检测细胞外嘌呤受体配体的系统和导入该系统的非人动物的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及利用以嘌呤受体配体为配体的受体蛋白的信号传导检测细胞外嘌呤受体配体的系统和导入了该系统的基因修饰非人动物。此外，涉及应用导入了检测细胞外嘌呤受体配体的系统的基因修饰非人动物监测疾病的病理状态和评价化合物的方法等。背景技术：2.嘌呤受体(purinergic receptor)是以腺苷以及atp等核苷酸类为配体的一组细胞表面受体。据报告嘌呤受体牵涉以免疫异常为首的各种疾病，以嘌呤受体为目标的嘌呤受体抑制剂和嘌呤受体激动剂等的开发也在进行。作为嘌呤受体配体，已知以atp和腺苷为首的包含它们的代谢产物的核苷酸，据报告通过这些嘌呤受体配体和嘌呤受体的信号传导途径牵涉神经传导、肌肉收缩、痛觉、味觉、炎症反应等多种生理现象。3.以atp和腺苷为首的嘌呤受体配体在生物体中作为信号传导物质发挥功能，因此，尝试生物体内产生和分解等行为的验证和浓度测定等。作为其一个实例，已知伴随细胞死亡细胞内大量atp向细胞外漏出，据报告其发挥作为炎症过程中重要的危险信号的作用。此外据报告，由于癌组织中癌细胞细胞死亡时细胞内大量atp也向细胞外漏出，癌组织中atp浓度比正常组织高(非专利文献1、3、4)。4.作为测定包含生物体中的细胞外嘌呤受体配体的生物体内物质的方法，列举微透析法。该方法应用hplc等分析从组织回收的组织液或细胞外液。在测定对象是atp的情况下，除通过hplc等的分析方法以外，也可以利用通过荧光素-荧光素酶分析测定的方法。但是，即使在应用上述方法的情况下，也难以明确区分检测、测定的嘌呤受体配体来自细胞内还是来自细胞外，此外，不能实时测定生物体内的嘌呤受体配体浓度。进一步，在微透析法中，向组织插入针回收组织液，此时，有时产生刺入部位的细胞死亡或组织的坏死。在这样的情况下，存在测定技术引起的假象影响测定结果的问题。在测定物质是atp的情况下，已知其伴随细胞死亡和细胞的炎症反应分泌，不太适合通过本方法测定。在专利文献2中报告了应用表达融合蛋白的非人哺乳动物观察生物体内的atp分布和变动的方法，该融合蛋白是向atp合成酶的ε亚基的氨基末端侧和羧基末端侧分别结合可成为荧光共振能量转移中的供体和受体的2种荧光蛋白而成的。但是，该方法中关注于细胞内的atp，不能评价细胞外atp。5.此外，作为测定生物体中细胞外atp的尝试，报告了应用在细胞外表达荧光素酶的基因修饰细胞的方法(非专利文献1、2，专利文献1)。在前述方法中，前述基因修饰细胞在暴露于细胞外atp浓度高的环境下的情况下通过荧光素-荧光素酶反应发出信号，通过检测该信号测定生物体中的细胞外atp。但是，在该方法中，需要将该细胞移入生物体内，但难以将移入生物体内的细胞在全身到处分布，在不知atp何时向细胞外放出的情况下，存在难以判断何时将该细胞移入为好的问题。此外，也有在移入的细胞已通过宿主免疫系统排除的情况下不能使用的问题。进一步，在上述荧光素-荧光素酶反应中，可以测定的仅为atp，不能测定其它嘌呤受体配体。6.据报告不限于atp的嘌呤受体配体作为细胞外信号传导物质与各种疾病相关，但关于何种疾病中、以何种时间表、何种细胞外嘌呤受体配体如何发挥功能方面，不知晓的事项众多。因此，为了评价生物体和病理状态中细胞外嘌呤受体配体的功能，需要可低侵入性并且经时、全身性检测细胞外嘌呤受体配体的评价系统，但这样的评价系统尚不存在。7.现有技术文献8.专利文献9.专利文献1：wo2006/12623110.专利文献2：wo2015/10810211.非专利文献12.非专利文献1：patrizia et.al.(2008)plos one.3，e259913.非专利文献2：francesco di virgilio et.al.(2016)methods mol biol.1417，115-2914.非专利文献3：idzko m et.al.(2007)nat med.aug；13(8)：913-915.非专利文献4：lommatzsch m et.al.(2010)am j respir crit care med.may 1；181(9)：928-3416.发明概述17.发明要解决的问题18.本发明鉴于如上述的状况作出，其目的是提供可低侵入性并且经时、全身性检测细胞外嘌呤受体配体的评价系统。更具体地，本发明的目的是提供全身性表达用于检测、评价细胞外嘌呤受体配体的报告蛋白的基因修饰非人动物，此外构建检测细胞外嘌呤受体配体的评价系统。进一步，本发明的目的是提供应用检测细胞外嘌呤受体配体的评价系统检测各种疾病和监测各种疾病的病理状态以及筛选这些疾病的治疗药的方法，该评价系统利用前述基因修饰非人动物和报告蛋白。19.用于解决问题的手段20.本发明人为了解决上述问题反复深入研究，结果发现，向作为嘌呤受体的p2y受体(p2y嘌呤受体)和细胞内与其结合的β抑制蛋白(β-arestin)分别融合split荧光素酶(split luciferase)的各亚基蛋白，制备全身表达它们的基因修饰小鼠，可以检测细胞外atp。即，根据本基因修饰，细胞外atp与p2y受体结合时，细胞内p2y受体和β抑制蛋白结合，分别融合的亚基蛋白适当会合，荧光素酶被再构建、生成。荧光素酶在适当底物的存在下可以表达发光信号，通过检测该信号可以检测细胞外atp。此外，应用从前述基因修饰小鼠分离的细胞进行atp的测定时，确认检测的发光信号强度可以浓度依赖性地定量测定atp浓度。由此，也可用于体外的atp浓度测定和筛选等。进一步发现，研究本基因修饰小鼠的生物体中细胞外atp的检测时，可以浓度依赖性地检测该发光信号，可以非侵入性经时地检测全身的细胞外atp。21.本发明基于这样的知识完成，在具体的方式中，例如，涉及以下发明。22.[1]用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的基因修饰非人动物，其中，[0023]前述第1融合蛋白包含与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白，[0024]前述第2融合蛋白包含与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白。[0025][2][1]的基因修饰非人动物，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是split报告蛋白的各亚基。[0026][3][2]的基因修饰非人动物，其中，前述split报告蛋白是split荧光素酶。[0027][4][2]的基因修饰非人动物，其中，前述split报告蛋白是split荧光蛋白。[0028][5][1]的基因修饰非人动物，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是产生荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)的蛋白的组合。[0029][6][1]～[5]的任一项的基因修饰非人动物，其中，与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白是抑制蛋白或其部分。[0030][7][1]～[6]的任一项的基因修饰非人动物，其中，前述膜蛋白是g蛋白偶联受体(gpcr)或其部分。[0031][8][7]的基因修饰非人动物，其中，前述gpcr是p1受体。[0032][9][8]的基因修饰非人动物，其中，前述p1受体选自腺苷a1受体、腺苷a2a受体、腺苷a2b受体、腺苷a3受体。[0033][10][8]或[9]的基因修饰非人动物，其中，前述嘌呤受体配体是p1受体配体。[0034][11][10]的基因修饰非人动物，其中，前述p1受体配体选自腺苷、amp、adp、atp。[0035][12][7]的基因修饰非人动物，其中，前述gpcr是p2受体。[0036][13][12]的基因修饰非人动物，其中，前述p2受体是p2y受体。[0037][14][13]的基因修饰非人动物，其中，前述p2y受体选自p2y1、p2y2、p2y4b、p2y6、p2y11、p2y12、p2y13、和p2y14。[0038][15][12]～[14]的任一项的基因修饰非人动物，其中，前述嘌呤受体配体是p2受体配体。[0039][16][15]的基因修饰非人动物，其中，前述p2受体配体是具有核苷酸骨架的分子。[0040][17][15]或[16]的基因修饰非人动物，其中，前述p2受体配体选自amp、adp、atp、utp、udp、udp葡萄糖。[0041][18][15]～[17]的任一项的基因修饰非人动物，其中，前述p2受体配体是atp。[0042][19][1]～[18]的任一项的基因修饰非人动物，其中，前述第1融合蛋白和第2融合蛋白在全身表达。[0043][20][1]～[19]的任一项的基因修饰非人动物，其中，前述非人动物是非人哺乳动物。[0044][21][20]的基因修饰非人动物，其中，前述非人动物是啮齿类。[0045][22][20]或[21]的基因修饰非人动物，其中，前述非人动物是小鼠。[0046][23][1]～[22]的任一项的基因修饰非人动物，其为疾病模型动物。[0047][24][23]的基因修饰非人动物，其中，疾病选自癌、急性炎症、慢性炎症、传染病、纤维化、物理或化学器官损害、和抗癌剂等药剂引起的细胞损害。[0048][25]用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的动物细胞，其中，[0049]前述第1融合蛋白包含与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白，[0050]前述第2融合蛋白包含与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白。[0051][26][25]的动物细胞，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是split报告蛋白的各亚基。[0052][27][26]的动物细胞，其中，前述split报告蛋白是split荧光素酶。[0053][28][26]的动物细胞，其中，前述split报告蛋白是split荧光蛋白。[0054][29][25]的动物细胞，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是产生荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)的蛋白的组合。[0055][30][25]～[29]的任一项的动物细胞，其中，与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白是抑制蛋白或其部分。[0056][31][25]～[30]的任一项的动物细胞，其中，前述膜蛋白是g蛋白偶联受体(gpcr)或其部分。[0057][32][25]～[31]的任一项的动物细胞，其中，前述gpcr是p1受体。[0058][33][32]的动物细胞，其中，前述p1受体选自腺苷a1受体、腺苷a2a受体、腺苷a2b受体、腺苷a3受体。[0059][34][32]或[33]的动物细胞，其中，前述嘌呤受体配体是p1受体配体。[0060][35][34]的动物细胞，其中，前述p1受体配体选自腺苷、amp、adp、atp。[0061][36][25]～[31]的任一项的动物细胞，其中，前述gpcr是p2受体。[0062][37][36]的动物细胞，其中，前述p2受体是p2y受体。[0063][38][37]的动物细胞，其中，前述p2y受体选自p2y1、p2y2、p2y4b、p2y6、p2y11、p2y12、p2y13、和p2y14。[0064][39][37]或[38]的动物细胞，其中，前述嘌呤受体配体是p2受体配体。[0065][40][39]的动物细胞，其中，前述p2受体配体是具有核苷酸骨架的分子。[0066][41][39]或[40]的动物细胞，其中，前述p2受体配体选自amp、adp、atp、utp、udp、udp葡萄糖。[0067][42][39]～[41]的任一项的动物细胞，其中，前述p2受体配体是atp。[0068][43][25]～[42]的任一项的动物细胞，其中，前述动物是哺乳动物。[0069][44][25]～[43]的任一项的动物细胞，其中，前述动物是啮齿类。[0070][45][25]～[44]的任一项的动物细胞，其中，前述动物是小鼠。[0071][46]用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的检测试剂盒，其包含[25]～[45]的任一项的动物细胞。[0072][47]用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的基因修饰动物细胞的制备方法，其包括：[0073]向基因组导入编码包含与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白的第1融合蛋白的基因的步骤，以及[0074]向基因组导入编码包含与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白的第2融合蛋白的基因的步骤。[0075][48][47]的制备方法，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是split报告蛋白的各亚基。[0076][49][48]的制备方法，其中，前述split报告蛋白是split荧光素酶。[0077][50][48]的制备方法，其中，前述split报告蛋白是split荧光蛋白。[0078][51][47]的制备方法，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是产生荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)的蛋白的组合。[0079][52][47]～[51]的任一项的制备方法，其中，与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白是抑制蛋白或其部分。[0080][53][47]～[52]的任一项的制备方法，其中，前述膜蛋白是g蛋白偶联受体(gpcr)或其部分。[0081][54][53]的制备方法，其中，前述gpcr是p1受体。[0082][55][54]的制备方法，其中，前述p1受体选自腺苷a1受体、腺苷a2a受体、腺苷a2b受体、腺苷a3受体。[0083][56][54]或[55]的制备方法，其中，前述嘌呤受体配体是p1受体配体。[0084][57][56]的制备方法，其中，前述p1受体配体选自腺苷、amp、adp、atp。[0085][58][53]的制备方法，其中，前述gpcr是p2受体。[0086][59][58]的制备方法，其中，前述p2受体是p2y受体。[0087][60][59]的制备方法，其中，前述p2y受体选自p2y1、p2y2、p2y4b、p2y6、p2y11、p2y12、p2y13、和p2y14。[0088][61][58]～[60]的任一项的制备方法，其中，前述嘌呤受体配体是p2受体配体。[0089][62][61]的制备方法，其中，前述p2受体配体是具有核苷酸骨架的分子。[0090][63][61]或[62]的制备方法，其中，前述p2受体配体选自amp、adp、atp、utp、udp、udp葡萄糖。[0091][64][61]～[63]的任一项的制备方法，其中，前述p2受体配体是atp。[0092][65][47]～[64]的任一项的制备方法，其中，前述第1融合蛋白和第2融合蛋白在全身表达。[0093][66][47]～[65]的任一项的制备方法，其中，前述动物细胞是哺乳动物细胞。[0094][67][47]～[66]的任一项的制备方法，其中，前述动物细胞是啮齿类细胞。[0095][68][47]～[67]的任一项的制备方法，其中，前述动物细胞是小鼠细胞。[0096][69][47]～[68]的任一项的制备方法，其包括检测报告蛋白、基于其检测量筛选。[0097][70]用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的基因修饰非人动物的制备方法，其包括：[0098]向基因组导入编码包含与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白的第1融合蛋白的基因的步骤，以及[0099]向基因组导入编码包含与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白的第2融合蛋白的基因的步骤。[0100][71][70]的制备方法，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是split报告蛋白的各亚基。[0101][72][71]的制备方法，其中，前述split报告蛋白是split荧光素酶。[0102][73][71]的制备方法，其中，前述split报告蛋白是split荧光蛋白。[0103][74][70]的制备方法，其中，第1报告蛋白和第2报告蛋白是产生荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)的蛋白的组合。[0104][75][70]～[74]的任一项的制备方法，其中，与前述配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白是抑制蛋白或其部分。[0105][76][70]～[75]的任一项的制备方法，其中，前述膜蛋白是g蛋白偶联受体(gpcr)或其部分。[0106][77][76]的制备方法，其中，前述gpcr是p1受体。[0107][78][77]的制备方法，其中，前述p1受体选自腺苷a1受体、腺苷a2a受体、腺苷a2b受体、腺苷a3受体。[0108][79][77]或[78]的制备方法，其中，前述嘌呤受体配体是p1受体配体。[0109][80][77]～[79]的任一项的制备方法，其中，前述p1受体配体选自腺苷、amp、adp、atp。[0110][81][76]的制备方法，其中，前述gpcr是p2受体。[0111][82][81]的制备方法，其中，前述p2受体是p2y受体。[0112][83][82]的制备方法，其中，前述p2y受体选自p2y1、p2y2、p2y4b、p2y6、p2y11、p2y12、p2y13、和p2y14。[0113][84][81]～[83]的任一项的制备方法，其中，前述嘌呤受体配体是p2受体配体。[0114][85][84]的制备方法，其中，前述p2受体配体是具有核苷酸骨架的分子。[0115][86][84]或[85]的制备方法，其中，前述p2受体配体选自amp、adp、atp、utp、udp、udp葡萄糖。[0116][87][84]～[86]的任一项的制备方法，其中，前述p2受体配体是atp。[0117][88][70]～[87]的任一项的制备方法，其中，前述第1融合蛋白和第2融合蛋白在全身表达。[0118][89][70]～[88]的任一项的制备方法，其中，前述非人动物是非人哺乳动物。[0119][90][70]～[89]的任一项的制备方法，其中，前述非人动物是啮齿类。[0120][91][70]～[90]的任一项的制备方法，其中，前述非人动物是小鼠。[0121][92][70]～[91]的任一项的制备方法，其包括检测报告蛋白、基于其检测量筛选。[0122][93]疾病的发病部位的检测方法，其包括检测[23]或[24]的基因修饰非人动物中的报告蛋白的步骤。[0123][94]疾病的发病时期的检测方法，其包括检测[23]或[24]的基因修饰非人动物中的报告蛋白的步骤。[0124][95]疾病的经过的监测方法，其包括检测[23]或[24]的基因修饰非人动物中的报告蛋白的步骤。[0125][96]疾病的预防药或疾病治疗药的药效的评价方法，其包括向[23]或[24]的基因修饰非人动物施用前述预防药或疾病治疗药、基于施用前后报告蛋白的检测量的变化评价前述预防药或疾病治疗药的药效的步骤。[0126][97]疾病的预防药或疾病治疗药的毒性的评价方法，其包括向[23]或[24]的基因修饰非人动物施用前述预防药或疾病治疗药、基于施用前后报告蛋白的检测量的变化评价前述预防药或疾病治疗药的毒性的步骤。[0127][98]疾病的预防药或疾病治疗药的筛选方法，其包括向[23]或[24]的基因修饰非人动物施用被测物质、基于施用前后报告蛋白的检测量的变化筛选对疾病的预防或治疗有效的物质的步骤。[0128][99]以嘌呤受体配体为指标的药物分子的效果的评价方法，其包括向[1]～[24]的任一项的基因修饰非人动物施用前述药物分子或向[25]～[45]的任一项的基因修饰动物细胞添加前述药物分子、基于施用或添加前后报告蛋白的检测量的变化评价前述药物分子的效果的步骤。[0129][100]以嘌呤受体配体为指标的药物分子的毒性的评价方法，其包括向[1]～[24]的任一项的基因修饰非人动物施用前述药物分子或向[25]～[45]的任一项的基因修饰动物细胞添加前述药物分子、基于施用或添加前后报告蛋白的检测量的变化评价前述药物分子的毒性的步骤。[0130][101]嘌呤受体配体依赖性药物分子的效果的评价方法，其包括向[1]～[24]的任一项的基因修饰非人动物施用前述药剂或向[25]～[45]的任一项的基因修饰动物细胞添加前述药物分子、在由报告蛋白的检测量表示的嘌呤受体配体的存在下评价前述药物分子的效果的步骤。[0131][102]嘌呤受体配体依赖性药物分子的筛选方法，其包括向[[1]～[24]的任一项的基因修饰非人动物施用被测物质、或向[25]～[45]的任一项的基因修饰动物细胞添加前述药物分子，在由报告蛋白的检测量表示的嘌呤受体配体的存在下基于前述药物分子的效果筛选目的物质的步骤。[0132]发明效果[0133]根据本发明，可以提供可低侵入性并且经时、全身地检测细胞外嘌呤受体配体的评价系统。[0134]本发明可提供可以非侵入性经时地检测全身的嘌呤受体配体的基因修饰非人动物，若利用本发明的基因修饰非人动物，可确定嘌呤受体配体牵涉的疾病的发病部位和研究疾病的发病时期，进一步，也可在应用该小鼠的药剂筛选中应用，因此，可有效进行嘌呤受体配体牵涉的疾病的治疗药剂的开发。[0135]附图简述[0136][图1]图1显示p2y11-split luc(c末端)敲入载体的概要。[0137][图2]图2显示arrestin-split luc(n末端)敲入载体的概要。[0138][图3]图3是显示向p2y11-split luc(c末端)(p2y)和arrestin-split luc(n末端)(arrb)双敲入小鼠皮下施用atp和d-荧光素底物溶液的混合液、测定发光信号强度的结果的摄影图。p2y：p2y11-split luc(c末端)敲入，arrb：arrestin-split luc(n末端)敲入，wt：野生型。[0139][图4]图4显示用各种浓度的atp和d-荧光素底物处理来自p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的成纤维细胞、将检测的发光信号可视化的分析数据。[0140][图5]图5是用各种浓度的atp和d-荧光素底物处理来自p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的成纤维细胞、显示检测的发光信号强度的曲线图。[0141][图6]图6显示向p2y11-split luc(c末端)(p2y)和arrestin-split luc(n末端)(arrb)双敲入小鼠皮下施用各种浓度的atp和d-荧光素底物溶液的混合液、测定发光信号强度的结果的摄影图。[0142][图7]图7是向p2y11-split luc(c末端)(p2y)和arrestin-split luc(n末端)(arrb)双敲入小鼠皮下施用各种浓度的atp和d-荧光素底物溶液的混合液、显示发光信号强度的曲线图。[0143][图8]图8是显示p2y11-split luc(c末端)(p2y)和arrestin-split luc(n末端)(arrb)双敲入小鼠中、将流体动力学注射引起的伴随肝细胞损伤肝脏中的atp漏出通过发光信号强度的测定非侵入性可视化的结果的摄影图。[0144][图9]图9是分别显示p2y11-split luc(c末端)(p2y)和arrestin-split luc(n末端)(arrb)双敲入小鼠中、将流体动力学注射引起的伴随肝脏中的癌化的atp漏出(a)通过发光信号强度的测定非侵入性可视化的结果、以及(b)通过摘出的肝脏中发光信号强度的测定可视化的结果的摄影图。[0145]用于实施发明的方式[0146]1.基因修饰非人动物[0147]本发明涉及用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的基因修饰非人动物。[0148](1-1)第1融合蛋白[0149]本发明中的“第1融合蛋白”包含与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白，或由这些蛋白组成。[0150]在第1融合蛋白中，与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白可以直接连接，或者，也可以经由接头连接。与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白可以任意顺序连接，只要第1融合蛋白和第2融合蛋白可以如下述相互作用。在一个方式中，与嘌呤受体配体结合的膜蛋白和第1报告蛋白可以从n末端以此顺序连接。“接头”可以利用以往公知的任意接头，例如，可以利用肽接头。肽接头的氨基酸数目和种类没有特别限定。[0151](1-1-1)与嘌呤受体配体结合的膜蛋白[0152]本发明中的“与嘌呤受体配体结合的膜蛋白”(以下有时简单记载为“膜蛋白”)意味着与细胞膜结合或贯穿细胞膜存在的蛋白，即可与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的蛋白。本发明中的膜蛋白只要可与细胞外存在的嘌呤受体配体结合即可，没有特别限定，可以优选利用作为嘌呤受体的g蛋白偶联型受体(g protein-coupled receptor，以下记载为“gpcr”)和配体依赖性离子通道型受体等、或它们的一部分。优选地，膜蛋白是作为嘌呤受体的gpcr。[0153]gpcr主要是7次跨膜型受体，具有7个α螺旋结构贯穿细胞质膜、n末端区位于细胞外、c末端区位于细胞内的结构。配体与细胞外区结合时gpcr活化产生结构变化，细胞内区通过g蛋白偶联型受体激酶的作用磷酸化。[0154]作为为嘌呤受体的gpcr，列举p1受体和p2受体，但不限于这些。优选地，膜蛋白是p1受体和p2受体。[0155]作为嘌呤受体的p1受体是以腺苷、amp、adp、atp为配体的gpcr，可以分类为a1受体、a2a受体、a2b受体、和a3受体。在本发明中，可以将从它们之中选择的一个或多个受体用作膜蛋白。[0156]作为嘌呤受体的p2受体是以amp、adp、atp、utp、udp、udp葡萄糖为配体的gpcr，优选p2y受体。p2y受体可以分类为p2y1受体、p2y2受体、p2y4b受体、p2y6受体、p2y11受体、p2y12受体、p2y13受体、和p2y14受体。在本发明中，可以将从它们之中选择的一个或多个受体用作膜蛋白。更优选对atp特异性高的p2y2受体、p2y11受体，尤其优选p2y11受体。[0157]在本发明中，与嘌呤受体配体结合的膜蛋白可以利用公知的那种，可以利用ncbi、genbank等公开的数据库中注册的公知的那种。例如，对于属于p1受体家族的a1受体，来自人的那种作为np_000665.1、来自小鼠的那种作为np_001008533.1注册，对于p2y2受体，来自人的那种作为np_002555.3、来自小鼠的那种作为np_001289275.1注册，对于p2y11受体，来自人的那种作为np_002557.2注册。与嘌呤受体配体结合的膜蛋白优选来自与宿主同种的动物。在本发明中，例如，可以将由序列编号9的氨基酸序列表示的p2y11受体作为与嘌呤受体配体结合的膜蛋白利用。[0158]在本发明中，作为“与嘌呤受体配体结合的膜蛋白”，只要可与细胞外存在的嘌呤受体配体结合，也可以利用其类似体和突变体。作为“与嘌呤受体配体结合的膜蛋白”的类似体和突变体，意味着(i)由“与嘌呤受体配体结合的膜蛋白”的氨基酸序列中1～50个、例如1～20个、或1～10个氨基酸缺失、取代、添加或捅入的氨基酸序列组成，并且可与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的蛋白，或者(ii)由与“与嘌呤受体配体结合的膜蛋白”的氨基酸序列具有80％以上、优选地90％以上、更优选地95％以上、进一步优选地99％以上的序列同一性的氨基酸序列组成，并且可与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的蛋白。氨基酸序列的序列同一性可以基于公知方法算出，例如，可以应用blast(basic local alignment search tool at the national center for biological information(美国国立生物学信息中心的基本局部比对检索工具))等、例如缺省设定求得。氨基酸序列的序列同一性可以基于可与嘌呤受体配体结合的全部蛋白算出，或者，也可以基于具有与嘌呤受体配体的结合活性的结合结构域算出。例如，在与特定的嘌呤受体配体结合的受体中的结合结构域的序列同源性高的情况下，由于结合结构域以外的例如跨膜结构域的序列同源性低，即使作为全部膜蛋白的同源性不高的情况下，特定的结合结构域的序列同源也理解为高。[0159]此外，在本发明中，有关膜蛋白应用的术语“它们的一部分”、“其一部分”意味着由膜蛋白的其一部分氨基酸序列组成、并且可与至少细胞外存在的嘌呤受体配体结合的蛋白。作为这样的蛋白，列举由膜蛋白的氨基酸序列中至少与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的必要结构域(例如，与特定的嘌呤受体配体结合的受体中的结合结构域)和与细胞膜结合的必要结构域(例如跨膜结构域)等的一部分结构域组成的那种。关于膜蛋白的各结构域，可以基于ncbi、genbank等公开的数据库中注册的氨基酸序列信息和基因信息等确定。[0160](1-1-2)第1报告蛋白[0161]本发明中的“第1报告蛋白”意味着与后述第2融合蛋白中的第2报告蛋白共同作为报告蛋白发挥功能的蛋白。“共同作为报告蛋白发挥功能”意味着第1报告蛋白和第2报告蛋白接近或结合后才作为报告蛋白发挥功能、成为显示特定分子的表达和定位的指标。作为这样的“共同作为报告蛋白发挥功能”的蛋白，列举split报告蛋白、产生荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)的蛋白的组合。[0162]“split报告蛋白”是分割为2个或其以上的亚基的报告蛋白，在各亚基分离存在的情况下，不显示作为报告蛋白的功能，分割的2个或其以上的亚基接近或结合时，可以再构建报告蛋白、显示功能。“分割为亚基的报告蛋白”若是本来由2个以上亚基组成的蛋白可按每一亚基分割，即使是本来由1个蛋白组成的报告蛋白也可人工分割为多个亚基应用。作为报告蛋白，列举绿色、红色、蓝色或黄色的荧光蛋白和荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶、转化酶、二氢叶酸还原酶、β-内酰胺酶等酶，但不限于这些。作为split报告蛋白的具体实例，列举split荧光素酶。此外，作为另一具体实例，列举split gfp、split yfp、split cyp等split荧光蛋白，但不限于这些。此外，当然可应用已报告的split报告蛋白，也可人工分割和应用特定的报告蛋白。[0163]“fret”意味着下列现象，在第一荧光蛋白(供体)的荧光的波长和第二荧光蛋白(受体)的激发光的波长的谱重叠的2个荧光蛋白接近的情况下，通过第一荧光蛋白的激发吸收的能量用作用于第二荧光蛋白的激发的能量，第二荧光蛋白发出荧光。此外，“bret”是下列现象，利用生物发光蛋白代替fret中的第1荧光蛋白(供体)，若生物发光蛋白和第二荧光蛋白接近，生物发光蛋白要生物发光时其能量用作用于第二荧光蛋白的激发的能量，第二荧光蛋白发出荧光。作为生物发光蛋白，列举荧光素酶。[0164]因此，作为本发明中的“第1报告蛋白”，可以利用split报告蛋白中的一个亚基、或者可产生fret的荧光蛋白的组合中的一个荧光蛋白、或可产生bret的生物发光蛋白和荧光蛋白的组合中的任一蛋白。[0165](1-2)第2融合蛋白[0166]本发明中的“第2融合蛋白”包含可与与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白(以下，有时简单记载为“可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白”)和第2报告蛋白，或由这些蛋白组成。[0167]在第2融合蛋白中，可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白可以直接连接，也可以经由接头连接。可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白和第2报告蛋白可以以任意顺序连接，只要第1融合蛋白与第2融合蛋白可以如下述相互作用。在一个方式中，第2报告蛋白和可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白可以从n末端以此顺序连接。“接头”可以利用以往公知的任意接头，例如，可以利用肽接头。肽接头的氨基酸数目和种类没有特别限定。[0168](1-2-1)可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白[0169]本发明中的“可与与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的前述膜蛋白结合的蛋白”意味着可与上述膜蛋白、即与细胞外存在的嘌呤受体配体结合的那种特异性或选择性结合的蛋白。作为本发明中的这样的蛋白，没有特别限定，可以优选利用膜蛋白的活化调节因子、抗体、受体激酶、转录因子等或它们的一部分。在本发明中的膜蛋白是gpcr的情况下，可以优选利用作为gpcr的活化调节因子的抑制蛋白和g蛋白、gpcr激酶。[0170]“抑制蛋白”是与在配体与细胞外区结合而活化的gpcr中通过g蛋白偶联型受体激酶的作用磷酸化的细胞内区结合、产生gpcr的脱敏化的活化调节因子。抑制蛋白在哺乳类中已知4种亚类，存在抑制蛋白-1、抑制蛋白-2(也称为“β-抑制蛋白-1”)、抑制蛋白-3(也称为“β-抑制蛋白-2”)、抑制蛋白-4(也称为“x-抑制蛋白”)，在本发明中可以优选应用抑制蛋白-2(β-抑制蛋白-1)和抑制蛋白-3(β-抑制蛋白-2)，特别优选联用抑制蛋白-2(β-抑制蛋白-1)和抑制蛋白-3(β-抑制蛋白-2)。通过联用抑制蛋白-2(β-抑制蛋白-1)和抑制蛋白-3(β-抑制蛋白-2)，可以检测它们介导的信号传导两者。[0171]在本发明中，可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白可以利用公知的蛋白，可以利用ncbi、genbank等公开的数据库中氨基酸序列信息和基因信息被注册的公知的蛋白。例如，对于β-抑制蛋白-1和β-抑制蛋白-2，分别地，来自人的那种作为np_004032.2和np_004304.1、来自小鼠的那种作为np_796205.1和np_001258287.1注册。在本发明中可以利用它们。在本发明中，例如，可以将由序列编号10和序列编号11的氨基酸序列表示的β-抑制蛋白-1和β-抑制蛋白-2作为可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白利用。[0172]在本发明中，作为“可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白”，只要可与与配体结合的膜蛋白结合，也可以利用其类似体和突变体。作为“可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白”的类似体和突变体，意味着(a)由“可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白”的氨基酸序列中1～50个、例如1～20个、或1～10个的氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列组成，并且可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白，或者，(b)由与“可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白”的氨基酸序列具有80％以上、优选地90％以上、更优选地95％以上、进一步优选地99％以上的序列同一性的氨基酸序列组成，并且可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白。氨基酸序列的序列同一性可以如上述算出，可以基于可与与配体结合的膜蛋白结合的全部蛋白算出，或者也可以基于可与与配体结合的膜蛋白结合的结合结构域算出。[0173]此外，在本发明中，有关可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白应用的术语“它们的一部分”、“其一部分”意味着由该蛋白的其一部分的氨基酸序列组成、并且至少可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白。作为这样的蛋白，列举由可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白的氨基酸序列中、至少与与配体结合的膜蛋白结合所需的结构域等的一部分结构域组成的那种。例如，在可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白是抗体的情况下，作为其一部分，列举具有与与前述配体结合的膜蛋白的结合活性的抗体的部分片段，列举fab、f(ab’)2、scfv等。[0174](1-2-2)第2报告蛋白[0175]本发明中的“第2报告蛋白”意味着与上述第1融合蛋白中的第1报告蛋白共同发挥报告蛋白的功能的蛋白。作为本发明中的“第2报告蛋白”，可以利用split报告蛋白中与第1报告蛋白不同的亚基、或者可产生fret的荧光蛋白的组合中与第1报告蛋白不同的荧光蛋白、或可产生bret的生物发光蛋白与荧光蛋白的组合中与第1报告蛋白不同的蛋白。[0176](1-3)基因修饰非人动物[0177]本发明中的“基因修饰”以最广义的含义应用，指进行改变宿主具有的核酸序列的所有操作，包括向宿主生物导入异种生物的基因或基因的部分序列、或具有启动子等功能的核酸序列。即，使宿主生物具有的基因的全长或部分序列缺失、以与宿主生物具有的基因具有相同功能的异种基因取代也包含在基因修饰中。此外，将编码特定蛋白的碱基序列应用基因修饰技术进行氨基酸取代、和通过与编码其它蛋白的碱基序列连接制备编码融合蛋白的碱基序列也包含在基因修饰中。[0178]作为本发明中的“非人动物”，不意图特别限定，优选非人哺乳动物。例如，可以将小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类、猴、黑猩猩等非人灵长类、兔、绵羊、牛、猪等其它哺乳动物和鸟类、两栖类、爬虫类、鱼类等用作本发明的非人动物。特别优选啮齿类，最优选小鼠。[0179]本发明的基因修饰非人动物具有表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的细胞，优选地全身具有表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的细胞。[0180]在本发明的基因修饰非人动物中，若表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的细胞的细胞外存在的嘌呤受体配体与第1融合蛋白中的前述膜蛋白结合，第2融合蛋白中可与与前述配体结合的膜蛋白结合的蛋白与其结合。由此，第1融合蛋白中的第1报告蛋白与第2融合蛋白中的第2报告蛋白接近或结合，共同作为报告蛋白发挥功能。通过检测该报告蛋白，可以评价本发明的基因修饰非人动物中细胞外存在的嘌呤受体配体的位置和量等。[0181]利用本发明的基因修饰非人动物的细胞外存在的嘌呤受体配体的检测方法在后述。[0182](1-3-1)基因修饰非人动物的制备方法[0183]本发明的基因修饰非人动物可以应用以往公知的基因修饰方法制备，可以通过将编码上述第1融合蛋白和第2融合蛋白的基因向非人动物基因导入而制备。本说明书中的“基因”意味着dna、rna、或者dna/rna杂交体，只要编码规定蛋白，不特别限定形式。[0184]编码第1融合蛋白的基因可以通过将编码与嘌呤受体配体结合的膜蛋白的基因和编码第1报告蛋白的基因直接或者经由编码接头的碱基序列连接而得到。[0185]编码与嘌呤受体配体结合的膜蛋白的基因可以利用上述公开的数据库中注册的基因信息、应用通过任意的基因文库克隆的那种，或者，也可以应用通过基因合成技术化学制备的那种。[0186]编码第1报告蛋白的基因可以利用市售品，或者，也可以和编码与嘌呤受体配体结合的膜蛋白的基因一起通过基因合成技术化学制备。[0187]此外，编码第2融合蛋白的基因可以通过将编码可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白与第2报告蛋白的基因直接或者经由编码接头的碱基序列连接而得到。[0188]编码可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白的基因可以利用上述公开的数据库中注册的基因信息、应用通过任意的基因文库克隆的那种，或者，也可以应用通过基因合成技术化学制备的那种。[0189]编码第2报告蛋白的基因可以利用市售品，或者，也可与编码可与与配体结合的膜蛋白结合的蛋白的基因共同通过基因合成技术化学制备。[0190]编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因中，分别地，除上述基因外，按需要还可包含转录和翻译的调节序列(例如，启动子序列、增强子序列、剪接受体序列、终止子序列、聚a序列等)、选择标记物基因(例如，新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、白喉毒素a基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因等)、分离和纯化用的标签序列等。[0191]编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因向非人动物的导入方法没有特别限定，可以适当应用例如dna载体(质粒载体、粘粒载体、和细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)等非质粒载体等)或病毒载体(例如，逆转录病毒载体等)向受精卵原核的显微注入法、以及向胚胎干细胞、精子干细胞、人工多能性干细胞(ips细胞)等细胞的电穿孔(电穿孔)法和脂转染法等公知方法进行。编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因可整合到相同载体，也可分别整合到不同载体。[0192]此外，编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因也可分别插入宿主染色体上。作为非限定性的一个方式，各基因向宿主染色体上的插入可以通过经随机整合改变任意位置、或者通过应用锌指核酸酶(美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185、6,479,626)、talen(美国专利号8,420,782、8,440,431、8,440,432、8,450,471)或crispr-cas9的技术改变目标位置进行(美国专利号8697359、8795965、8771945)。此外，作为本发明中的非限定性的一个方式，编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因的该染色体上的插入位置没有特别限定，例如，列举已知为外来基因的稳定表达区的rosa26基因、hippo基因、tigre基因等，可以利用同源重组等可操作地插入规定位置。本说明书中的“可操作”意味着插入的编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因在宿主染色体上的转录调节序列的控制下或各基因具有转录调节序列的控制下分别表达第1融合蛋白和第2融合蛋白。[0193]本发明的基因修饰非人动物可向一个个体(细胞)导入编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因两者而制备，或者，也可通过将分别导入了编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因的动物彼此交配得到幼崽、从中选择具有两个基因的幼崽而制备。[0194]本发明的基因修饰非人动物关于编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因各自是杂合子或纯合子，优选地，关于两个基因是纯合子。[0195]本发明的基因修饰非人动物可以基于报告蛋白的检测量筛选，可以得到具有期望的报告蛋白的检测量的基因修饰非人动物。如此得到的具有规定的报告蛋白检测量的基因修饰非人动物可以在后述嘌呤受体配体依赖性药物分子的评价和筛选的方法中应用。[0196](1-3-2)疾病模型动物[0197]本发明的基因修饰非人动物可以为疾病模型动物。作为“疾病”，优选通过细胞外存在的嘌呤受体配体表征的疾病，作为这样的疾病，例如，列举癌、急性炎症、慢性炎症、传染病、纤维化、物理或化学器官损害、抗癌剂等引起的细胞损害等。[0198]在本发明中，“癌”意味着恶性新生物，其可为转移性或非转移性的任一。例如，作为从消化道和皮肤等上皮组织发生的癌症的非限定实例，示例脑肿瘤、皮肤癌、头颈癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、乳癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、胰腺癌、肝癌、大肠癌、结肠癌、膀胱癌和卵巣癌等。此外，作为从肌肉等非上皮性组织(间质)发生的肉瘤的非限定实例，示例骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和血管肉瘤等。进一步，作为来自造血器官的血液癌症的非限定实例，示例包含霍奇金淋巴瘤(hodgkin’s lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(non hodgkin’s lymphoma)的恶性淋巴瘤，包含急性骨髓性白血病(acute myelocytic leukemia)或慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia)、和急性淋巴性白血痫(acute lymphatic leukemia)或慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia)的白血病，以及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。本发明中的“癌”也包含“新生物”。新生物产生肿瘤的形成，其以部分血管形成为特征。新生物也意味着新生的所有病的组织肿瘤，例如，可为血管瘤、神经胶质瘤、畸胎瘤等良性、或者例如癌症、肉瘤、胶质细胞瘤、星形胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等恶性。[0199]本发明的基因修饰非人动物可以作为具有癌组织的癌模型动物制备。“癌组织”意味着包含至少一种癌细胞的组织。因此，例如，如癌组织包含癌细胞和血管，指有助于包含癌细胞和内皮细胞的肿瘤(肿瘤块)的形成的全部细胞型。肿瘤意味着肿瘤组织病灶(a foci of tumor tissue)，“肿瘤”通常意味着良性新生物或恶性新生物。[0200]在本发明的基因修饰非人动物中，基于以往公知的方法，通过致癌性物质的施用、基因修饰引起的癌基因的表达、癌细胞的移植等，可以制备癌模型动物。[0201]本发明的疾病模型动物可以在后述的疾病的发病部位和发病时期的检测、疾病经过的监测、疾病的预防或治疗中有效的药物分子的评价、药物的毒性和副作用的评价、和筛选的方法中利用。[0202]2.基因修饰动物细胞[0203]本发明此外涉及用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的表达第1融合蛋白和第2融合蛋白的基因修饰动物细胞。[0204]本发明中的“第1融合蛋白”和“第2融合蛋白”如上述。[0205]本发明中的“动物细胞”意味着来自属于脊椎动物门的动物的细胞、来自无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)的细胞，没有特别限定。优选地，本发明中的“动物细胞”意味着来自属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包含无颌类和颌口类，颌口类包含哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。更优选地，本发明中的“动物细胞”是来自属于称为哺乳动物的哺乳纲的动物的细胞，没有特别限定，尤其优选来自小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等的细胞。[0206]在本发明的基因修饰动物细胞中，细胞外存在的嘌呤受体配体与第1融合蛋白中的前述膜蛋白结合时，第2融合蛋白中可与与前述配体结合的膜蛋白结合的蛋白与其结合。由此，第1融合蛋白中的第1报告蛋白与第2融合蛋白中的第2报告蛋白接近或结合，共同作为报告蛋白发挥功能。通过检测该报告蛋白，可以评价本发明的基因修饰动物细胞中细胞外存在的嘌呤受体配体的有无和量等。[0207]利用本发明的基因修饰动物细胞的细胞外存在的嘌呤受体配体的检测方法在后述。[0208](2-1)基因修饰动物细胞的制备方法[0209]本发明的基因修饰动物细胞可以应用以往公知的基因修饰方法制备，可以通过将编码上述第1融合蛋白的基因和编码上述第2融合蛋白的基因向动物细胞基因导入而制备。[0210]编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因向动物细胞的导入可以适当应用公知方法进行，例如，可以利用dna载体(质粒载体、粘粒载体、和细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)等非质粒载体等)或病毒载体(例如，逆转录病毒载体等)、电穿孔(电穿孔)法、脂转染法等。编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因可以整合到相同载体，也可以分别整合到不同载体。[0211]此外，编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因也可以分别在宿主染色体上插入。作为非限定性的一个方式，各基因向宿主染色体上的插入可以通过经随机整合改变任意位置、或者通过应用锌指核酸酶、talen或crispr-cas9的技术改变目标位置进行。作为本发明中的非限定性的一个方式，编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因在该染色体上的插入位置没有特别限定，例如，列举rosa26基因、hippo基因、tigre基因等，可以利用向规定位置同源重组等可操作地插入。[0212]本发明的基因修饰动物细胞关于编码第1融合蛋白的基因和编码第2融合蛋白的基因各自是杂合子或纯合子，优选地，关于两个基因是纯合子。[0213]或者，本发明的基因修饰动物细胞也可以通过从上述本发明的基因修饰非人动物分离而制备。[0214]本发明的基因修饰动物细胞不仅包含以分离的细胞和作为细胞株建立的细胞为代表的体外使用的细胞，也包含生物体内的细胞。即，上述本发明的基因修饰非人动物的生物体内包含的细胞、和向动物的生物体内移植的本发明的基因修饰动物细胞也属于本发明的基因修饰动物细胞。[0215]在本发明的基因修饰动物细胞中，通过细胞外存在的嘌呤受体配体与第1融合蛋白中与嘌呤受体配体结合的膜蛋白结合使该膜蛋白活化，第2融合蛋白中与前述活化的膜蛋白结合的蛋白与该膜蛋白结合。由此，第1融合蛋白中的第1报告蛋白和第2融合蛋白中的第2报告蛋白接近或结合，共同作为报告蛋白发挥功能。通过检测、测定该报告蛋白，可以评价细胞外存在的嘌呤受体配体的量及其影响的有无。[0216]本发明的基因修饰动物细胞可以在用于检测细胞外存在的嘌呤受体配体的检测试剂盒中包含而提供。该试剂盒中除了该细胞外，还可以包含显示细胞培养方法、报告蛋白的检测方法的说明书，和显示报告蛋白的检测量与细胞外存在的嘌呤受体配体量的范围的校准曲线。进一步，在报告蛋白是酶的情况下，该试剂盒中可以包含适当的底物。[0217]利用本发明的基因修饰动物细胞的细胞外存在的嘌呤受体配体的检测、评价方法在后述。[0218]3.应用基因修饰动物和基因修饰动物细胞的各种评价方法[0219](3-1)细胞外存在的嘌呤受体配体的检测[0220]在一个方式中，本发明的基因修饰动物和基因修饰动物细胞可以在检测细胞外存在的嘌呤受体配体的方法中应用。本发明中的“检测”意味着定性判定和/或定量测定，“检测嘌呤受体配体”意味着定性判定嘌呤受体配体的有无、或定量测定细胞外嘌呤受体配体的浓度的任一或其两者。[0221]本发明中的嘌呤受体配体的检测可以通过检测报告蛋白进行。如上述，在本发明的基因修饰动物和基因修饰动物细胞中，细胞外存在的嘌呤受体配体与第1融合蛋白中的前述膜蛋白结合时，第2融合蛋白中的可与与前述配体结合的膜蛋白结合的蛋白与其结合。由此，第1融合蛋白中的第1报告蛋白和第2融合蛋白中的第2报告蛋白接近或结合，共同作为报告蛋白发挥功能。通过检测该报告蛋白，可以检测细胞外存在的嘌呤受体配体。[0222]检测报告蛋白的方法可以相应于应用的报告蛋白适宜选择，可以应用通常方法进行。例如，在利用荧光蛋白作为报告蛋白的情况下，可以通过照射该荧光蛋白的激发波长的光、检测发出的荧光进行。作为这样的荧光蛋白的具体实例，列举gfp、cyp、yfp。此外，在利用酶作为报告蛋白的情况下，可以通过按需要施用或添加该酶的底物、使该酶与其底物反应、检测该反应物进行。在该反应物是荧光物质的情况下，可以通过照射该荧光物质的激发波长的光、检测发出的荧光进行。此外，在该反应物发光的情况下，可以通过检测该发光进行。或者，在该反应物是染料的情况下，可以通过测定该色素的吸光度检测。更具体地，在利用荧光素酶作为报告蛋白的情况下，可以通过施用或添加细胞膜透过性的荧光素作为底物、产生荧光素-荧光素酶反应、检测生成的蛋白的发光进行。[0223]例如，根据本发明，作为嘌呤受体配体可以列举atp，应用本发明的基因修饰动物和基因修饰细胞，可以检测细胞外存在的atp。[0224](3-2)药物分子的评价和筛选[0225]在另一方式中，本发明的基因修饰动物和基因修饰动物细胞可以在以细胞外嘌呤受体配体为指标的药物分子的效果的评价方法中利用。[0226]在本方法中，将被测物质施用于本发明的基因修饰动物、或添加在培养本发明的基因修饰动物细胞的培养基中，在报告蛋白是酶的情况下按需要进一步施用或添加该酶的底物，检测报告蛋白，将其量与施用或添加前的检测量比较，可以评价该被测物质的药效。[0227]作为“被测物质”没有特别限定，列举低分子化合物、氨基酸、核酸、脂质、糖类、天然物的提取物等，可以利用天然化合物文库、合成化合物文库、代谢物文库、现有药物文库等。[0228]被测物质和底物(必要情况下)向本发明的基因修饰动物的施用可以用任意手段进行，例如，可以通过静胍内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉内注射、腹腔内注射等注射进行(不限于这些)。此外，被测物质和底物可以同时向本发明的基因修饰动物施用，也可以分别施用，此外，其施用手段可以相同，也可以不同。[0229]被测物质和底物(必要情况下)向培养本发明的基因修饰动物细胞的培养基的添加可以同时进行，也可以分别添加。[0230]在施用或添加被测物质的情况下，在与施用或添加前相比报告蛋白的检测量降低的情况下，可以评价为该被测物质具有抑制嘌呤受体配体的产生的效果，另一方面，在与施用或添加前相比报告蛋白的检测量增加的情况下，可以评价为该被测物质具有增强嘌呤受体配体的产生的效果，进一步，可以基于该评价筛选具有各效果的药物分子。[0231]在被测物质在其主要作用或副作用中具有细胞损害性或器官损害性的情况下，通过从受到损害的组织漏出的嘌呤受体配体的检测、或检测受到损害的组织中存在的免疫细胞分泌的嘌呤受体配体，可以在被测物质的毒性评价中应用。其中，在向基因修饰动物施用的情况下，可非侵入性鉴定呈现毒性的器官，并且可以捕捉随时间的变化。[0232]更详细地，作为嘌呤受体配体可以列举atp，根据本方法以atp为指标，可以对增强atp的产生或抑制atp的产生的药效进行评价，可以筛选具有该效果的药物分子。[0233](3-3)嘌呤受体配体依赖性药物分子的评价和筛选[0234]此外，在另一方式中，本发明的基因修饰动物和基因修饰动物细胞可以在嘌呤受体配体依赖性药物分子的效果的评价方法中利用。[0235]本发明中的“嘌呤受体配体依赖性药物分子”意味着依据细胞外存在的嘌呤受体配体的有无或多寡活化或不活化的药物分子。[0236]在本方法中，将被测物质施用于本发明的基因修饰动物、或添加在培养本发明的基因修饰动物细胞的培养基中，可以在规定量的细胞外嘌呤受体配体的存在下评价该被测物质的药效。[0237]在本方法中，本发明的基因修饰动物或本发明的基因修饰动物细胞的细胞外存在的嘌呤受体配体量可以通过报告蛋白的检测确认。报告蛋白的检测只要至少被测物质作用时细胞外嘌呤受体配体量明确即可，可以在被测物质施用或添加前、或施用或添加后的任一或其两者进行。优选地，报告蛋白的检测可以在被测物质的施用或添加前进行。[0238]在本方法中，可以利用基于规定的报告蛋白的检测量预先筛选的本发明的基因修饰动物。或者，本发明的基因修饰动物或本发明的基因修饰动物细胞的细胞外存在的嘌呤受体配体量可以通过将嘌呤受体配体施用于本发明的基因修饰动物、或添加在培养本发明的基因修饰动物细胞的培养基中而调整。[0239]“被测物质”如上述，被测物质和底物(必要情况下)的施用或添加可以用任意手段如上述进行。[0240]报告蛋白的检测可以相应于应用的报告蛋白如上述进行。[0241]在根据细胞外存在的嘌呤受体配体的有无或多寡见到药效的变化的情况下，可以评价为该被测物质是嘌呤受体配体依赖性药物分子，进一步，可以基于该评价筛选嘌呤受体配体依赖性药物分子。[0242]更详细地，作为嘌呤受体配体，可以列举atp，根据本方法，可以评价atp依赖性药物分子的效果，可以筛选atp依赖性药物分子。[0243](3-4)用于疾病病理状态的监测、疾病的预防或治疗的药物分子的筛选[0244]进一步在另一方式中，本发明的基因修饰动物可以在疾病的发病部位和发病时期的检测、和疾病病理状态的监测方法中利用。在本方法中，通过在上述疾病模型动物中进行报告蛋白的检测，可以鉴定由细胞外存在的嘌呤受体配体表征的疾病的发病部位和程度、以及发病时期，通过经时地鉴定它们，可以监测疾病病理状态的经过。[0245]此外，在另一方式中，本发明的基因修饰动物可以在疾病的预防药或治疗药的评价和有效的预防药或治疗药的筛选方法中利用。[0246]在本方法中，将被测物质施用于上述疾病模型动物，在报告蛋白是酶的情况下进一步施用该酶的底物，检测报告蛋白，将其量与施用前的检测量比较，可以评价该被测物质的药效。[0247]在施用被测物质的情况下，在与施用前相比报告蛋白的检测量降低的情况下，可以评价为该被测物质在疾病的预防或治疗中有效，进一步，可以基于该评价筛选具有各效果的药物分子。[0248]“被测物质”如上述，被测物质和底物(必要情况下)的施用可以用任意手段如上述进行。[0249]报告蛋白的检测可以相应于应用的报告蛋白如上述进行。[0250]更详细地，作为嘌呤受体配体，可以列举atp，根据本方法以atp为指标，可以评价癌的预防或治疗中有效的药物分子的效果，可以筛选癌的预防或治疗中有效的药物分子。此外，本方法可以筛选不限于癌的疾病和其它药剂引起的副作用的预防或治疗中有效的药物分子。作为不限于癌的疾病和副作用的非限定实例，列举急性炎症、慢性炎症、传染病、纤维化、物理或化学器官损害、抗癌剂等引起的细胞损害等，以atp为指标，可以评价这些疾病和副作用的预防或治疗中有效的药物分子的效果。[0251]另外，在本说明书中，除非记载意味着“1个”或“多个”的数量的限定而说明术语，本说明书中记载的术语不解释为数量被特别限定，理解为具有“1个或多个”的含义的术语。[0252]本领域技术人员当然理解，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾，将本说明书中记载的1个或多个方式任意组合也包含在本发明中。[0253]本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书中。[0254]本说明书包含作为本技术的优先权的基础的日本专利申请2019-225404号的说明书和/或附图记载的内容。实施例[0255]随后，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明不限于以下实施例。[0256][实施例1]p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端))双敲入小鼠的制备[0257]1.1.p2y11-split luc(c末端)敲入载体的构建[0258]向结合了人p2y11基因和荧光素酶基因的c末侧区的序列添加剪接受体、polya添加信号和flag标签，成为“p2y11-split luc(c末端)”表达盒(序列编号1)。用本领域技术人员公知的方法，将该序列克隆到用于敲入小鼠rosa基因区的同源重组用载体pzdonor-mrosa26 vector(sigma-aldrich inc.#d9196)，构建p2y11-split luc(c末端)敲入载体(图1)。[0259]1.2.arrestin-split luc(n末端)敲入载体的构建[0260]向结合了小鼠抑制蛋白-2(β-抑制蛋白-1)基因(图2中记载为“marrb1a”)和荧光素酶基因的n末侧区的序列、和结合了小鼠抑制蛋白-3(β-抑制蛋白-2)基因(图2中记载为“marrb2a”)和荧光素酶基因的n术侧区的序列，分别添加myc标签或his标签，用2a肽接合，与小鼠β肌动蛋白启动子结合，成为“arrestin-split luc(n末端)”表达盒(序列编号2)。用本领域技术人员公知的方法，将该序列克隆到用于敲入小鼠rosa基因区的同源重组用载体pzdonor-mrosa26 vector(sigma-aldrich inc.#d9196)，构建arrestin-split luc(n末端)敲入载体(图2)。[0261]1.3.p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)敲入载体向小鼠受精卵的dna显微注射[0262]将p2y11-split luc(c末端)敲入载体或arrestin-split luc(n末端)敲入载体分别与以小鼠rosa基因为靶的zfn mrna(sigma-aldrich inc.#m4574)混和的溶液注入小鼠原核期受精卵。注入后的胚胎在37℃培养一夜，将发育至2细胞期的胚胎移植到假孕0.5天的icr型接受雌性的子宫内，得到后代。得到的后代用pcr进行敲入等位基因的检测并进行首建小鼠的选择。分别地，在p2y11-split luc(c末端)敲入小鼠的敲入等位基因检测中使用引物mr1387f(序列编号3)和h11-480r(序列编号4)以及flucc-1321f(序列编号5)和mr3334r(序列编号6)，在arrestin-split luc(n末端)敲入小鼠的敲入等位基因检测中使用引物mr1247fq(序列编号3)和cmv-r(序列编号7)以及marrb2a-f2(序列编号8)和mr3334r(序列编号6)。[0263]1.4.p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的制备[0264]得到的首建小鼠在性成熟后与c57bl/6n小鼠交配，以从下一代小鼠的组织提取的基因组dna为模板，通过pcr法确认敲入等位基因向下一代小鼠的传导。通过将分别建立的p2y11-split luc(c末端)敲入小鼠与arrestin-split luc(n末端)敲入小鼠杂交，制备p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠。[0265][实施例2]p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的体内atp信号检测[0266]向p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠皮下施用终浓度1mm的atp和15mg/ml vivoglo荧光素(promega#p1043)的混合液50μl。atp施用10～20分钟后用ivis spectrum ct(perkinelmer公司)测定发光信号强度。测定条件以exposure time＝180sec、binning＝medium、f/stop＝1进行，以物理量(光子/秒)分析发光信号。[0267]其结果，通过在p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠中的atp施用检测发光信号，在分别仅具有一个等位基因的小鼠和野生型小鼠中检测不到该发光信号(图3)。根据该结果确认，通过atp与p2y11结合，arrestin被募集，作为通过split-荧光素酶的再构建可得到发光信号的反应特异性报告小鼠发挥功能。[0268][实施例3]来自p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的成纤维细胞的建立和体外atp信号检测[0269]3.1.p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的成纤维细胞建立[0270]从p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠收集皮肤组织，应用手术剪在培养液中细切后，放置盖玻片将真皮侧与培养用皿底面接触，用添加10％fbs、1x neaa的d-mem培养基培养。通过胰蛋白酶处理回收确认了细胞的迁移、增殖的成纤维细胞，通过重复传代建立成纤维细胞株。[0271]3.2.体外atp浓度检测[0272]将来自p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠的成纤维细胞接种于24孔培养板。次日，添加终浓度0～1000μm atp和vivoglo荧光素(promega#p1043)，用ivis spectrum ct(perkinelmer公司)检测发光信号。测定条件以exposure time＝180sec、binning＝medium、f/stop＝1进行，以物理量(光子/秒)分析发光信号。[0273]其结果，在0μm、10μm、50μm、100μm、200μm、400μm、600μm、800μm、1000μm的atp检测到浓度依赖性信号强度，得到的回归式是y＝437.91x+10840(r2＝0.9727)(图4、图5)。[0274][实施例4]浓度已知atp的体内成像[0275]向p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠皮下施用终浓度0mm、1mm、2mm、4mm、8mm的atp和15mg/ml vivoglo荧光素(promega#p1043)的混合液50ul。atp施用10～20分钟后，用ivis spectrum ct(perkinelmer公司)测定发光信号强度。测定条件以exposure time＝60sec、binning＝medium、f/stop＝1进行，以物理量(光子/秒)分析发光信号。其结果，检测到atp浓度依赖性信号强度，得到的回归式是y＝1e+06x+3e+06(r2＝0.9964)。由此确认，作为浓度依赖性报告小鼠发挥功能(图6、图7)。[0276][实施例5]通过炎症性刺激的atp可视化[0277]向p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠进行流体动力学注射，对伴随肝细胞损伤在肝脏的atp漏出的可视化进行研究。尾静胍施用相当于小鼠体重的10％的生理盐水实施流体动力学注射次日以后，腹腔内施用150mg/kg的vivoglo荧光素(promega#p1043)，用ivis spectrum ct(perkinelmer公司)测定发光信号强度。测定条件以exposure time＝60sec、binning＝medium、f/stop＝1进行，以物理量(光子/秒)分析发光信号。[0278]其结果确认，在流体动力学注射组的肝脏中，与未实施流体动力学注射的组(-)比较，检测到高发光信号，成为关于炎症性刺激中atp漏出的非侵入性可视化报告小鼠(图8)。[0279][实施例6]通过致癌诱导的组织内atp的可视化[0280]对于p2y11-split luc(c末端)和arrestin-split luc(n末端)双敲入小鼠，通过流体动力学dna递送法在肝脏中致癌诱导时，对正常组织与肿瘤形成部位的atp浓度的比较和可视化进行研究。即，将混合了突变型kras表达载体和以p53、p16、smad4基因为靶的grna-cas9表达载体使得各载体分别为3-5μg/只的生理盐水液尾静胍内施用，使其成为小鼠体重的约10％容量。突变型kras表达应用the journal of biological chemistry(2011)286，20109-20116.中应用的表达载体pmacii进行。将编码序列编号12所示突变型kras(g12d)的序列克隆到表达载体pmacii并应用。构建为在cmv增强子和小鼠β肌动蛋白启动子控制下表达突变型kras(g12d)。以各目标基因为靶的grna-cas9表达载体将p53、p16和smad4基因的部分序列作为grna序列，分别克隆到pgena22(horizon discovery公司)。对各目标基因制备3种grna-cas9表达载体，混合3种载体并施用。对于p53的grna序列应用序列编号13、14、15所示序列。对于p16的grna序列应用序列编号16、17、18所示序列。对于smad4的grna序列应用序列编号19、20、21所示序列。对于伴随肝脏中癌化的组织内atp浓度的变化的分析，腹腔内施用150mg/kg的vivoglo荧光素(promega#p1043)，用ivis spectrum ct(perkinelmer公司)测定发光信号强度。测定条件以exposure time＝120sec(体内)、1sec(摘出的肝脏)、binning＝medium、f/stop＝1进行，以物理量(光子/秒)分析发光信号。[0281]其结果，通过突变型kras表达载体和以p53、p16、smad4基因为靶的grna-cas9表达载体的施用，在肝脏中见到肿瘤的形成和增大的个体中，通过非侵入性可视化检测到强发光信号(图9(a))。进一步，摘出肝脏后，通过离体的分析，与正常组织或正常的区比较，在见到癌化的区和肿瘤形成部位，检测到高发光信号，在癌细胞的增殖区确认atp浓度高的状态(图9(b))。









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