瘤组织中血管生成的影响，因此对肿瘤组织中的新生血管进行染色。将每个治疗组的肿瘤组织制成冰冻切片，丙酮固定，cd31单抗孵育，然后pbs冲洗，fitc标记的第二抗体孵育，染色完成后置于荧光显微镜下观察。微血管密度(microvessel density，mvd)为每个等大视野下的微血管数目，因此于高倍镜(200×)下2名观察员采用双盲法随机观察每个治疗组5个视野并记录微血管数目，计算每个治疗组的平均微血管密度。[0162]2、结果[0163]大量的研究已表明肿瘤的生长和转移需要新生血管的生成。通过对新生血管进行cd31免疫荧光染色，研究dox-cur-m胶束是否通过抗血管生成来抑制肿瘤生长。图15中新生血管为红色荧光，可以发现dox-cur-m胶束组肿瘤组织的红色荧光是最弱的。图15f也反映出实施例1的dox-cur-m胶束组的mvd(17.4±6.1)明显小于对比例1的dox-m(54.2±8.5，p《0.001，anova)、对比例2的cur-m(43.2±4.9，p《0.001，anova)、空白mpeg-pcl胶束(62.2±6.8，p《0.001，anova)及生理盐水组(63.6±7.6，p《0.001，anova)。[0164]以上结果说明dox-cur-m胶束有着强大的抑制血管生成的作用，效果优于单载药的聚合物纳米胶束cur-m和dox-m。。[0165]以上所有实验数据，经spss17.0统计软件处理，采用单因素方差分析(anova)，治疗组之间的两两比较用snk-q检验。检验水准定为0.05，p《0.05认为差异有统计学意义。所得的数据用均数±标准差表示。[0166]综上，本发明提供了一种包载阿霉素、姜黄素两种药物的聚合物纳米胶束，该胶束无毒、粒径小、稳定、包封率高，药物释放行为可控，相比于包载单种药物的胶束，对4t1乳腺癌细胞的毒性和促凋亡作用明显增强，能够有效抑制肿瘤生长和转移，抑制肿瘤血管生成。本发明使用生物可降解的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl)聚合物纳米胶束同时包载阿霉素和姜黄素，制备过程简易，并且制备过程中未使用没有任何表面活性剂或添加剂，确保了在临床应用中的安全性，具有优异的临床应用前景。









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