异牡荆素的制备方法及应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及天然提取物技术领域，具体涉及异牡荆素的制备方法及应用。背景技术：2.天胡荽(hydrocotyle sibthorpioides lam.)是伞形科天胡荽属植物，作为我国民间常用药物，历史悠久。天胡荽药名最早出现于唐代《急备千金要方》卷二十六，孙思邈在书中云：“一种小草，生近水渠温湿处，冬生，其状类胡荽，亦名鸡肠菜，可以疗痔病，一名天胡荽。”该属植物具有清热解毒、利尿消肿、祛湿退黄等功效，主要用于治疗黄疸、痢疾、水肿、淋症、目翳、喉肿、痈肿疮毒、带状疱疹、跌打损伤、各种癣症等。异牡荆素是天胡荽含有的一种重要药用成分之一。目前，制备异牡荆素的原料有绿豆(专利文献cn106008483a)，广金钱草(专利文献cn105085498b)和檀香叶(专利文献cn109232548b)等。目前，很少有从天胡荽中提取异牡荆素的文献公开。3.异牡荆素是一种黄酮类化合物，黄酮类化合物是植物的次生代谢产物，文献报道，该类化合物具有舒张血管、抗癌、抗血小板和抗心律失常等一系列作用。从结构上来看，异牡荆素属于碳苷黄酮类活性物质，广泛存在于自然界几十种植物的根、茎、叶、树皮、果实和种子中。现有的相关数据显示，异牡荆素具有多种药理学活，包括降血糖、抗菌、调节记忆、抑制α-葡萄糖苷酶、降血压和抗氧化等作用。异牡荆素在肝病治疗药物中的应用，也取得了一些进展。vonglorkham sayyaphone、乔倩、庞小红等，发表于《广西医科大学学报》(2020年2期)的文章“基于pi3k/akt信号通路研究异牡荆素对小鼠肝星状细胞的凋亡诱导作用及其机制”，指出了异牡荆素能够抑制活化hsc-t6细胞增殖。乔倩、雅凤、庞小红等，发表于《广西医科大学学报》(2020年3期)的文章“异牡荆素对硫代乙酰胺诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制”，研究了异牡荆素对急性肝损伤的保护作用及机制。目前，尚未发现体异牡荆素应用于临床治疗酒精性脂肪肝的报告。技术实现要素：4.本发明的第一个目的为提供一种异牡荆素的制备方法，包括以下步骤：5.1)先将天胡荽用乙醇溶液加热回流提取，过滤回收乙醇，得到乙醇粗提物；将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩后干燥，得到乙酸乙酯萃取物；6.2)将乙酸乙酯萃取物溶于甲醇中，微孔滤膜过滤，滤液浓缩，得到的粉末再用甲醇重结晶，所得馏分上硅胶柱，梯度洗脱，薄层色谱收集相同组分的洗脱液，得到9个馏分，第5馏分再上硅胶柱，梯度洗脱，薄层色谱收集相同组分的洗脱液，得到5个子馏分，第4子馏分再用甲醇重新结晶，即可得到产品；7.其中，两次梯度洗脱的流动相均为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比变化为100:0-0:100；第一次薄层色谱的展开剂为氯仿、醋酸乙酯和甲酸的混合物；第二次薄层色谱的展开剂为二氯甲烷、甲醇和水的混合物。8.在至少一个实施例中，所用回流提取的体积浓度为70％-80％，回流提取的次数为3次；更优的，乙醇水溶液的体积浓度为75％。9.在至少一个实施例中，所述石油醚、氯仿、乙酸乙酯的用量分别优选为乙醇粗提物体积的1/4-1/2、2/3-4/3、3/2-5/3，各萃取2-4次。10.在至少一个实施例中，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm，以0.45μm为优选。11.在至少一个实施例中，第一次薄层色谱中，氯仿、醋酸乙酯和甲酸的体积比为5:4:1；第二次薄层色谱中，二氯甲烷、甲醇和水的体积比为36:6:1。12.在至少一个实施例中，第一次梯度洗脱中，硅胶柱的规格为200-300目、10×300cm，氯仿和甲醇的用量均为500ml；第二次梯度洗脱中，硅胶柱的规格为200-300目、3×80cm，氯仿和甲醇的用量均为200ml。13.本发明的第二个目的为提供异牡荆素在制备防治酒精性脂肪肝的药物中的应用。14.具体地，所述药物在防治酒精性脂肪肝过程中的表现为：15.a、减轻肝脏病理学改变；16.b、减轻氧化应激水平；17.c、减轻肝脏炎症反应。18.具体地，所述药物为包含有异牡荆素及药学上可接受的辅料的药物。所述药物的剂型包括颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射剂，但也不局限于这些剂型。19.本发明的有益效果为：20.1、开发了以天胡荽为原料制备、精提异牡荆素的新工艺，所得异牡荆素纯度达91％左右，收率为54％左右，纯度高，收率佳；21.2、验证了异牡荆素在酒精性脂肪肝治疗的作用，并进一步明确了作用机制，开发了新的化学结构明确的治疗酒精性脂肪肝药物。附图说明22.图1、油红o染色观察小鼠肝组织学变化(x200)。23.图中：a为正常对照组，b为模型组，c为水飞蓟宾组，d为异牡荆素高剂量组；其中，与正常对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，#p《0.05。具体实施方式24.下面结合附图对本发明进行说明，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。25.在具体实施方式中，首先涉及天胡荽黄酮苷类单体异牡荆素的制备方法，其步骤如下：26.1)先将天胡荽用乙醇溶液加热回流提取，过滤回收乙醇，得到乙醇粗提物；将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩后干燥，得到乙酸乙酯萃取物；27.2)将乙酸乙酯萃取物溶于甲醇中，微孔滤膜过滤，滤液浓缩，得到的粉末再用甲醇重结晶，所得馏分上硅胶柱，梯度洗脱，薄层色谱收集相同组分的洗脱液，再上硅胶柱，梯度洗脱，薄层色谱收集相同组分的洗脱液，再用甲醇重新结晶，即可得到产品；28.其中，两次梯度洗脱的流动相均为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比变化为100:0-0:100；第一次薄层色谱的展开剂为氯仿、醋酸乙酯和甲酸的混合物，三者的体积比为5:4:1；第二次薄层色谱的展开剂为二氯甲烷、甲醇和水的混合物，三者的体积比为36:6:1。29.该提取方法先用乙醇回流提取进行粗提，然后再依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，三者极性由小至大，用量逐渐增多，有利于异牡荆素的富集和提取；最后采用两次“硅胶柱梯度洗脱+薄层色谱”的方式进一步精提，可提高其纯度和收率，经上述工艺制备的异牡荆素纯度达91％左右，收率为54％左右。30.下文将提供多个实施例作进一步说明。31.实施例1、异牡荆素的制备32.1)将干燥的天胡荽10kg充分粉碎后，加入90l的75％乙醇水溶液，加热回流提取3次，过滤合并3次乙醇提取液，真空回收乙醇，得到乙醇粗提物。33.2)将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，三者的体积分别为乙醇粗提物体积的1/3、3/3、4/3，各萃取3次，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，进行浓缩、干燥后，得到乙酸乙酯萃取物。34.3)将乙酸乙酯萃取物溶于甲醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤；滤液经浓缩后得到粉末，再用甲醇重结晶得到馏分；然后上硅胶柱(200-300目，10×300cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各500ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(氯仿:醋酸乙酯:甲酸＝5:4:1)收集相同组分的洗脱液，再上硅胶柱(200-300目，3×80cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各200ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(二氯甲烷:甲醇:水＝36:6:1)收集相同组分的洗脱液，再用甲醇重新结晶，制得产品。35.利用高效液相色谱测定含量所述白色晶体，色谱检测条件为：柱温25℃，乙腈和水混合梯度洗脱(0-25min，95％-65％乙腈；26-50min，65％-0％乙腈；51-55min，0％乙腈)；流速1.0ml/min，检测波长205nm。所得异牡荆素纯度达91.8％，收率为54.6％。36.实施例2、异牡荆素的制备37.1)将干燥的天胡荽10kg充分粉碎后，加入90l的70％乙醇水溶液，加热回流提取3次，过滤合并3次乙醇提取液，真空回收乙醇，得到乙醇粗提物。38.2)将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，三者的体积分别为乙醇粗提物体积的1/4、4/3、3/2，各萃取4次，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，进行浓缩、干燥后，得到乙酸乙酯萃取物。39.3)将乙酸乙酯萃取物溶于甲醇中，微孔滤膜(0.22μm)过滤；滤液经浓缩后得到粉末，再用甲醇重结晶得到馏分；然后上硅胶柱(200-300目，10×300cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各500ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(氯仿:醋酸乙酯:甲酸＝5:4:1)收集相同组分的洗脱液，再上硅胶柱(200-300目，3×80cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各200ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(二氯甲烷:甲醇:水＝36:6:1)收集相同组分的洗脱液，再用甲醇重新结晶，制得产品。40.利用高效液相色谱测定含量所述白色晶体，色谱检测条件同实施例1。所得异牡荆素纯度达91.2％，收率为54.3％。41.实施例3、异牡荆素的制备42.1)将干燥的天胡荽10kg充分粉碎后，加入90l的80％乙醇水溶液，加热回流提取3次，过滤合并3次乙醇提取液，真空回收乙醇，得到乙醇粗提物。43.2)将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，三者的体积分别为乙醇粗提物体积的1/2、2/3、5/3，各萃取2次，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，进行浓缩、干燥后，得到乙酸乙酯萃取物。44.3)将乙酸乙酯萃取物溶于甲醇中，微孔滤膜(0.45μm)过滤；滤液经浓缩后得到粉末，再用甲醇重结晶得到馏分；然后上硅胶柱(200-300目，10×300cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各500ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(氯仿:醋酸乙酯:甲酸＝5:4:1)收集相同组分的洗脱液，再上硅胶柱(200-300目，3×80cm)，用氯仿和甲醇(100:0-0:100，各200ml)的混合物进行梯度洗脱，薄层色谱(二氯甲烷:甲醇:水＝36:6:1)收集相同组分的洗脱液，再用甲醇重新结晶，制得产品。45.利用高效液相色谱测定含量所述白色晶体，色谱检测条件同实施例1。所得异牡荆素纯度达91.8％，收率为53.6％。46.将上述实施例1-3中的产品进行光谱检测，光谱检测数据为：[0047]1h-nmr(400mhz，dmso)δ：6.78(1h,s,h-3),6.52(1h,s,h-8),6.93(2h,d,j＝8.4hz,h-2',6'),7.93(2h,d,j＝8.4hz,h-3',5'),4.58(1h,d,j＝9.6hz，glc-1”)；13c-nmr(100mhz,dmso)δ:163.3(c-2),102.7(c-3),181.9(c-4),161.2(c-5),108.9(c-6),163.3(c-7),93.9(c-8),156.2(c-9),103.4(c-10),121.1(c-1'),128.4(c-2',6'),116.0(c-3',5'),160.6(c-4'),73.0(c-1”),70.6(c-2”),78.9(c-3”),70.6(c-4”),81.5(c-5”),61.4(c-6”).这些数据表明该化合物是异牡荆素，化学名为：6-(β-d-glucopyranosyl)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4h-1-benzopyran-4-one，分子式为：c21h20o10,分子量为：432.38。[0048]下文还提供异牡荆素对酒精性脂肪肝的保护作用的相关试验。[0049]试验例、异牡荆素对酒精性脂肪肝的保护作用[0050]1.动物模型的分组和处理[0051]c57bl/6小鼠，雄性，spf级，体重(20±5)g分为a组：空白对照组，b组：酒精模型对照组(模型组)，c组：水飞蓟宾组，d组：异牡荆素高剂量组，共4组，每组10只。除空白对照组外，其他小鼠均接受酒精灌胃，40％乙醇,9.0g/(kg·d)，水飞蓟宾组(25.26mg/kg)，异牡荆素高剂量组(100mg/kg)每日一次。10周后，经腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后将小鼠处死，取血并取出肝组织备用。血清及肝组织均贮存在-80℃冰箱待用。[0052]2.检测指标[0053](1)肝组织病理学观察；采用油红o染色，结果如图1；[0054](2)检测血清ast、alt、ldl和hdl水平；采用生化分析仪检测，结果如表1；[0055](3)检测肝组织sod、gsh和gsh-px水平；通过检测试剂盒检测，结果如表2；[0056](4)检测肝组织il-6、il-1β和tnf-α水平；采用elisa法检测，结果如表3；[0057]3.实验结果[0058](1)异牡荆素显著减轻肝脏病理学改变[0059]如图1，油红o染色结果显示，正常组见少量脂滴形成，而模型组小鼠的肝组织出现大量红色脂滴，脂质含量显著高于正常对照组；在水飞蓟宾组和异牡荆素高剂量组中，脂滴形成明显减少，脂质含量显著降低，并呈浓度依赖性。[0060](2)异牡荆素显著降低血清alt、ast和ldl水平，升高hdl水平[0061]与正常对照组比较，模型组小鼠血清ast、alt和ldl水平显著升高，hdl含量显著降低(p《0.05)，经水飞蓟宾或异牡荆素干预后，血清ast、alt和ldl水平均显著降低(p《0.05)，而hdl含量显著升高(p《0.05)。结果见表1。[0062]表1、异牡荆素对小鼠血清ast、alt、ldl和hdl的影响n＝10)[0063][0064]注：与正常对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，#p《0.05[0065](3)异牡荆素显著减少肝组织sod、gsh和gsh-px水平[0066]与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织sod、gsh和gsh-px水平显著升高(p《0.05)，经水飞蓟宾或异牡荆素干预后，肝组织s5od、gsh和gsh-px水平均显著降低(p《0.05)。结果见表2。[0067]表2、异牡荆素对小鼠肝组织sod、gsh和gsh-px的影响(n＝10)[0068][0069]注：与正常对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，#p《0.05[0070](5)异牡荆素显著降低肝组织炎症因子il-6、il-1β和tnf-α释放[0071]与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织il-6、il-1β和tnf-α水平显著升高(p《0.05)，经水飞蓟宾或异牡荆素干预后，肝组织il-6、il-1β和tnf-α水平显著降低(p《0.05)。结果见表3。[0072]表3、异牡荆素对小鼠肝组织il-6、il-1β和tnf-α的影响n＝10)[0073][0074]注：与正常对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，#p《0.05[0075]4.结论[0076]异牡荆素能够明显改善肝细胞脂滴形成，对酒精性脂肪肝具有明显的保护作用，其机制与抗炎、抗氧化应激密切相关。以上试验例说明包含异牡荆素的药物可用于防治酒精性脂肪肝。









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