改造的1,3-丙二醇生产菌株及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及改造的1,3-丙二醇生产菌株及其应用。背景技术：2.1,3-丙二醇是一种重要的化学品，主要用作原料与对苯二甲酸合成聚对苯二甲酸丙二醇酯。该聚合物具有高弹性，易染色等优良的性能，是一种高档纺织材料。生物法生产1,3-丙二醇已经有多年的研究和技术开发。克雷伯氏菌属细菌(genus klebsiella)、弗氏柠檬酸(citrobacter freundii)、丁酸梭菌(clostridium butyricu)和罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)等自然界微生物可以利用甘油为原料生产1,3-丙二醇。但是未发现自然界微生物能利用葡萄糖等糖质原料生产1,3-丙二醇。通过人工构建代谢途径，大肠杆菌(escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamate)等微生物可以利用葡萄糖等碳源生产1,3-丙二醇。3.甘油转化成1,3-丙二醇的代谢反应包括两步，甘油脱水形成3-羟基丙醛，3-羟基丙醛还原形成1,3-丙二醇。在人工构建的利用葡萄糖原料生产1,3-丙二醇的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖通过多步反应合成甘油，后续甘油形成3-羟基丙醛最终反应形成1,3-丙二醇。3-羟基丙醛具有毒害作用，在1,3-丙二醇生产过程中高浓度的3-羟基丙醛会抑制生产菌株的活性，对发酵过程产生严重影响。4.在弗氏柠檬酸、沙门氏杆菌(salmonella)、蓝细菌(cyanobacteria)等多种细菌中具有一种细胞器，称为微室(microcompartment)或代谢体(metabo losome)。微室是由多种结构蛋白和催化蛋白组成的一个蛋白质细胞器，外形为二十面体或不规则多面体，大小在100-200nm左右。微室将其内部与细胞质分割开，使得微室内部的催化反应处于特殊的环境中。在蓝细菌中的微室负责细胞的二氧化碳固定。在弗氏柠檬酸、鼠伤寒沙门氏杆菌等细菌中有一种微室负责1,2-丙二醇的代谢称为pdu微室。已经鉴定的pdu微室的编码基因包括pdua、pdub、pduc、pdud、pdue、pdug、pduh、pduj、pduk、pdul、pdum、pdun、pduo、pdup、pduq、pdus、pdut、pduu、pduv、pduw、pdux等。其中pdua、pdub、pduj、pduk、pdum、pdun、pdut、pduu、pduv等是结构蛋白。pdu微室中1,2-丙二醇通过脱水反应形成丙醛，丙醛还原形成丙醇，或氧化形成丙酰coa，进而进入细胞质形成丙酸。技术实现要素：5.本发明的目的是，提供改造的1,3-丙二醇生产菌株及其应用。6.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：7.提供一种改造的1,3-丙二醇生产菌株，是指通过人工操作提高菌株细胞中的pdu微室含量，获得1,3-丙二醇生产性能提高的工程菌。8.作为优选实施方案，所述改造菌株的出发菌为具有1,3-丙二醇生产能力的野生菌株或经过基因改造后用于1,3-丙二醇生产的工程菌。9.作为优选实施方案，1,3-丙二醇生产菌株包括：克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸菌、丁酸梭菌和罗氏乳杆菌等具有1,3-丙二醇生产能力的野生菌株和以这些菌株为出发菌株经基因改造后的菌株；包括人工构建的具有1,3-丙二醇生产能力的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等工程菌株。10.作为优选实施方案，提高菌株细胞中的pdu微室含量的方法采用以下其中至少其一的方式：11.(1)通过分子生物学操作将pdu微室编码基因连接到表达质粒，将表达质粒转入1,3-丙二醇生产菌株；12.(2)通过分子操作将pdu微室编码基因重组到1,3-丙二醇生产菌株染色体；13.(3)通过将1,3-丙二醇生产菌株染色体上pdu微室编码基因的启动子替换成高水平启动子；14.(4)通过高水平表达pdu微室编码基因的调控基因pocr。15.所述pdu微室是细菌中代谢1,2-丙二醇的微室。16.pdu微室的编码基因包括pdua、pdub、pduc、pdud、pdue、pdug、pduh、pduj、pduk、pdul、pdum、pdun、pduo、pdup、pduq、pdus、pdut、pduu、pduv、pduw、pdux等，其中pdua、pdub、pduj、pduk、pdum、pdun、pdut、pduu、pduv等是结构蛋白。17.在沙门氏菌(salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium str.lt2)的基因组(nc_003197.2)中pdu微室编码基因pdua-pdux位于2116843-2133611碱基之间(序列如seq id no.1所示)，各基因转录方向一致，顺序排列。该基因组中pdu微室调控蛋白pocr位于2114396-2115307碱基之间(序列如seq id no.2所示)，与pdua-pdux转录方向相反。18.在变栖克雷伯氏菌342(klebsiella variicola 342)的基因组(nc_011283.1)中pdu微室编码基因pdua-pdux位于906824-923600碱基之间，(序列如seq id no.3所示)。该基因组中pdu微室调控蛋白pocr位于925138-926049碱基之间(序列如seq id no.4所示)。19.在弗氏柠檬酸菌(citrobacter freundii str.ballerup 7851)的基因组(nz_cacd01000056.1)中pdu微室编码基因pdua-pdux位于5309-22069碱基之间(序列如seq id no.5所示)。该基因组中pdu微室调控蛋白pocr位于2861-3772碱基之间(序列如seq id no.6所示)。20.沙门氏菌lt2、变栖克雷伯氏菌342和弗氏柠檬酸菌7851的pdu微室编码基因序列同源性很高，都含有21个基因。21.本发明还提供了所述改造的1,3-丙二醇生产菌株在生产1,3-丙二醇中的应用以及生产1,3-丙二醇的方法。生产1,3-丙二醇的方法为：将改造的1,3-丙二醇生产菌株接种到含有碳源的培养基中进行发酵培养，菌体将培养基中的碳源转化成1,3-丙二醇。22.作为优选实施方案，所述培养基以甘油或葡萄糖为主要碳源。23.相对于现有技术，本发明的有益效果为：24.本发明通过提升1,3-丙二醇生产菌株中pdu微室的水平，使得菌株在利用甘油或葡萄糖等碳源生产1,3-丙二醇的过程中，在细胞中产生的3-羟基丙醛能快速转化成1,3-丙二醇，降低了3-羟基丙醛对细胞的毒害作用，增加了甘油到1,3-丙二醇的反应速率，并提升了甘油到1,3-丙二醇的转化率。利用本发明改造的菌株生产1,3-丙二醇，使1,3-丙二醇发酵过程总体工艺控制简单，生产强度增大，原料转化率提高。25.具体实施方法26.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。27.以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。各种分子生物学操作为通用操作方法。28.实施例1：提高弗氏柠檬酸菌pdu微室的水平29.弗氏柠檬酸菌为实验室保藏野生菌株，简称为cf，根据弗氏柠檬酸菌(citrobacter freundii str.ballerup 7851)的基因组信息，设计引物，克隆弗氏柠檬酸菌pdua-pdux基因序列，连接于psari(genbank mh037013)质粒形成psari-pdu质粒，将psari-pdu质粒转回cf，得到cf-pdu。具体操作如下：30.1)表达质粒的线性化。以psari-s：atcagtactcctagggtaccagctg(seq id no.7所示)和psari-a：caccttcatggtggtcagtgc(seq id no.8所示)为特异性引物，以psari质粒为模板，得到线性化的psari载体。31.2)扩增过表达的目的基因。以弗氏柠檬酸野生菌基因组为模板，以pdu-s：ggatcgccatcagatctgatatgcaacaagaagcgttaggaat(seq id no.9所示)和pdu-a：ggtaccctaggagtactgatttattgcagttcgaccccgc(seq id no.10所示)为特异性引物进行pcr扩增，得到目的基因片段pdua-pdux。32.3)目的基因与线性化载体连接。根据clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段pdua-pdux与线性psari载体连接成环。将重组产物化转入dh5α感受态细胞中，通过kanr抗性的平板筛选阳性克隆psari-pdu质粒。33.4)过表达菌株的构建。在构建完成psari-pdu质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从dh5α中提取并电转入弗氏柠檬酸菌感受态细胞中，得到cf-pdu。34.将cf和cf-pdu进行摇瓶发酵生产1,3-丙二醇。菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基。摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。35.发酵培养基配方为：硫酸铵4g/l；磷酸氢二钾0.69g/l；磷酸二氢钾0.25g/l；硫酸镁0.2g/l；酵母粉1.5g/l；甘油30g/l；微量元素1.0ml/l；铁溶液1.0ml/l。36.微量元素为：硫酸锰100mg/l；氯化锌70mg/l；钼酸钠35mg/l；硼酸60mg/l；氯化钴200mg/l；硫酸铜29.28mg/l；氯化镍25mg/l；浓盐酸(37％)0.9ml/l。37.铁溶液为：1升水中加入硫酸亚铁5.0g，37％的浓盐酸4ml。38.在培养12小时时取样，按照文献(journal ofbacteriology 2012：194,1912–1918)方法提取细胞微室，将样品进行sds电泳。电泳结果cf菌株样品有模糊的多条蛋白条带；cf-pdu菌株样品有明显的多条蛋白条带。表明cf-pdu菌株pdu微室的表达水平获得提高。39.在培养24小时后，对发酵液中组分的测定采用液相色谱法测定。液相色谱法测定，利用hpx-87h色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测，流动相0.025mol/l硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱65℃。菌株发酵结果如表1所示。40.表1，弗氏柠檬酸菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果41.菌株甘油(g/l)乙酸(g/l)1,3-丙二醇(g/l)cf231.71.2cf-pdu182.13.642.由表1可以看出提高弗氏柠檬酸菌pdu微室水平后，工程菌株与野生型菌株相比，甘油消耗速率增加，1,3-丙二醇浓度提升，同时甘油转化为1,3-丙二醇的转化率提高。43.实施例2：提高克雷伯氏菌pdu微室的水平44.克雷伯氏菌cgmcc 1.6366菌株(该菌株也称为tuac01，ac01)，已经在文献(world journal of microbiology biotechnology 2008,24:1731-1740)中公开，简称为kp，以该菌株为出发菌株失活乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的菌株简称为kp-δldha-δadhe参照(biotechnol lett 2016，38:975–982)构建。45.根据变栖克雷伯氏菌342的基因组信息，设计引物构建dna片段，将细胞中2,3-丁二醇操纵子的启动子重组到染色体上pdua基因上游，获得kp-pdu1菌株。操作步骤如下：46.1)扩增pdua基因上下游两端长同源臂基因序列、2,3-丁二醇操纵子的启动子序列以及抗性片段基因序列。以pdua-q600-s：cccggggatcctctagagatccgacgtcagatagacggca(seq id no.11所示)、pdua-q600-a：ctccagcctacaggataagataaaattgtcgtttatttatttaa(seq id no.12所示)和pdu-h600-s：gaggaagtggtatatgcaacaagaagcactaggaatg(seq id no.13所示)、pdu-h600-a：catgcctgcaggtcgacgatcagtgttggtggctttcaccg(seq id no.14所示)为特异性引物，以克雷伯氏肺炎杆菌cgmcc 1.6366基因组为模板，经pcr扩增分别得到两端长同源臂各600bp的dna序列。以pdua-frt-s：tcttatcctgtaggctggagctgcttcg(seq id no.15所示)、pdua-frt-a：aaggaattccggggatccgtcga(seq id no.16所示)为特异性引物，以pij773质粒(商业产品)为模板进行pcr扩增，得到两端含frt位点中间带aprr抗性的aac(3)iv基因片段。以pbud-s：acggatccccggaattccttggcggcctgggtg(seq id no.17所示)、pbud-a：gttgcatataccacttcctcgttcaacaaatat(seq id no.18所示)为特异性引物，以克雷伯氏肺炎杆菌cgmcc 1.6366基因组为模板，经pcr扩增得到2,3-丁二醇操纵子上启动子序列。以pmd18-t-s：atcgtcgacctgcaggca(seq id no.19所示)和pmd18-t-a：atctctagaggatccccgggt(seq id no.20所示)为特异性引物，以质粒pmd-18t simple(商业产品)为模板进行pcr扩增，得到线性化的pmd18-t基因片段。47.2)基因片段的重组连接使用的是clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒中的操作方法。将步骤1中扩增的基因片段进行重组连接，并在50℃的温度下反应15分钟后立即置于冰上冷却。之后化转入dh5α感受态细胞中，并用安普霉素抗性平板进行筛选。48.3)提取步骤2中的阳性克隆dh5α-t-aac(3)iv中的质粒pmd18t-aac(3)iv，以pdua-q600-s、pdua-h600-a为模板扩增出两端带有600bp同源臂、中间带有frt序列的抗性盒片段以及2,3-丁二醇操纵子启动子的片段a1，并将该片段a1电转入带有质粒pdk6-red的克雷伯氏肺炎杆菌cgmcc 1.6366感受态细胞。涂布于带aprr抗性的平板上，待其长出菌落后，用pdua-q600-s和pdua-h600-a为引物进行pcr扩增，筛选出的阳性克隆中即为2,3-丁二醇操纵子的启动子重组替换到染色体上pdua基因上游，得到kp-pdu1菌株。49.根据变栖克雷伯氏菌342的基因组信息，设计引物克隆pocr基因，连接到表达质粒pdk6质粒，形成pdk6-pocr，将该质粒转入kp-δldha-δadhe获得kp-pdu2菌株，具体操作如下：50.1)表达质粒的线性化。以pdk6-s：aagcttggctgttttggcg(seq id no.21所示)和pdk6-a：gaattctgtttcctgtgtgaaattg(seq id no.22所示)为特异性引物，以pdk6质粒(商业产品)为模板，得到线性化的pdk6载体。51.2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌cgmcc 1.6366的基因组为模板，以pocr-s：tcacacaggaaacagaattcatgatttctgcgagcacactga(seq id no.23所示)和pocr-a：ccgccaaaacagccaagcttttaaactgactcagtttgtgatctgg(seq id no.24所示)为特异性引物进行pcr扩增，得到目的基因片段pocr。52.3)目的基因与线性化载体连接。根据clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段pocr与线性pdk6载体连接成环。将重组产物化转入dh5α感受态细胞中，通过kan r抗性的平板进行筛选阳性克隆。53.4)过表达菌株的构建。在构建完成pdk6-pocr质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从dh5α中提取并电转入克雷伯氏肺炎杆菌kp-δldha-δadhe感受态细胞中，得到kp-pdu2菌株。54.将这些菌株进行5l发酵罐发酵实验。55.将kp和kp-pdu1菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml的lb培养基，摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行种子培养。56.种子培养12小时，接种到5l发酵罐中，内装3l发酵培养基，发酵培养基中甘油浓度为50g/l，其他组分与实施例1所用发酵培养基相同。保持发酵过程通风量2l/分钟，搅拌转速200转/分钟，发酵温度37℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的ph值稳定在7.0，发酵9小时取样，15小时结束。采用实施例1方法测定发酵液中组分。利用色氨酸显示反应测定发酵液中3-羟基丙醛含量。57.9小时样品按照文献(journal of bacteriology 2012：194,1912–1918)方法提取细胞微室，将样品进行sds电泳。电泳结果kp菌株样品有模糊的多条蛋白条带；kp-pdu1菌株样品有明显的多条蛋白条带。表明kp-pdu1菌株中pdu微室表达水平获得提高。58.各菌株发酵结果如表2所示。59.表2，克雷伯氏菌属改造菌株发酵罐发酵结果160.菌株甘油(g/l)1,3-丙二醇(g/l)3-羟基丙醛(mmol/l)kp(9h)287.114kp-pdu1(9h)288.32kp(15h)258.74kp-pdu1(14h)019061.从表2的数据结果可以看出：野生菌在发酵过程中产生了14mmol/l的3-羟基丙醛，并抑制了菌体活性，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.35g/g，发酵15小时，形成8.7g/l的1,3-丙二醇。而kp-pdu1菌株在发酵过程中发酵液中的3-羟基丙醛含量低，菌株生长未受到抑制，发酵14小时可以消耗全部甘油，形成19g/l的1,3-丙二醇。甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.38g/g，提升pdu微室水平后，菌株性能得到明显提升。62.将kp-δldha-δadhe和kp-pdu2菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml的lb培养基，摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行种子培养。63.种子培养12小时，接种到5l发酵罐中，内装3l发酵培养基，发酵培养基组分与实施例1所用发酵培养基相同。保持发酵过程通风量2l/分钟，搅拌转速200转/分钟，发酵温度37℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的ph值稳定在7.0。发酵过程中检测发酵液中各物质浓度。biotechnology.2003；14:454-9.)构建的一株能利用葡萄糖生产1,3-丙二醇的工程菌株，其中表达了来源于酿酒酵母的磷酸二羟基丙酮脱氢酶和3-磷酸甘油磷酸化酶，来源于克雷伯氏菌的甘油脱水酶和甘油脱水酶活化蛋白，来源于大肠杆菌的非特异性二元醇脱氢酶。ec菌株本身基因组不具有pdu微室编码基因。80.将实施例1构建的psari-pdu质粒转入ec形成ec-pdu。将ec和ec-pdu进行摇瓶发酵。菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基。摇瓶柜转速150转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。81.发酵培养基为：硫酸铵4g/l；磷酸氢二钾0.69g/l；磷酸二氢钾0.25g/l；硫酸镁0.2g/l；酵母粉1.5g/l；葡萄糖50g/l；微量元素1.0ml/l；铁溶液1.0ml/l，维生素b12 2 mg/l。发酵24小时测定发酵液中成分，结果见表582.表5，大肠杆菌及改造菌株生产1,3-丙二醇83.菌株葡萄糖(g/l)1,3-丙二醇(g/l)转化率(g/g)ec2090.3ec-pdu10130.32584.从表4的数据结果可以看出：在大肠杆菌中提升pdu微室的水平后，改造后的菌株在发酵培养中1,3-丙二醇的终浓度和原料转化率都得到提升。85.上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!