用于细胞生物量生产的载体及包含其的细胞培养装置的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术用于细胞生物量生产的载体及包含其的细胞培养装置1.本技术案主张美国临时专利申请号62/953,575，申请日2019.12.25，名称“一种生物质量量产的细胞培养基质”的优先权，其公开内容通过引用并入本文。技术领域2.本发明涉及一种细胞培养基质领域，特别是一种真核细胞的生物量(biomass)生产的细胞培养基质。背景技术：3.随着生物科技的快速发展，用于原核细胞或真核细胞的细胞培养技术已越来越重要。一般来说，真核细胞生长较慢且易受到剪应力及污染的影响而受损，而大部分的真核细胞具有贴壁性(anchorage-dependent)，其需要贴附生长表面才得以生长。为了培养这些具有贴壁性的真核细胞，因而发展多种具有生长表面的培养载体(carrier)，常用的培养载体包含由葡聚糖基材料(dextran-based material)制成的具有平滑面的培养载体、由聚氨酯(polyurethane)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate)制成的多孔基质、以及由聚砜(polysulfone)或醋酸纤维素(cellulose acetate)所制成的具有中空纤维的半透膜(semi-permeable membrane)。然而，从上述培养载体中收集细胞容易受到这些载体因剪切力破坏所释放的碎屑颗粒所污染，尤其是具有多孔结构的载体而言，要将细胞由载体孔隙中回收更是困难。因此，贴壁细胞的细胞工艺放大(scale up)过程缓慢，不仅耗时费力且费用高昂。鉴于此，有必要发展适合的细胞培养载体以解决上述细胞收集的问题。4.目前用于贴壁细胞的培养载体主要包含下列两种：微粒(particulate)平滑面载体(无孔或少孔)及多孔载体。平滑面载体因受限于自身的生长表面积，进而限制了贴附及生长于其上的细胞数量。而另一方面，多孔载体则提供了三维腔体(three-dimensional cavity)以容置细胞，其多孔性也提供了额外的生长面积供细胞贴附，以保护细胞免于受到在曝气、搅拌及进料等细胞培养过程中所造成的剪应力带来的间接影响。然而，从多孔载体中收集细胞并非易事。用于细胞回收(cell recovery)的初代多孔载体为bionoc ii(已注册商标)载体(cesco bioengineering co.,ltd.)，其是由聚酯无纺布(polyester non-woven fabrics)所制成。从多孔bionoc ii载体收集细胞是由平面水平堆栈的纤维所形成的孔洞经过热压后形成的多层结构来收集。其中，纤维之间的开口都是以朝着相同的方向的形式排列，相较于其他的多孔材料(例如以随机方向分布于基质内的信道孔洞结构)，较易于释放细胞。然而，以bionoc ii载体收集细胞具有以下缺点：1.随机层叠于纤维中的孔洞会形成超过二十层的多重层叠结构，其中的孔洞具有几微米至几百微米不等的孔径尺寸，基于上述超过二十层纤维的物理障碍(physical obstacle)，细胞的释出并无法如在平坦表面那么直接；2.在收集细胞的过程中，纤维也容易同步被释出而造成细胞污染；3.上述被释出的纤维具有与细胞类似的尺寸，因此难以与所收集的细胞分离。这些分离纤维与细胞的过程不仅导致成本提升，同时也造成细胞损失，因此阻碍了bionoc ii载体在细胞生产(cellular production)领域的应用。上述缺点造成应用的限制或增加生产成本，特别是对于将细胞作为生物性产品的生产目标。5.生物技术和基因工程的革命性进化已经创造了细胞产品市场的高需求，例如蛋白质药物、细胞激素、单株抗体、病毒相关产品、疫苗、核酸、酵素以及细胞及/或组织。为应对这些产品的需求，同步产生了对效益性及经济性生产方法的不断增长的需求。6.真核细胞，例如哺乳动物细胞，已成为提供高质量及高产量蛋白质或细胞产物的热门目标。长期以来，培养哺乳动物细胞一直用于疫苗、基因工程蛋白、药物及其他细胞产品的生产。一般来说，真核细胞可为贴壁细胞、非贴壁细胞、或同时包含两者特性。贴壁细胞需要生长表面以定锚(anchor)、生长及生产所需的细胞产物。举例而言，贴壁细胞可为胚胎干细胞(embryonic stem cells)、间叶干细胞(mesenchymal stem cells)、纤维母细胞(fibroblasts)、上皮细胞(epithelial cells)及内皮细胞(endothelial cells)。真核细胞，例如淋巴细胞、某些转移的细胞及癌细胞，可为非贴壁细胞，且可悬浮地生长。然而，无论是哪一种类，大部分的真核细胞在培养时都具有以下共同特征(此将于以下段落详细说明)，这些特征在设计有效的生长表面及培养装置时都扮演了关键性的角色。7.贴壁细胞对生长表面的贴附依赖性是影响细胞活力的关键，并且是所有类型细胞的培养技术基础，包括但不限于传统的单层培养或以载体及/或微载体系统培养。由于贴壁细胞仅能在贴附适合的生长表面后增殖，因此所使用的促进细胞贴附的生长表面及培养程序十分的重要。细胞贴附包含将贴附因子(例如蛋白质)吸附到培养表面、使细胞接触该培养表面、将细胞贴附于适合细胞贴附的处理过后的表面、在整个生长表面散布及复制贴附的细胞直到该些细胞与另一个表面生长的细胞接触(即接触抑制(contact inhibition))。8.为了进行可行的贴壁细胞培养，培养装置需要设置有适当的培养生长表面或载体、用于循环特定细胞培养基的机制，并且适当地通气以提供充足的溶氧以维持细胞生长。目前有几种不同的培养细胞方法，包含：尽管需要添加氧气，但在培养过程中并不额外补充养分的批次培养系统(batch system)；需要对养分及氧气进行监控及补充的补料批次培养系统(fed batch systems)；以及通过持续补充新鲜的培养基来监控及控制养分与废弃产物的连续灌注培养系统(perfusion systems)。9.在本领域中已知几种类型的培养载体。举例而言，葡聚糖基(dextran-based)(例如cytodex i,dead-葡聚糖(deae-dextran)及cytodex iii、猪胶原蛋白涂布的葡聚糖(porcine collagen-coated dextran)；cytiva,us,(formally ge healthcare life sciences))、或涂布聚苯乙烯基的(coated polystyrene-based(e.g.,solohill,u.s.))微载体(microcarrier)。微载体通常很小，其直径约为50至250微米(micrometers)，然而，较大或较小尺寸的微载体也已有使用过(u.s.pat.no.5,114,855issued may 19,1992to hu et al.)。第二种细胞培养载体包含由陶瓷(ceramics)或聚氨酯泡沫(polyurethane foam)制成的多孔基质材料；由聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)制成的织物；或由聚乳酸聚乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),plga)、胶原蛋白(collagen)、壳聚糖(chitosan)所制成的生物可降解材料。10.细胞培养载体也可根据其表面特性进行分类。举例而言，一般有无孔载体(non-porous/poreless)和多孔载体。由于多孔载体提供更大的表面积-体积比以及对细胞的隔离保护(insulated cells)，因而多孔载体通常较无孔载体具有更多优点。因为多孔的特性，这些载体在生长表面形成多个三维腔体，因而可使细胞附着率最大化，并且可保护细胞免于受到在曝气、搅拌及进料等细胞培养过程中所造成的剪应力带来的间接影响。11.本领域目前许多可用的细胞培养系统采用多孔及/或无孔的微载体。这些微载体，例如现在常用的微珠载体(microcarrier beads)，常用在贴壁细胞的生产系统。这些微载体必须与搅拌设备及/或曝气功能一起使用。然而，微载体系统常见的问题在于，维持细胞培养的搅拌操作会破坏甚至杀死细胞，从而降低细胞培养系统的效率及所需的细胞产量。12.微载体系统也可以使用由离子交换凝胶(ion exchange gel)、葡聚糖(dextran)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)或胶原蛋白为基础的材料(collagen-based material)所制成的微小球体(spheres)。这些材料的选用在于其与细胞的兼容性、对搅拌的承受性(resilience)及可使微载体持续悬浮于培养基中的特定重力。微载体通常在缓慢搅拌下会持续地悬浮于培养基中，以确保养分及空气对所有细胞的平均分布。目前，微载体系统被认为是最适合大规模细胞培养的系统，因为具有最高的表面积-体积比，并能将养分均匀地分配至细胞。13.然而，目前的微载体系统具有严重的缺点，这些缺点包含高成本及高细胞死亡率，其中高细胞死亡率是由在培养过程中因搅拌及曝气所引起的高剪切应力所造成的。其次，最常用的微载体是使用多孔非刚性葡聚糖(porous non-rigid dextran)作为载体基质，当微载体搅拌的反应器中发生碰撞时，这种可压缩的(compressible)基质被认为可减少对于微载体及附着于其上的细胞的潜在破坏(microcarrier cell culture:principles and methods,pharmacia fine chemicals,uppsala,sweden,pages 5-33(1981))。然而，这些多孔微载体在保留细胞产物方面也具有严重的缺点，其会导致生长因子及其他成分从培养基中被吸附(butler,m.,"growth limitations in microcarder cultures",adv.biochem.eng./biotech.4:57-84(1987))。14.尼尔森等人(nilsson et al)于1991.5.14发布的美国专利(公告号5,015,576)是有关于一种通过于基质材料水溶液中添加不溶于水的固体(water-insoluble solid)、液体或气体的空腔产生化合物(cavity generating compound)以产生具有空腔的颗粒。接着通过在不溶于水的分散介质中分散这些颗粒，再通过冷却、共价交联反应(covalent cross-linking)或聚合反应(polymerization)以使基质不溶于水。然后，可选地，在衍生颗粒(derivatizing the particles)之后，将空腔产生化合物洗掉，这些颗粒即可在胶体过滤程序(gel filtration processes)、疏水层析法(hydrophobic chromatography)或亲和层析法(affinity chromatography)中作为离子交换剂使用。这些颗粒也可用以作为培养贴壁细胞的微载体。15.木村等人(kimura et al.)于1995.1.31发布的美国专利(公告号5,385,836)是有关于一种于细胞培养时用于贴附动物细胞的载体，或用于固定(immobilization)动物细胞的载体。该载体是通过将包含壳聚糖混和物形式的细胞贴附材料涂布于多孔基材而产生。该多孔基材是通过将包含丝蛋白(silk fibroin)、明胶(gelatin)及壳聚糖的树脂黏着剂(binder resin)注入(impregnating)无纺布网(nonwoven fabric web)中而获得的无纺布(nonwoven fabric)。通过将无纺布与添加有蛋白及明胶的壳聚糖酸性水溶液接触以进行涂布无纺布，干燥上述被涂布的无纺布以及用碱处理以使壳聚糖不易溶解后，完成涂布程序。16.穆奇等人(mutsakis et al.)于1996.10.15发布的美国专利(专利号5,565,361)是有关于一种具有固定贴附细胞的静态混合组件(motionless mixing element)的生物反应器，其可用于增强生物反应器中细胞的培养及增殖。该生物反应器具有外壳及静态混合组件，细胞可贴附于该静态混合组件上以生长及增殖。静态混合组件及生物反应器具有多孔纤维片状材料，例如波状或编织状的线材，如不锈钢或钛。且纤维的高度与直径具有预定的尺寸以便提供用于待培养细胞贴附的最大表面积。17.凯丁尔等人(katinger et al.)于1998.04.14发布的美国专利(公告号5,739,021)是有关于一种用于生物催化剂(biocatalysts)的多孔载体，其具有非水溶性无机填料及选自聚乙烯(polyethylene)及聚丙烯(polypropylene)的聚烯烃粘合剂(polyolefine binder)，且具有开放性的孔洞以允许细胞穿透并生长于孔洞中。这些孔洞的密度约高于1g/cm3。18.希勒加斯等人(hillegas et al.)于2001.04.10发布的美国专利(公告号6,214,618)提供一种微珠载体的制备方法，该微珠载体是通过在珠体的表面上形成具有苯乙烯共聚物核(styrene copolymer core)轻度交联(lightly crosslinked)的官能基，并以碱性及酸性溶液洗涤微珠载体后以使该微珠载体适用于细胞培养。微珠载体也可由外部具有三甲胺(tri-methylamine)的苯乙烯共聚物核所制成，该苯乙烯共聚物核已经碱性及酸性溶液洗涤而使用于细胞培养。19.尽管在前述专利前案中公开了多种用于细胞培养的载体，然而这些载体均无法满足3d培养中的高细胞密度需求、易于回收细胞的需求、以及收集细胞时无额外颗粒释放的需求。技术实现要素：20.为了解决上述缺点，本发明提供一种细胞培养基质：1.以网状结构(nettings or meshes)的取代纤维作为载体的基底；2.使用薄片网状结构，且以仿真无纺布载体方式(例如bionoc ii载体)层叠该薄片网状结构；3.将层片四周围以热压或超声波或胶黏处理密封以避免格网纤维脱落；4.将该层片卷曲或堆栈层叠或充填为柱状或其他形状/结构，以使其作为固定床培养系统中的固定床，特别是在tidemotiontm培养系统中的bellocell(已注册商标)及tidecell(已注册商标)生物反应器系统。tidemotiontm培养系统的定义为通过间歇性地沉浸(submerging)及暴露(emerging)具有多孔基质的固定床，以带入养分及氧气使细胞生长于多孔基质上/内，同时从多孔基质中去除废物及多余的二氧化碳。在这样的设计下，相较于无纺布载体，本发明可具有以下优点：1.各层中孔洞的形状及尺寸维持一致性；2.多层薄层片网状结构可再堆栈或卷曲，或制成其他形状，以此来建构生物反应器的填充床可具有较高的细胞培养密度及获得较高的细胞回收率；3.相较于无纺布载体二十几层结构，本发明的薄层片网状结构的层叠数量调降，更有利于细胞由载体中释出；4.网状结构相较于无纺布更加坚固且不易释出微粒与纤维，尤其将所述多层网状结构周边密封后，更可以大幅降低纤维或颗粒的释出；5.网状结构的纱线(yarns)的直径远大于细胞，因此可轻易地从细胞液中过滤而分离，降低纯化回收细胞的成本与损失；6.通过卷曲或堆栈或充填多层薄片网状结构可将供细胞生长的表面积最大化，特别是使用于bellocell及tidecell生物反应器系统。综上所述，通过本发明所设计的载体结构，可实现高密度细胞培养及高产量的细胞生产。21.整体而言，本发明提供一种通过以薄层片或条状格网的网状结构，并通过层叠该网状结构作为细胞生长表面及结构，可显著地提升贴壁细胞的培养效率及细胞回收率。更特别地，本发明提供一种新颖的细胞生长表面及结构、及其制造方法。本发明提供一种用于培养细胞的新颖的生长表面及结构，其可使细胞贴附率及细胞存活率最大化、使细胞生长密度增加、同时增加细胞回收率并避免载体上释出的微粒从所述生长表面释出。因此，根据本发明所提供的独特的细胞培养生长表面、结构及其制造方法，可弥补现有技术的缺点及不足，更可应用于供细胞生产应用的细胞/组织培养。22.本发明提供一种新式的载体结构，其为层叠网状结构，且每层本身具有一致的孔洞结构及尺寸，而当此载体结构为较大的尺寸时，可便于卷曲或堆栈而形成单一固定床单元(single fixed bed unit)，此载体结构也可为小尺寸的载体结构，通过在限定区域空间充填多个载体结构以形成固定床。由多层格网堆栈形成的层状结构的四周以热压或超声波或胶黏密封，可以此避免或降低格网纤维或颗粒的释放。由网状织物所制成的大尺寸薄片尺寸可为1cm×20cm至10m×100m，其尺寸取决于固定床的大小。更精确地，由网状织物所制成的薄片尺寸可为3cm×50cm至2m×20m。基质床也可通过将多个具有相同结构的小块载体随机充填(randomly disposed)在一个容器内而形成。若为小尺寸的载体结构，则其尺寸可为(0.3cm-1cm)×(0.5cm-10cm)，更精确地，由网状织物所制成的小尺寸薄片可为(0.5cm-1cm)×(1cm-5cm)。其中，网状结构(netting or mesh)的定义为网眼(mesh)(也称为网眼织物(netting fabric))，其通常被定义为具有大量相互间隔孔洞的织物，这些孔洞的特征在于其孔口开放的外观(net open appearance)以及纱线(yarns)之间的间隔。该网状结构可以由编织(knit)、机织(woven)、挤压(extruded)、或打结(knotted)的方式来建构，且可应用于多种结构，包含针织(knits)、花边(laces)或钩编织物(crocheted fabrics)。23.无纺布的定义是由人造纤维(staple fiber)(短)及长纤维(连续长纤维)所制成的织物状材料(fabric-like material)，其是通过化学、机械、热或溶剂处理而黏合在一起。24.网状结构的表面可被处理为具有生物兼容性(biocompatible)及亲水性(hydrophilic)，从而使细胞贴附于其上并生长。网状结构的外表面具有另一网层，其具有较大的孔径及较粗的纱线，该网层可经表面处理或不经表面处理，其主要作为隔离层以允许培养基或空气自由地流通上述经表面处理的多个网状结构层之间。通过将用于供细胞贴附及生长的堆栈的多层网状结构以及用于作为间隔层的网层相互卷曲可形成较大的基质床(matrix bed)。此由网状织物所制成的大尺寸薄片尺寸可为1cm×20cm至10m×100m，其尺寸取决于固定床的大小。更精确地来说，在卷曲及堆栈之前，网状结构的尺寸可为3cm×50cm至2m×20m。基质床也可通过将多个具有相同结构的小块载体随机充填(randomly disposed)在一个容器内而形成。若为小尺寸的载体结构，则尺寸可为(0.3cm-1cm)×(0.5cm-10cm)，更精确地，由网状织物所制成的小尺寸薄片可为(0.5cm-1cm)×(1cm-5cm)。网状织物内作为经线及纬线的纱线宽度可为50μm到1000μm，更精确地来说，该纱线宽度可为50μm到500μm，其宽度远大于细胞直径(约5-20μm)，因此即使由网状织物内脱离，也容易以过滤方式与细胞分离。须说明的是，上述作为经线及纬线的纱线，其剖面可依实际状况而呈现为圆柱状、椭圆状、或矩形，因此，于本说明书中，所述纱线的宽度或纱线的直径皆可用于说明纱线的尺寸大小。上述小块载体包含供细胞贴附生长的多层网状结构及其用于作为间隔层的网层，在卷曲或堆栈以形成用于生物反应器的固定床之后，该多层网状结构最适用于tidemotiontm系统(例如bellocell或tidecell)。在这些系统中，细胞培养的机制是通过间歇性地使固定床沉浸(submerging)及暴露(emerging)于培养基中。根据上述tidemotiontm系统的细胞培养机制，培养基仍可离开固定床并允许新鲜空气进入固定床，因而可实现细胞生长表面积的最大化。25.考虑到细胞培养过程的重要性及本领域中已知载体系统的不足，本发明提供一种细胞培养载体系统，其可使细胞以高密度培养于3d结构中，且可有利地应用于培养基自由流动的培养容器或生物反应器中。本发明的载体系统独特点在于，其可促进细胞培养后细胞或组织的回收，并且使非细胞来源的额外颗粒释放最小化。尽管在网状结构仍有颗粒释放的可能，然而由于该载体的格网线(纱线)直径远大于细胞尺寸，因此可通过过滤的方式轻易的去除。因此，根据本发明所提供的用于细胞培养生长的表面及结构可弥补现有技术的缺点及不足。26.本发明提供一种适用于细胞培养的高效且新颖的生长表面及结构，且可提供大规模的细胞或组织收获(harvest)，本发明还提供该生长表面及结构的制造方法。本发明的一目的在于但不限于：提供新颖的细胞培养生长表面，其中包含一致的孔洞结构及尺寸，从而可供细胞贴附且使细胞展现更一致的生长表现(growth for more consistent performance)；提供细胞培养生长表面，其可整合至tidemotiontm培养系统，例如bellocell及tidecell生物反应器系统，以提供最大化的细胞生长表面；提供细胞培养生长表面，可在培养完成后有利于细胞或组织的回收；以及提供细胞培养生长表面，可大幅降低细胞培养及细胞回收时额外的非细胞相关颗粒释出。27.本发明提供一种三维多孔生长表面，其是由天然或人造聚合物材料所制成的网状结构所构成，特别是由聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)制成。该生长表面可强化细胞生长表面、促进细胞的固定及增殖、维持表面结构的完整性、有利于细胞回收、且不易造成任何人造颗粒的释放，因而可提升细胞产量。28.本发明的一目的在于提供一种用于细胞培养的载体，其包含网状结构单元，该网状结构单元包含至少一第一网层，其具有由第一经线及第一纬线交织所形成的多个第一网孔，且所述第一网层具有生物兼容性及亲水性；及至少一第二网层，其具有由第二经线及第二纬线交织所形成的多个第二网孔，所述第二网层平行地设置于所述第一网层之上或之下。29.较佳地，网状结构单元可包含两层第一网层及一层第二网层，其中第二网层设置于两层第一网层中间、或设置于两层第一网层之上、或设置于两层第一网层之下。30.较佳地，网状结构单元可包含至少三层第一网层及一层第二网层，其中第二网层设置于三层第一网层的任两层之间、或设置于三层第一网层之上、或设置于三层第一网层之下。31.较佳地，第一网层的材料可包含聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)，而第二网层的材料可包含聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,pe)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,ptfe)或尼龙(nylon)。32.较佳地，多个第一网孔的孔径可为30μm至800μm，而多个第二网孔的孔径可为1mm至5mm。33.较佳地，所述第一网层为经过亲水性表面处理的一格网材料，以及所述第二网层为具有支撑性的格网材料。34.较佳地，载体的型态可为由网状结构单元卷曲而形成的一或多个柱体、由多个网状结构单元依序层叠而形成的一或多个柱体、或由多个网状结构单元随机堆栈而形成的堆栈体。35.较佳地，所述第一网层的周边与第二网层的周边是以热压、超声波或胶黏的方式封合。36.较佳地，在所述第一网层中，多个第一网孔的孔径可全部相同或部分相同。37.较佳地，在第二网层中，多个第二网孔的孔径可全部相同或部分相同。38.较佳地，任一条第一经线、任一条第一纬线的宽度可为50μm到500μm，而任一条第二经线、或任一条第二纬线的宽度可为100μm到1000μm。39.较佳地，任一条第一经线、任一条第一纬线的宽度可为50μm到250μm，而任一条第二经线、或任一条第二纬线的宽度可为250μm到500μm。40.根据上述，一种细胞培养装置，其包含培养腔室及用于细胞培养的载体，该载体设置于培养腔室中且具有网状结构单元，该网状结构单元包含至少一第一网层，其具有由第一经线及第一纬线交织所形成的多个第一网孔，且所述第一网层具有生物兼容性及亲水性；及至少一第二网层，其具有由第二经线及第二纬线交织所形成的多个第二网孔，该第二网层平行地设置于所述第一网层之上或之下。41.更特别的是，本发明所提供的新颖的生长表面包含至少一层表面以pet处理过的网状结构(nettings/meshes)，其具有30μm至800μm的孔洞以供细胞贴附及生长；以及一层经表面处理或不经表面处理的网层，其具有1mm至5mm的孔洞，较佳地，可由聚丙烯(polypropylene)或尼龙(nylon)制成，其作为间隔物以促进养分及空气流通于上述多个网状结构层之间。通过将用于供细胞贴附及生长的堆栈的多层网状结构以及用于做为间隔层的网层相互卷曲、或堆栈或充填可形成基质床(matrix bed)用于填充床(packed-bed)生物反应器，特别是bellocell或tidecell生物反应器。此经过表面处理的pet多层网状结构可为至少一层或多达十层或以上，其取决于网状结构的厚度及/或细胞培养及细胞回收的容易度。当本发明的载体经由卷曲状、堆栈或充填形成载体床时，且当其应用于bellocell或tidecell细胞培养系统时，其可达到最大的生质生产(biomass production)结果。这是因为tidecell细胞培养系统使用tidemotiontm培养机制，其是通过间歇性地使载体沉浸(submerge)及暴露(emerge)于培养基中。在tidemotiontm培养机制中，即使将填充床紧密地堆栈(如卷曲或堆栈或充填)，仍可使氧气进入基质床而不会导致细胞溺毙(drowning of cells)。其他的细胞培养生物反应器并无法在如此高密度的填充条件下进行细胞培养。因此，本发明结合bellocell或tidecell细胞培养系统可在性能上达到最大的效果，此可从下述的实施例及详细的说明中得知。附图说明42.以下所提供的图式仅为例示性说明，并不意为限制本发明于任何所述的特定实施例。这些说明可以理解为用于结合附图于此作为本说明书的参照内容。43.图1为根据本发明一实施例的新颖的载体结构爆炸示意图。44.图2为本发明另一实施例的新颖的载体结构爆炸示意图。45.图3为本发明再一实施例的新颖的载体结构爆炸示意图。46.图4为本发明的第一网层及第二网层的周边密封示意图。47.图5为本发明又一实施例的新颖的载体结构示意图。48.图6为本发明另一实施例的新颖的载体结构示意图。49.图7为本发明再一实施例的新颖的载体结构示意图。50.图8为根据本发明一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图。51.图9为根据本发明另一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图。52.图10为根据本发明再一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图。53.图11为根据本发明一实施例的新颖的载体结构的使用示意图。54.图12为根据本发明一实施例的新颖的载体结构的使用示意图。55.图13为间叶干细胞生长于本发明的载体结构的示意图。56.图14为间叶干细胞生长于本发明的载体结构的示意图。57.图15为在细胞收获后其中一层网状结构的载体结构示意图。58.图16为在细胞收获后其中一层网状结构的载体结构示意图。59.图17为从bellocell培养系统中的载体结构回收的细胞数目及回收率结果。60.图18为含有细胞的培养液中的额外颗粒的计数结果。具体实施方式61.本发明提供一种三维多孔生长表面，其是由多层网状结构(netting/mesh)所构成。其可强化细胞生长表面、促进细胞的固定、有利于细胞回收、降低颗粒释放、且可因此增加细胞产量。本发明还提供一种改善生长表面的方法，其可使用于真核细胞培养，其包含下列步骤：提供多孔及三维结构的生长表面；将该生长表面进行处理以促进细胞贴附；将该生长表面设置于任意的细胞培养装置中并使细胞于其中生长并增殖。上述生长表面可使细胞生长，且在培养完成后，在该生长表面添加胰蛋白酶(trypsin/edta)、蛋白酶、胶原酶(collagenase)及/或dna酶可使细胞/组织释放以获得单一颗细胞。62.下述仅为例示性说明，并不意欲限制本发明于任一特定的所述实施例。这些说明配合图式作为例示，使读者对本发明有较完整的了解。为避免不必要地限制前述内容，以下将揭露本发明的优选的实施例。本发明的实施例适用于真核细胞的培养，尤其适用于动物细胞及/或哺乳动物细胞。本发明特别地提供了适用于培养贴壁细胞的新颖生长表面及结构，可易于在细胞生长完成后收集细胞。63.本发明的新颖的生长表面是由多层网状结构所制成，其包含用于支撑或间隔的网层、以及用于供细胞贴附及生长的一层或多层网状结构，其中，供细胞贴附及生长的网状结构可为至少一层(如图1所示)、两层(如图2所示)、三层(如图3所示)、或根据所欲培养的细胞而可为更多层。64.图1为本发明一实施例的新颖的载体结构示意图，其中该结构由两层片状网状结构所制成，顶部一层具有较小的孔洞尺寸(30μm至800μm)，而底部层具有较大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。顶部一层是由易于表面处理的格网材料所制成，例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)，而底部层是由可支撑性的格网材料所制成，可由例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,pe)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,ptfe)或尼龙(nylon)的材料所制成，其具刚性和支撑性且可于建构基质床时作为间隔物及支撑物。顶部一层网状结构经表面处理为具有生物兼容性(biocompatible)及亲水性(hydrophilic)，从而使细胞贴附于其上并生长。底部的网层可作为间隔物，可不须经表面处理，即使经表面处理也不会影响其功能。其中，整个二层网状结构的四周以热压或超声波或胶黏处理方式密封(图上未示)，可以进一步避免格网纤维及颗粒的释放。65.如图1所示，本发明的载体结构100包含网状结构单元30，该网状结构单元30包含：至少一第一网层10，其具有由多条第一经线101及多条第一纬线102彼此交织所形成的多个第一网孔11，所述第一网层10具有生物兼容性及亲水性；至少一第二网层20，其具有由多条第二经线201及多条第二纬线202交织所形成的多个网孔21。第二网层20是平行地设置于所述第一网层10之上或之下。其中，多个第二网孔21的孔径大于多个第一网孔11的孔径，并且，多个第一网孔11的开口方向垂直于第一经线101及第一纬线102，而多个第二网孔21的开口方向垂直于第二经线201及第二纬线202。66.然而，本发明并不限于此，网状结构可包含两层第一网层10及一层第二网层20，如图2所示。图2为本发明另一实施例的新颖的载体结构示意图，其中该结构由三层网状结构所制成。顶部两层具有较小的孔洞尺寸(30μm至800μm)，而底部层具有较大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。顶部两层是由易于表面处理的格网材料所制成，例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)，而底部层是由可支撑性的格网材料所制成，可由例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,pe)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,ptfe)或尼龙(nylon)的材料所制成，其具刚性和支撑性且可于建构基质床时作为间隔物及支撑物。顶部两层网状结构经表面处理为具有生物兼容性(biocompatible)及亲水性(hydrophilic)，从而使细胞贴附于其上并生长。底部的网层可作为间隔物，可不须经表面处理，即使经表面处理也不会影响其功能。其中，整个三层网状结构的四周以热压或超声波或胶黏处理方式密封，可以进一步避免格网纤维及颗粒的释放。67.在图2中，第二网层20是设置于两层第一网层10之下，然而本发明并不限于此，第二网层20可依需求而设置于两层第一网层10中间、或设置于两层第一网层10之上。68.在本发明的另一实施例中，网状结构可包含三层第一网层10及一层第二网层20，如图3所示。图3为本发明又一实施例的新颖的载体结构示意图，其中该结构由四层网状结构所制成。顶部三层具有较小的孔洞尺寸(30μm至800μm)，而底部层具有较大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。顶部三层是由易于表面处理的格网材料所制成，例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)，而底部层是由可支撑性的格网材料所制成，可由例如聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,pe)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,ptfe)或尼龙(nylon)的材料所制成，其具刚性和支撑性且可于建构基质床时作为间隔物及支撑物。顶部三层网状结构经表面处理为具有生物兼容性(biocompatible)及亲水性(hydrophilic)，从而使细胞贴附于其上并生长。底部的网层可作为间隔物，可不须经表面处理，即使经表面处理也不会影响其功能。其中，整个四层网状结构的四周以热压或超声波或胶黏处理方式密封，可以进一步避免格网纤维及颗粒的释放。69.在图3中，第二网层20是设置于三层第一网层10之下，然而本发明并不限于此，第二网层20可依需求而设置于三层第一网层10的任两层之间、或设置于三层第一网层10之上。70.其中，在第一网层10中，可依需求调整每一第一经线101及第一纬线102之间的间距而改变多个第一网孔11的孔径为全部相同或部分相同。在另一实施例中，第二网层20中的第二经线201及第二纬线202之间的间距也可依需求而调整以使多个第二网孔21的孔径为全部相同或部分相同。此外，作为经线或纬线的纱线的直径远大于细胞，可轻易地由细胞液中过滤而和细胞分离。该网状织物内纱线的宽度可为50μm到1000μm,更精确地来说，该纱线宽度可为50μm到500μm。其宽度远大于细胞直径(约5-20μm)，因此即使由网状织物内脱离，也容易以过滤方式与细胞分离。此外，如图4所示，第一网层10的周边与第二网层20的周边是以热压、超声波或胶黏的方式封合(见图4周边处的孔洞因热压使网材融熔填入孔洞中的部分)，通过这样的设置可避免在细胞收获时形成或产生额外的颗粒，举例而言，来自载体的颗粒被释放。71.作为支撑或间隔的第二网层20具有刚性，举例而言，可由聚丙烯(polypropylene)或尼龙(nylon)所制成，且具有多孔，可设置于供细胞贴附及生长的网状结构的上方或下方或各生长的网状结构中间，如图5、图6及图7所示。当整个培养载体卷曲(如图5及图6所示)或堆栈(如图7所示)或充填，可设置于生物反应器(例如bellocell或tidecell生物反应器)中形成为填充床。72.图5为本发明另一实施例的新颖的载体结构示意图，其中可以将多层网状结构单元30卷曲为柱状而建构载体200作为基质床，其中底部网层作为各结构之间的间隔物以使培养基或氧气可于细胞培养时自由地流动。而本发明并不仅限于一个柱状载体结构，如图6所示，载体210可通过多个卷曲为柱状的网状结构单元30而建构。图7为本发明又一实施例的新颖的载体结构示意图，其中可以将多层网状结构单元30彼此依序堆栈于容器中而建构载体300作为基质床。其中多层网状结构单元30可被切割为任意形状的薄片，其尺寸较佳为2cm×2cm至2m×2m，因而得以形成基质床。然而，本发明并不以此为限制，在本发明的另一实施例中，更可将多个网状结构单元30随机的堆栈而形成堆栈体以作为基质床(可参考图10)。73.图8为本发明一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图，请同时参考图1，载体结构经卷曲或堆栈或充填以在生物反应器中形成基质床。在本实施例中，网状结构单元是由一层亲水性网状结构(第一网层10)及一层未经处理作为间隔物的网层(第二网层20)所构成。作为间隔物的网层具有较大的孔洞尺寸并提供支撑性，可使培养基、溶液、空气自由地穿透。74.图9为本发明另一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图，请同时参考图2，该载体结构经卷曲或堆栈或充填以在生物反应器中形成基质床。在本实施例中，网状结构单元是由两层亲水性网状结构(第一网层10)及一层未经处理作为间隔物的网层(第二网层20)所构成。作为间隔物的网层具有较大的孔洞尺寸且可使培养基、溶液、空气自由地穿透。75.图10为本发明一实施例的新颖的载体结构的剖面微观示意图，请同时参考图3，该载体结构经卷曲或堆栈或充填以在生物反应器中形成基质床。在本实施例中，网状结构单元是由三层亲水性网状结构(第一网层10)及一层未经处理作为间隔物的网层(第二网层20)所构成。作为间隔物的网层具有较大的孔洞尺寸且可使培养基、溶液、空气自由地穿透。76.供细胞贴附及生长的网状结构(第一网层10)可由任何天然或人造聚合物所制成，但优选的可为聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)，其较易于表面处理，由于网状结构的开口尺寸精确且一致(可参考图1至图3，第一网层10的网孔11的开口方向垂直于第一经线101及第一纬线102，而第二网层20的网孔21的开口方向垂直于第二经县201及第二纬线202，第一网层10的网孔11与第二网层20的网孔21的开口方向一致)，因而可优化细胞培养并提供更一致的表现。由于多层的网状结构上的开口皆朝向相同的方向，其可有利于细胞从生长表面释放及被收集。该由供细胞贴附及生长的一层或多层网状结构及用于支撑或间隔的网层所结合的多层的网状结构可在其周围经由热压、超声波或胶黏处理的方式封合，可以避免或降低纤维或颗粒的释放。77.供细胞贴附及生长的网状结构(第一网层10)的多孔结构具有30μm至800μm的孔径。较佳地，第一网层10的孔径可以在50μm至200μm的范围内。而用于支撑及间隔的网层(第二网层20)则具有1mm至10mm的孔径。更优选地，第二网层20的孔径可以在2mm至5mm的范围内。78.本发明的载体结构可最大化细胞的生长表面积，可促进细胞贴附及细胞增殖、更有利于细胞脱落因而可提供最大化的细胞密度及细胞产物。79.本发明所提供的新颖的生长表面在符合本发明所保护范围的情况下可依需求而具有任意尺寸、形状、形式、结构或几何构型。该生长表面可为任何合适的形式，例如，可为粒状(pellet)、条状(strip)、片状(sheet)或任何三维结构。在一实施例中，网状结构单元30可呈现为片状，且可被卷曲以形成一柱体(column)型态的载体200(如图5所示)或多个柱体型态的载体210(如图6所示)，可设置于培养槽、培养容器或生物反应器(例如bellocell或tidecell生物反应器)内。这些网状结构具有较大的尺寸以便于卷曲而形成单一固定床单元(single fixed bed unit)，而非局限于限定的区域放置小块载体以形成固定床。由网状织物所制成的薄片尺寸可为1cm(高)×20cm(宽)至10m(高)×100m(宽)，其尺寸取决于固定床的大小。更精确地，由网状织物所制成的薄片尺寸可为3cm(高)×50cm(宽)至2m(高)×20m(宽)。80.在另一实施例中，网状结构单元30可为片状的形式且被依序堆栈以形成一柱体型态的载体300或多个柱体，如图7所示。其可被设置于培养槽、培养容器或生物反应器(例如bellocell或tidecell生物反应器)内。这些网状结构具有较大的尺寸以便于卷曲而形成单一固定床单元(single fixed bed unit)，而非局限于限定的区域放置小块载体以形成固定床。片状的网状结构可为尺寸为1cm×1cm至2m×2m的正方形、或直径为1cm至2m的圆形。然而，并不限于此，可依固定床的尺寸及形状而调整网状结构为任意的形状及尺寸。更精确地，片状的网状织物的尺寸可为5cm×5cm至0.5m×0.5m的正方形、或直径为5cm至0.5m的圆形。81.当卷曲本发明的载体结构并设置于tidecell培养系统中时，其可提供最大化的生质生产(biomass production)结果。这是由于tidecell培养系统所使用的培养机制为tidemotiontm，其是间歇性地使培养载体沉浸及暴露于培养基中，在这样的培养机制下，即使将填充床紧密地堆栈(如卷曲或堆栈或充填)，仍可使氧气进入基质床而不会导致细胞溺毙(drowning of cells)。其他的细胞培养生物反应器并无法在如此高密度的填充条件下进行细胞培养。因此，本发明结合bellocell或tidecell细胞培养系统可在性能上达到最大的效果。82.对于所属领域具技术人员而言，可理解的是，生长表面的某些特征可能会对其性能产生影响。载体或生长表面，例如，其表面特性、载体密度、尺寸、毒性(toxicity)及刚性(rigidity)皆会影响生长表面的性能，从而影响细胞培养的表现(特别是细胞密度及整体的细胞产量)。具体而言，生长表面上的孔洞尺寸会影响细胞生长的表现。第一网层10的较佳的孔洞尺寸约为30μm至800μm。83.于此，所述培养的细胞包含大部分的真核细胞，更具体来说为动物细胞，再更具体来说为哺乳类细胞。举例而言，可为真皮纤维母细胞(dermal fibroblasts)、由骨随分离的间质干细胞(mesenchymal stem cells)、购自wharton’s jelly的间质干细胞、由脂肪组织分离的脂肪间质干细胞等。84.细胞生长后，可以依常规的细胞收集程序，通过胰蛋白酶处理(trypsinization)或其他酶处理，例如胶原蛋白酶(collagenase)、accumax、accutase或tryple等。85.实例1：材料准备86.本实例为将细胞生长于本发明所提供的载体结构上。87.材料及方法：准备网孔尺寸为3mm×3mm的聚丙烯(polypropylene,pp)网层、以及网孔尺寸为200μm×200μm的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,pet)网层，每一整个网层的大小为43cm(长)×3cm(宽)。两层pet网层设置于一层pp网层上，接着以热压方式将其周边热封,然后将此结构物进行表面亲水处理,接着将其卷曲为直径约4cm且高度为3cm的柱体型态的载体200。将该柱体载体200设置于bellocell培养瓶(培养腔室400)中(cesco bioengineering co.,ltd.)，并使用γ射线以25kgy至35kgy的剂量范围灭菌，如图11所示。将载体结构卷曲为柱状的微观结构如图9所示。其中，在卷曲成为柱体之前，将层叠的二层pet网层和一层pp网层以热压方式热压网层四周，以使得多层网层的四周压合成封闭边。88.实例2：细胞培养89.使用由人类wharton's jelly中分离的间质干细胞(mscs)约3×107的数量于100ml的培养基中，并将其种入(seed)上述具有本发明的载体结构的bellocell瓶中3小时；在确认种植率(seeding efficiency)超过90％后，添加400ml的新鲜培养基使得总培养基为500ml；接着将上述bellocell瓶安装至bellostage-3000机器(cesco bioengineering co.,ltd.)，并使用以下参数：上升速度：1mm/s；t_h：10秒；下降速度：1mm/s；b_h：30秒,在摄氏37度及5％co2浓度下进行30分钟；在培养第4天及第8天时检查细胞生长状况，确认细胞生长已达融合(confluency)后，在第8天进行细胞收获(harvest)。90.本发明所保护的载体的型态也可为由多个网状结构单元随机堆栈而形成的堆栈体，如图12所示，其为本发明一实施例的新颖的载体结构的使用示意图。其中，网状结构单元30可为条状，且是随机地堆栈(或充填)于培养腔室400中，以于bellocell(cesco bioengineering co.,ltd)中形成填充床，以用于细胞培养用。91.图13为间叶干细胞(mesenchymal stem cells)生长于本发明的载体结构的部分放大示意图，其中细胞以致密及3d结构形式生长。请同时参考图2和图13，在本实施例中，载体结构是以两层网状结构(pet)及一层网层(pp)所构成，其中第二网层的网孔21较第一网层的网孔11大，故在显微镜下的放大显示中，网孔21的范围内可以二个网孔11重叠，且细胞生长于其间。而图14为间叶干细胞(mesenchymal stem cells)生长于本发明的载体结构的示意图，请同时参考图3和图14，其中细胞以致密及3d结构形式生长，在本实施例中，载体结构是以三层网状结构(pet)及一层网层(pp)所构成，故重叠三层的第一网层在显微镜的放大显示下较为暗沉。92.图15为使用两层网状结构(pet)及一层网层(pp)所构成的载体的实施例在细胞收获后将其中一层pet网状结构剥离出来进行观察的载体结构示意图，可同时参考图2和图15，可发现在细胞收获后并无观察到残留的细胞。图16为使用三层网状结构(pet)及一层网层(pp)所构成的载体的实施例在细胞收获后将其中一层pet网状结构剥离出来进行观察的载体结构示意图，可同时参考图3和图16，可发现，在细胞收获后仅在有限的区域可观察到一些细胞外基质(extracellular matrixes)及少量细胞。93.实例3：细胞/组织释放94.在细胞生长达到融合后，以d-pbs冲洗生长表面3次，且接着将胰蛋白酶/edta浸没生长表面5分钟；在细胞与生长表面分离之前，将胰蛋白酶/edta溶液移除；轻敲并摇晃bellocell瓶并使生长表面撞击bellocell瓶的瓶壁，以迫使细胞分离，接着再以d-pbs冲洗，重复轻敲/摇晃及冲洗的动作3次；接着收集所有的产物，进行离心、再悬浮(re-suspend)、以及检查细胞数目及存活状况。结果显示于图17。根据数据显示，使用本发明的载体结构的每一个bellocell瓶中生长的细胞密度可达到9×107。于此，使用两层pet网层及一层pp网层的载体(组别1)、以及三层pet网层及一层pp网层的载体(组别2)，两者的尺寸皆为直径为4cm且高度为3cm。通过检查生长表面上的染色细胞来计算细胞回收率。通过估算整体细胞的生产率，若增加基质床以填充bellocell瓶的整个基质床空间，其中的细胞生产率可能超过8×108。与bionoc ii载体相比，其仅能获得2×108个细胞，回收率约为70～80％(未显示)。使用本发明的载体可使细胞生产率提升四倍。此外，细胞收获后并没有观察到人工颗粒，如图18所示。有关于颗粒释放的问题，使用bionoc ii载体的bellocell瓶在收获细胞后可能会发现14,000根纤维。相较之下，本发明的载体不需额外的程序去除人工颗粒。95.综上所述，本发明所提供的用于细胞培养的载体具有三维多孔结构，其是由具有不同孔径的多层网状结构所构成，这些网状层的开口方向一致，可强化细胞生长表面、促进细胞的固定、有利于细胞回收、且可因此增加细胞产量。此外，本发明所提供的载体结构相较于传统使用无纺布的载体，可在收获细胞时降低额外颗粒的产生，降低生产成本及减少时间的浪费。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!