一种发酵生产腺嘌呤的方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及微生物及发酵工程技术领域，尤其是一种发酵生产腺嘌呤的方法。背景技术：2.腺嘌呤又称6-氨基嘌呤，是脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)中的一种碱基，缩写为a。在脱氧核糖核酸中，它与胸腺嘧啶(t)配对。在核糖核酸中，它与尿嘧啶(u)配对。旧称维生素b4。腺嘌呤在生物化学上也具有许多不同的功用。于细胞呼吸中，是以富有能量的腺苷三磷酸(atp)，以及辅因子chemicalbook烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)等形式发生作用；在蛋白质生物合成过程里作为dna与rna的组成物。目前腺嘌呤的生产方法是通过酶解腺苷生产腺嘌呤，利用此方法生产腺嘌呤会产生大量的d-核糖，对后期腺嘌呤的提取造成极大的困难。技术实现要素：3.本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵生产腺嘌呤的方法。4.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：5.一种发酵生产腺嘌呤的方法，分别培养腺苷水解酶工程菌bl21-adh与腺苷枯草芽孢杆生产菌xgl，并用超声对bl21-adh发酵液进行超声处理，最后在枯草芽孢杆菌xgl发酵至中后期时混合经超声处理的bl21-adh培养液，使枯草芽孢杆菌xgl发酵生产的腺苷转化为腺嘌呤，并分别在混合培养之后分两阶段分别进行两次膜透析操作，使透析液排出、浓缩菌体回流至罐中继续发酵，并分别在其透析后补加60％枯草芽孢杆菌xgl发酵培养基，使其继续发酵生产。6.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述bl21-adh培养4h时添加诱导剂iptg，之后培养至10h时进行超声处理。7.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述枯草芽孢杆菌xgl的具体培养步骤如下：8.(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌xgl从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在34℃；9.(2)种子培养：将无菌水(200ml左右)于超净台火焰附近倒入茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程ph维持在6.7-7.0，温度维持在34℃，溶氧维持在35-50％；10.(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期ph维持在6.7-7.0，发酵中后期(菌体od生长缓慢)发酵ph维持在6.4-6.7，温度维持在34℃，溶氧维持在30％-50％，培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程；11.(4)营养物流加：发酵培养10h开始以0.3g/l/h的速率流加营养物(流加用量300ml，发酵过程中使用蠕动泵匀速流加，流加速率0.3g/l/h)，流加营养物的成分为：vb1、vb3、vb5、vb12各4mg/l、vh 1mg/l、黄嘌呤0.2mg/l、组氨酸0.7g/l、酵母粉10g/l、大豆酶解粉30g/l。12.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖2g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠2.5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉2g/l，琼脂粉25g/l，黄嘌呤50mg/l，组氨酸50mg/l；所述种子培养基为：葡萄糖30g/l，酵母粉8g/l，mgso4·7h2o 0.5g/l，kh2po4 3g/l，蛋氨酸0.5g/l，味精3g/l，蛋白胨5g/l，黄嘌呤200mg/l，组氨酸0.5g/l，vb1、vb3、vb5、vb12各3mg/l，vh2mg/l，硫酸铵8g/l，r-gaba 0.2g/l，消泡剂(defoamer消泡剂)1g/l；所述发酵培养基成分为：葡萄糖30g/l，味精12g/l，酵母粉10g/l，kh2po4·3h2o6g/l，黄嘌呤200mg/l，组氨酸0.5g/l，vb1、vb3、vb5、vb12各5mg/l，vh2mg/l，cacl22g/l，次黄嘌呤20g/l，mgso4·7h2o5g/l，微量元素混合液5ml/l，feso4·7h2o 20mg/l，mnso410mg/l，硫酸铵10g/l，r-gaba0.1g/l，其中，所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/l，硼酸5mg/l，cocl2·6h2o 1.4mg/l，mnso4·h2o 0.5mg/l，cuso4·7h2o 0.5mg/l，znso4·7h2o 0.6mg/l，消泡剂1g/l，各成分称量固体后溶解于1l水中，在4℃保存。13.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述消泡剂为有机硅类消泡剂(defoamer消泡剂)。14.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，当枯草芽孢杆菌xgl培养至10h时开始流加营养物(流加用量300ml，发酵过程中使用蠕动泵匀速流加，流加速率0.3g/l/h)。15.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述bl21-adh的具体培养步骤如下：16.(1)菌种活化：将bl21-adh从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在37℃；17.(2)菌体培养：将无菌水(200ml左右)于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程ph维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35-50％，培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程；18.(3)诱导剂添加：在菌体量培养至4h时添加诱导剂iptg，诱导腺苷水解酶的表达，iptg按0.1mmol/l添加；19.(4)bl21-adh发酵液超声处理：选用功率为300w，频率为25khz的超声棒对菌体进行处理。20.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述步骤(4)中超声处理的工作方式为：工作7min，间歇3s，期间温度控制在4℃，并将处理完的菌液于4℃罐中保存，直至整体发酵结束。21.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述斜面培养基成分为：葡萄糖2g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠2.5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉2g/l，琼脂粉25g/l；所述菌体培养的培养基成分为：葡萄糖30g/l，酵母粉8g/l，蛋白胨4g/l，(nh4)2so4 3g/l，k2hpo4·3h2o 4g/l，柠檬酸1g/l，mnso410mg/l，feso4·7h2o 10mg/l，mgso4·7h2o 1g/l，微量元素混合液1ml/l，vb1、vb3、vb5、vb12各1mg/l。22.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，混和透析发酵培养的步骤及条件为；对枯草芽孢杆菌xgl进行发酵培养后进行三次混合操作，之后再进行两次透析操作，混和培养发酵期间ph维持在6.7-7.0(通过流加氨水进行ph调节)，溶氧维持在40％-60％，温度维持在36℃。23.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述三次bl21-adh的混合时间分别选择为枯草芽孢杆菌xgl发酵生产的30h、50h、70h；35h、55h、75h；或40h、60h、80h。进一步优选为35、55、75h。24.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述两次膜透析时间分别选择为枯草芽孢杆菌发酵35h、55h；40h、60h；45h、65h；50h、70h。进一步优选为枯草芽孢杆菌发酵45h、65h。25.优选的，上述发酵生产腺嘌呤的方法，所述三次的混合比例(枯草芽孢杆菌xgl发酵体系的百分比比例)分别选择为：10％、5％、3％；15％、10％、5％；或20％、15％、10％。进一步优选为15％、10％、5％。26.有益效果：27.本发明所述发酵生产腺嘌呤的方法，通过营养物流加提高了枯草芽孢杆菌xgl发酵中后期的菌种活力以及其腺苷生产能力，通过对bl21-adh的诱导培养使其生产高活力的腺苷水解酶，在经超声处理之后的bl21-adh菌液保留了腺苷水解酶的活性，温度降至4℃，能极大地保存腺苷水解酶现有的活性，最后将其以不同的比例混合至不同发酵时间的枯草芽孢杆菌xgl中；在后期的混合培养过程中，高活力的腺苷水解酶以枯草芽孢杆菌xgl发酵生产的腺苷为原料，并且破碎的菌体能作为营养丰富的营养物，使发酵后期的菌体发酵生产潜能得到进一步提高；腺苷经腺苷水解酶分解生成腺嘌呤和d-核糖，d-核糖作为重要的五碳单糖，能被直接菌体利用，降低了糖的消耗，并且d-核糖还是核糖核酸(rna)、atp的重要组成物质，能在一定程度上提高菌体的活力；并且在发酵的一定时间对发酵液进行透析处理，并补充一定量的新鲜培养液，使菌体的生长环境得到了净化，解除了终产物对菌体的反馈抑制，更有利于菌体的生长及产物的生成。28.上述方法采用混菌发酵法生产腺嘌呤能使腺苷酶解之后产生的d-核糖被菌体重新利用，既降低了混菌之后糖的消耗，同时也降低了腺嘌呤后期的提取难度，同时经超声处理的bl21-adh菌体培养液不但能保留其腺苷水解酶的活性，而且超声破碎之后的菌液营养丰富，还能进一步的提高发酵后期枯草芽孢杆菌xgl的菌体活力，同时通过透析发酵的方法，对后期菌液进行透析，净化菌体的生存环境同时解除终产物对菌体的反馈抑制。具体实施方式29.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。30.实施例131.一种发酵生产腺嘌呤的方法，具体步骤如下：32.一、枯草芽孢杆菌xgl培养33.(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌xgl从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在34℃；所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖2g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠2.5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉2g/l，琼脂粉25g/l，黄嘌呤50mg/l，组氨酸50mg/l；34.(2)种子培养(2l)：将200ml左右无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，培养过程ph维持在6.7-7.0左右，温度维持在34℃，溶氧维持在35-50％之间；所述种子培养基为：葡萄糖30g/l，酵母粉8g/l，mgso4·7h2o 0.5g/l，kh2po4 3g/l，蛋氨酸0.5g/l，味精3g/l，蛋白胨5g/l，黄嘌呤200mg/l，组氨酸0.5g/l，vb1、vb3、vb5、vb12各3mg/l，vh 2mg/l，硫酸铵8g/l，r-gaba0.2g/l，消泡剂(defoamer消泡剂)1g/l。35.(3)发酵培养(3l)：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期ph维持在6.7-7.0，发酵中后期(菌体od生长缓慢)发酵ph维持在6.4-6.7，温度维持在34℃，溶氧维持在30-50％之间，所述发酵培养基成分为：葡萄糖30g/l，味精12g/l，酵母粉10g/l，kh2po4·3h2o 6g/l，黄嘌呤200mg/l，组氨酸0.5g/l，vb1、vb3、vb5、vb12各5mg/l，vh 2mg/l，cacl2 2g/l，次黄嘌呤20g/l，mgso4·7h2o 5g/l，微量元素混合液5ml/l，feso4·7h2o 20mg/l，mnso4 10mg/l，硫酸铵10g/l，r-gaba0.1g/l，消泡剂(defoamer消泡剂)1g/l。培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程。36.(4)营养物流加(300ml)：发酵培养10h开始以0.3g/l/h的速率流加营养物，所述流加营养物的成分为：vb1、vb3、vb5、vb12各4mg/l、vh1mg/l、黄嘌呤0.2mg/l、组氨酸0.7g/l、酵母粉10g/l、大豆酶解粉30g/l。37.二、bl21-adh菌培养38.(1)菌种活化：将bl21-adh从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在37℃左右；所述斜面培养基成分为：葡萄糖2g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠2.5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉2g/l，琼脂粉25g/l。39.(2)菌体诱导培养(2l)：用200ml将茄形瓶中的菌体进行重悬，并接进种子罐子，培养过程ph维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35-50％之间。所述菌体培养的培养基成分为：葡萄糖30g/l，酵母粉8g/l，蛋白胨4g/l，(nh4)2so4 3g/l，k2hpo4·3h2o 4g/l，柠檬酸1g/l，mnso410mg/l，feso4·7h2o 10mg/l，mgso4·7h2o 1g/l，微量元素混合液1ml/l，vb1、vb3、vb5、vb12各1mg/l。40.(3)诱导剂添加：在菌体培养至4h时添加诱导剂iptg，诱导腺苷水解酶的表达，iptg按0.1mmol/l添加。41.(4)发酵液超声处理：bl21-adh发酵液超声处理：选用功率为300w，频率为25khz的超声棒对菌体进行处理，特别的，工其作方式为：工作7min，间歇3s，期间温度控制在4℃，并将处理完的菌液于4℃罐中保存备用，直至整体发酵结束。42.三、混合发酵培养43.枯草芽孢杆菌xgl发酵培养至一定时间时混合一定量的经超声处理的bl21-adh菌体培养液，本次实验选择枯草芽孢杆菌发酵至30h、50h和70h时进行三次混合操作，三次混合比例分别按枯草芽孢杆菌xgl发酵体系的10％、5％、3％的比例进行混合操作，并分别在发酵培养至35h、55h时，进行两次透析操作，混和培养发酵期间ph维持在6.4-6.6(通过流加氨水进行ph调节)，溶氧维持在40％-60％，温度维持在36℃。44.发酵85h放罐时，总腺苷量为146g；总腺嘌呤产量为41g；总d-核糖产量为0g。45.实施例246.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为35h、55h和75h；47.发酵85h放罐时，总腺苷量为132g：总腺嘌呤产量为47g：总d-核糖产量为0g。48.实施例349.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为40h、60h和80h；50.发酵85h放罐时，总腺苷量为138g：总腺嘌呤产量为45g：总d-核糖产量为0g。51.实施例452.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为35h、55h和75h，三次混合操作的混合比例分别选择为枯草芽孢杆菌发酵体系的15％、10％、5％；53.发酵85h放罐时，总腺苷量为56g：总腺嘌呤产量为86g：总d-核糖产量为0g。54.实施例555.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为35h、55h、75h，三次混合操作的混合比例分别选择为枯草芽孢杆菌发酵体系的20％、15％、10％；56.发酵85h放罐时，总腺苷量为57g：总腺嘌呤产量为85g：总d-核糖产量为0g。57.实施例658.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为35h、55h和75h，三次混合操作的混合比例分别选择为枯草芽孢杆菌发酵体系的15％、10％、5％，发酵透析操作分别选择为枯草芽孢杆菌发酵培养至45h、65h时；59.发酵85h放罐时，总腺苷量为0g：总腺嘌呤产量为110g：总d-核糖产量为0g。60.实施例761.一种发酵生产腺嘌呤的方法，参照实施例1，不同之处在于：三次混合操作的时间分别选择为35h、55h和75h，三次混合操作的混合比例分别选择为枯草芽孢杆菌发酵体系的15％、10％、5％，发酵透析操作分别选择为枯草芽孢杆菌发酵培养至50h、70h时；62.发酵85h放罐时，总腺苷量为107g；总腺嘌呤产量为0g；总d-核糖产量为0g。63.实施例864.腺嘌呤的产量、腺苷的积累、副产物d-核糖的积累与混合的时间及混合的比例有关，具体数据如表1所示；65.表1实施例结果汇总[0066][0067]综上所述，混合时间、混合比例以及透析时间的选择对腺嘌呤的产量和腺苷的剩余影响较大；结果显示，混合比例的选择对副产物腺苷转化至关重要，混合量过少，腺苷不能充分的转化，之后的膜透析操作会使腺苷与已转化的腺嘌呤同时离开发酵体系，造成整体腺苷的积累，过多又会造成腺苷水解酶活性的浪费，同时产量也不能得到充分提升；透析是在前两次混合操作之后一定时间内进行的，透析时间过早，腺苷不能充分转化，会在透析过程中离开发酵体系造成腺苷的积累；混菌时间也会对腺嘌呤产量造成一定的影响，混合时间过早，腺苷产量较少，虽然也能生成腺嘌呤，但腺嘌呤生成较少，实用价值较小。[0068]由上述实施例的结果可知，本发明提供的腺嘌呤发酵方法，减少了腺苷的提取过程，减少了糖的消耗，提高了发酵中后期菌体的活力和利用率，减少了副产物d-核糖的产生，提高了发酵产物的总产量，较现有的酶催化法生产工艺，具有污染小、操作简单、转化率高等优点。[0069]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。









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