人工生成彩色血液涂片图像的制作方法

摄影电影;光学设备的制造及其处理,应用技术人工生成彩色血液涂片图像1.相关申请的交叉引用2.本技术要求halperin等人2019年12月12日提交的标题为“artificial generation of a color blood smear image”的美国临时专利申请第62/946,988号的优先权，该美国临时专利申请通过引用并入本文。3.本发明实施方案的领域4.本发明公开的主题的一些应用总体涉及身体样品的分析，并且特别地涉及对血液样品进行的光密度和显微测量。5.背景6.在一些基于光学的方法(例如，诊断和/或分析方法)中，通过进行光学测量来确定生物样品诸如血液样品的特性。例如，组分的密度(例如，每单位体积的组分的计数)可以通过对显微图像内的组分计数来确定。类似地，组分的浓度和/或密度可以通过对样品进行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量。通常，将样品放置到样品载体中，并且对包含在样品载体的室中的样品的一部分进行测量。分析对包含在样品载体的室中的样品的一部分进行的测量，以便确定样品的特性。7.实施方案概述8.根据本发明的一些应用，获取血液样品的显微成像视野的多于一幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取。通常，所述图像中的至少一幅是在紫光照明条件下(例如，在400nm-450nm范围内的波长的光照明下)获取的明视野图像。此外，通常，所述图像中的至少一幅是荧光图像。计算机处理器组合来自多于一幅图像中的每一幅的数据，以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。对于一些应用，计算机处理器运行神经网络，以便组合图像以生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。通常，使用一个或更多个色彩模型，诸如rgb、cie、hsv和/或其组合来生成人工彩色显微图像。9.通常，在明视野紫光照明条件下获取的图像被映射至人工彩色显微图像的红色通道。此外，通常，在映射至红色通道之前，将图像转换为负反差图像。对于一些应用，映射至在明视野紫光照明条件下获取的图像的负反差图像的结果是红细胞具有与彩色涂片图像中的红细胞外观类似的外观(例如，类似于使用giemsa或wright-romanowsky涂片染色产生的外观)。10.对于一些应用，在各自的成像模式下获取三幅图像。例如，除了在明视野紫光照明条件下获取的图像之外，还可以获取两幅荧光图像。例如，可以在用各自波长波段的光(例如，uv光和蓝光)激发血液样品之后获取两幅荧光图像。可选地，可以在用相同波长波段的光激发样品之后但使用各自不同的发射滤光器获取两幅荧光图像。通常，将第二幅图像映射至人工彩色显微图像的第二色彩通道，并且将第三幅图像映射至人工彩色显微图像的第三色彩通道。例如，当使用rgb色彩模型时，可以将第一幅图像映射至红色通道(如以上描述的)，将第二幅图像映射至绿色通道，并且将第三幅图像映射至蓝色通道。11.因此，根据本发明的一些应用，提供了一种用于对血液样品使用的方法，所述方法包括：12.使用显微镜，获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取，并且所述三幅图像中的第一幅图像在紫光明视野成像下获取；并且13.使用至少一个计算机处理器，通过以下步骤生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：14.将所述三幅图像中的第一幅图像映射至所述人工彩色显微图像的红色通道；15.将所述三幅图像中的第二幅图像映射至所述人工彩色显微图像的第二色彩通道；并且16.将所述三幅图像中的第三幅图像映射至所述人工彩色显微图像的第三色彩通道。17.在一些应用中，其中所述三幅图像中的第一幅图像是在离焦、紫光明视野成像条件下获取的图像。18.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用神经网络来生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像。19.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用选自由以下组成的组的色彩模型：rgb、cie、hsv及其组合。20.在一些应用中，其中将所述三幅图像中的第一幅图像映射至人工rgb显微图像的红色通道包括生成所述三幅图像中的第一幅图像的负反差图像，并且将所述负反差图像映射至所述人工rgb显微图像的红色通道。21.根据本发明的一些应用，还提供了用于对血液样品使用的设备，所述设备包括：22.显微镜，所述显微镜被配置为获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取，并且所述三幅图像中的第一幅图像在紫光明视野成像下获取；23.输出装置；和24.至少一个计算机处理器，所述至少一个计算机处理器被配置为通过以下步骤在所述输出装置上生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：25.将所述三幅图像中的第一幅图像映射至所述人工彩色显微图像的红色通道，26.将所述三幅图像中的第二幅图像映射至所述人工彩色显微图像的第二色彩通道，并且27.将所述三幅图像中的第三幅图像映射至所述人工彩色显微图像的第三色彩通道。28.在一些应用中，其中所述显微镜被配置为获取所述三幅图像中的第一幅图像是在离焦、紫光明视野成像条件下获取的图像。29.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为使用神经网络生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像。30.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为使用选自由以下组成的组的色彩模型来生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：rgb、cie、hsv及其组合。31.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为通过生成所述三幅图像中的第一幅图像的负反差图像并且将所述负反差图像映射至人工rgb显微图像的红色通道，从而将所述三幅图像中的第一幅图像映射至所述人工rgb显微图像的红色通道。32.根据本发明的一些应用，还提供了一种用于对血液样品使用的方法，所述方法包括：33.使用显微镜，获取所述血液样品的显微成像视野的多于一幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；并且34.使用至少一个计算机处理器，组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据，以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。35.在一些应用中，其中组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像包括，使用神经网络来组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。36.在一些应用中，其中组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用选自由以下组成的组的色彩模型：rgb、cie、hsv及其组合。37.根据本发明的一些应用，还提供了用于对血液样品使用的设备，所述设备包括：38.显微镜，所述显微镜被配置为获取所述血液样品的显微成像视野的多于一幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；39.输出装置；和40.至少一个计算机处理器，所述至少一个计算机处理器被配置为组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据，以便在所述输出装置上生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。41.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为使用神经网络来组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据，以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。42.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为组合来自所述多于一幅图像中的每一幅的数据，以便使用选自由以下组成的组的色彩模型来生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像：rgb、cie、hsv及其组合。43.根据本发明的一些应用，还提供了一种用于对血液样品使用的方法，所述方法包括：44.使用显微镜，获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；并且45.使用至少一个计算机处理器，通过以下步骤生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：46.生成所述图像中的每一幅的归一化形式，以便去除所述图像内具有低于阈值的强度的像素；并且47.将所述图像中的每一幅图像的归一化形式映射至相加色模型内的各自不同的通道。48.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用神经网络来生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像。49.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用选自由以下组成的组的色彩模型：rgb、cie、hsv及其组合。50.在一些应用中，其中对于所述图像中的至少一幅，生成所述图像中的每一幅的归一化形式包括：51.确定所述图像内的最大强度；并且52.去除具有小于所述最大强度的一半的强度的所有像素。53.在一些应用中，其中对于所述图像中的至少一幅，生成所述图像中的每一幅的归一化形式还包括：54.生成所述图像的强度直方图；并且55.对于所述图像内具有至少等于所述最大强度的一半的强度的每一个像素：56.在所述强度直方图中鉴定具有大于所述图像内所述最大强度的一半的强度的最近局部最大值；并且57.基于所述最大强度与所述局部最大值的强度之间的差对所述像素的强度进行归一化。58.根据本发明的一些应用，还提供了用于对血液样品使用的设备，所述设备包括：59.显微镜，所述显微镜被配置为获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；60.输出装置；和61.至少一个计算机处理器，所述至少一个计算机处理器被配置为通过以下步骤在所述输出装置上生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：62.生成所述图像中的每一幅的归一化形式，以便去除所述图像内具有低于阈值的强度的像素，并且63.将所述图像中的每一幅图像的归一化形式映射至相加色模型内的各自不同的通道。64.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为使用神经网络生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像。65.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为使用选自由以下组成的组的色彩模型来生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：rgb、cie、hsv及其组合。66.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为对于所述图像中的至少一幅，通过以下步骤生成所述图像中的每一幅的归一化形式：67.确定所述图像内的最大强度；并且68.去除具有小于所述最大强度的一半的强度的所有像素。69.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为对于所述图像中的至少一幅，通过以下步骤生成所述图像中的每一幅的归一化形式：70.生成所述图像的强度直方图；并且71.对于所述图像内具有至少等于所述最大强度的一半的强度的每一个像素：72.在所述强度直方图中鉴定具有大于所述图像内所述最大强度的一半的强度的最近局部最大值；并且73.基于所述最大强度与所述局部最大值的强度之间的差对所述像素的强度进行归一化。74.根据本发明的一些应用，还提供了一种用于对血液样品使用的方法，所述方法包括：75.使用显微镜，获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；并且76.使用至少一个计算机处理器，通过以下步骤生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：77.将所述图像中的每一幅映射至相加色模型内的各自不同的通道，以生成初始彩色图像；并且78.生成所述初始彩色图像的归一化形式，以便去除所述图像内具有低于阈值的强度的像素。79.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用神经网络来生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像。80.在一些应用中，其中生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用选自由以下组成的组的色彩模型：rgb、cie、hsv及其组合。81.在一些应用中，其中生成所述初始彩色图像的归一化形式包括：82.确定所述初始彩色图像内的最大强度；并且83.去除具有小于所述最大强度的一半的强度的所有像素。84.在一些应用中，其中生成所述初始彩色图像的归一化形式还包括：85.生成所述图像的强度直方图；并且86.对于所述初始彩色图像内具有至少等于所述最大强度的一半的强度的每一个像素：87.在所述强度直方图中鉴定具有大于所述图像内所述最大强度的一半的强度的最近局部最大值；并且88.基于所述最大强度与所述局部最大值的强度之间的差对所述像素的强度进行归一化。89.根据本发明的一些应用，还提供了用于对血液样品使用的设备，所述设备包括：90.显微镜，所述显微镜被配置为获取所述血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取；91.输出装置；和92.至少一个计算机处理器，所述至少一个计算机处理器被配置为通过以下步骤在所述输出装置上生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像：93.将所述图像中的每一幅映射至相加色模型内的各自不同的通道，以生成初始彩色图像，并且94.生成所述初始彩色图像的归一化形式，以便去除所述图像内具有低于阈值的强度的像素。95.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用神经网络。96.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为生成所述显微成像视野的人工彩色显微图像包括使用选自由以下组成的组的色彩模型：rgb、cie、hsv及其组合。97.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为通过以下步骤生成所述初始彩色图像的归一化形式：98.确定所述初始彩色图像内的最大强度；并且99.去除具有小于所述最大强度的一半的强度的所有像素。100.在一些应用中，其中所述计算机处理器被配置为通过以下步骤生成所述初始彩色图像的归一化形式：101.生成所述图像的强度直方图，并且102.对于所述初始彩色图像内具有至少等于所述最大强度的一半的强度的每一个像素：103.在所述强度直方图中鉴定具有大于所述图像内所述最大强度的一半的强度的最近局部最大值，并且104.基于所述最大强度与所述局部最大值的强度之间的差对所述像素的强度进行归一化。105.根据以下对本发明实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明，在附图中：106.附图简述107.图1是示出根据本发明的一些应用的生物样品分析系统的组件的框图；108.图2a、图2b和图2c是根据本发明的一些应用的光学测量单元的示意图；109.图3a、图3b和图3c是根据本发明的一些应用的用于进行显微测量和光密度测量二者的样品载体的各自视图的示意图；并且110.图4a、图4b、图4c和图4d是示出根据本发明的一些应用所进行的方法的步骤的流程图。111.实施方案详述112.现在参考图1，其是示出根据本发明的一些应用的生物样品分析系统20的组件的框图。通常，将生物样品(例如，血液样品)放置到样品载体22中。在样品置于样品载体中时，使用一个或更多个光学测量装置24对样品进行光学测量。例如，光学测量装置可以包括显微镜(例如，数字显微镜)、分光光度计、光度计、分光计、相机、光谱相机、高光谱相机、荧光计、荧光分光光度计和/或光电探测器(诸如，光电二极管、光敏电阻和/或光电晶体管)。对于一些应用，光学测量装置包括专用光源(诸如发光二极管、白炽光源等)和/或用于操作光收集和/或光发射的光学元件(诸如透镜、漫射器(diffuser)、滤光器等)。113.计算机处理器28通常接收并处理由光学测量装置进行的光学测量。此外，通常，计算机处理器控制由一个或更多个光学测量装置进行的光学测量的获取。计算机处理器与存储器30通信。用户(例如，实验室技术人员或从其抽取样品的个体)经由用户界面32向计算机处理器发送指令。对于一些应用，用户界面包括键盘、鼠标、操纵杆、触摸屏装置(诸如智能手机或平板计算机)、触摸板、轨迹球、语音命令界面和/或本领域已知的其他类型的用户界面。通常，计算机处理器经由输出装置34生成输出。此外，通常，输出装置包括显示器，诸如监视器，并且输出包括显示在显示器上的输出。对于一些应用，处理器在不同类型的视觉、文本、图形、触觉、音频和/或视频输出装置(例如，扬声器、耳机、智能手机或平板计算机)上生成输出。对于一些应用，用户界面32用作输入界面和输出界面二者，即，它用作输入/输出界面。对于一些应用，处理器在计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)诸如磁盘或便携式usb驱动器上生成输出，和/或在打印机上生成输出。114.现在参考图2a、图2b和图2c，图2a、图2b和图2c是根据本发明的一些应用的光学测量单元31的示意图；图2a示出了完全组装的装置的外部的斜视图，而图2b和图2c示出了装置的各自斜视图，其中已使盖透明，使得装置内的组件可见。对于一些应用，一个或更多个光学测量装置24(和/或计算机处理器28和存储器30)容纳在光学测量单元31内。为了对样品进行光学测量，将样品载体22放置在光学测量单元内。例如，光学测量单元可以定义槽36，经由槽36将样品载体插入光学测量单元中。通常，光学测量单元包括台64，台64被配置为在光学测量单元内支撑样品载体22。对于一些应用，光学测量单元的盖上的屏幕63(例如，光学测量单元的前盖上的屏幕，如示出的)发挥用户界面32和/或输出设备34的作用。115.通常，光学测量单元包括显微镜系统37(在图2b-图2c中示出)，其被配置为对样品的一部分进行显微成像。对于一些应用，显微镜系统包括一组光源65(其通常包括一组被配置为用于样品的明视野成像的明视野光源(例如发光二极管)、一组被配置为用于样品的荧光成像的荧光光源(例如发光二极管)和被配置为对样品成像的相机(例如ccd相机或cmos相机)。通常，光学测量单元还包括光密度测量单元39(在图2c中示出)，其被配置为对样品的第二部分进行光密度测量(例如，光吸收测量)。对于一些应用，光密度测量单元包括一组光密度测量光源(例如，发光二极管)和光探测器，它们被配置为用于对样品进行光密度测量。对于一些应用，上述光源组(即，明视野光源组、荧光光源组和光密度测量光源组)中的每一组包括多于一种光源(例如，多于一种发光二极管)，其中每种光源被配置为以各自波长或以各自波长波段发射光。116.现在参考图3a和图3b，图3a和图3b是根据本发明的一些应用的样品载体22的各视图的示意图。图3a示出了样品载体的顶视图(为了说明的目的，样品载体的顶盖在图3a中示出为不透明的)，并且图3b示出了底视图(其中相对于图3a所示的视图，样品载体已经绕其短边缘旋转)。通常，样品载体包括用于对样品进行显微分析的第一组52的一个或更多个样品室和用于对样品进行光密度测量的第二组54的样品室。通常，样品载体的样品室经由样品入口孔38填充身体样品，诸如血液。对于一些应用，样品室定义一个或更多个出口孔40。出口孔被配置为通过允许存在于样品室中的空气从样品室释放来辅助身体样品填充样品室。通常，如所示的，出口孔与入口孔纵向相对(相对于样品载体的样品室)地定位。对于一些应用，出口孔因此提供了比如果将出口孔置于更靠近入口孔处更有效的空气逸出机制。117.参考图3c，其示出了根据本发明的一些应用的样品载体22的分解视图。对于一些应用，样品载体包括至少三个组件：模制组件42、玻璃层44(例如，玻璃板)和被配置为将玻璃层粘合至模制组件的下侧的粘合层46。模制组件通常由聚合物(例如，塑料)制成，其被模制(例如，经由注塑)以提供具有所期望几何形状的样品室。例如，如所示的，模制组件通常模制为定义围绕每个样品室中心部分的入口孔38、出口孔40和槽48。槽通常通过允许空气向出口孔流动和/或通过允许身体样品绕样品室的中心部分流动来辅助身体样品填充样品室。118.对于一些应用，在对血液样品进行完整血液计数时，使用如图3a-图3c中所示的样品载体。对于一些这样的应用，样品载体与光学测量单元31一起使用，光学测量单元31通常参考图2a-图2c示出和描述来配置。对于一些应用，将血液样品的第一部分放置在第一组52的样品室内(其用于例如使用显微镜系统37(在图2b-图2c中示出)对样品进行显微分析)，并且将血液样品的第二部分放置在第二组54的样品室内(其用于例如使用光密度测量单元39(在图2c中示出)对样品进行光密度测量)。对于一些应用，第一组52的样品室包括多于一个样品室，而第二组54的样品室仅包括单个样品室，如所示的。然而，本技术的范围包括在第一组样品室内或第二组样品室内或其任何组合内使用任何数量的样品室(例如，单个样品室或多于一个样品室)。血液样品的第一部分通常相对于血液样品的第二部分进行稀释。例如，稀释液可以包含ph缓冲剂、染色剂、荧光染色剂、抗体、球形剂(sphering agents)、裂解剂等。通常，放置在第二组54的样品室内的血液样品的第二部分是天然的、未稀释的血液样品。可选地或另外地，血液样品的第二部分可以是经历一些修饰的样品，所述修饰包括以下一种或更多种：例如稀释(例如，以受控方式稀释)、添加组分或试剂或分级分离。119.对于一些应用，在对样品进行显微成像之前，使用一种或更多种染色物质对血液样品的第一部分(放置在第一组52的样品室内)进行染色。例如，染色物质可以被配置为相对于其他细胞组分的染色优先对dna染色。可选地，染色物质可以被配置为相对于其他细胞组分的染色优先对所有细胞核酸染色。例如，样品可以用吖啶橙试剂、hoechst试剂和/或被配置为优先对血液样品中的dna和/或rna染色的任何其他染色物质来染色。任选地，染色物质被配置为对所有细胞核酸染色，但dna和rna各自的染色在一些照明和滤光条件下更显著可见，如对于例如吖啶橙已知的。可以使用允许检测细胞的成像条件(例如，明视野)和/或允许染色的小体可视化的成像条件(例如适当的荧光照明)来获取样品的图像。通常，样品的第一部分用吖啶橙试剂和hoechst试剂染色。例如，血液样品的第一(稀释)部分可以使用如pollak的us 9,329,129中描述的技术制备，该专利申请通过引用并入本文，并且该专利申请描述了用于制备用于分析的血液样品的方法，该方法包括稀释步骤，该稀释步骤有利于样品的显微图像内组分的鉴定和/或计数。对于一些应用，样品的第一部分用一种或更多种染色剂染色，该染色剂使样品内的血小板在明视野成像条件下和/或在荧光成像条件下可见，例如，如上文描述的。例如，样品的第一部分可以用亚甲蓝和/或罗氏染液(romanowsky stains)染色。120.同样参考图2b，通常，样品载体22由台64支撑在光学测量单元内。此外，通常，台具有叉形设计，使得样品载体由绕样品载体边缘的台支撑，但使得台不干扰样品载体的样品室对光学测量装置的可见性。对于一些应用，样品载体被保持在台内，使得样品载体的模制组件42被置于玻璃层44的上方，并且使得光学测量单元的显微镜单元的物镜66被置于样品载体的玻璃层的下方。通常，在对样品进行的显微测量期间使用的至少一些光源65(例如，在明视野成像期间使用的光源)从模制组件上方对样品载体照明。此外，通常，至少一些另外的光源(未示出)从样品载体下方(例如，经由物镜)对样品载体照明。例如，在荧光显微术期间用于激发样品的光源可以从样品载体下方(例如，经由物镜)对样品载体照明。121.通常，在进行显微成像之前，允许血液的第一部分(放置在第一组52的样品室中)沉降，诸如以形成细胞单层，例如，使用如pollak的us 9,329,129中描述的技术，该专利申请通过引用并入本文。对于一些应用，血液的第一部分是细胞悬浮液，并且属于第一组52的室的室各自定义包括基底表面57的腔55(在图3c中示出)。通常，允许细胞悬浮液中的细胞沉降在载体的样品室的基底表面上，以在样品室的基底表面上形成细胞单层。在细胞已经留置沉降在样品室的基底表面上(例如，通过已经留置沉降预定的时间间隔)之后，通常获取细胞单层的至少一部分的至少一幅显微图像。通常，获取单层的多于一幅图像，每幅图像对应于位于该单层的成像平面内各自不同区域的成像视野。通常，例如使用如greenfield的us 10,176,565中描述的技术确定聚焦显微镜以便对单层成像的最佳深度水平，该专利通过引用并入本文。对于一些应用，各自成像视野具有彼此不同的最佳深度水平。122.注意，在本技术的上下文中，术语单层用于指已经沉降，诸如置于显微镜的单个焦水平(single focus level)中的细胞层。在单层内可能存在一些细胞重叠，使得在某些区域内存在两个或更多个重叠细胞层。例如，在单层内红细胞可能彼此重叠，和/或在单层内血小板可能与红细胞重叠或置于红细胞上方。123.对于一些应用，对血液样品的第一部分的显微分析是对细胞单层进行的。通常，血液样品的第一部分在明视野成像下成像，即在来自一个或更多个光源(例如，一个或更多个发光二极管，其通常在各自的光谱波段发射光)的照明下成像。此外，通常，血液样品的第一部分另外地在荧光成像下成像。通常，荧光成像通过以下来进行：将已知的激发波长(即，已知如果用这些波长的光激发，则染色的对象发射荧光的波长)的光导向样品来激发样品内染色的对象(即，已经吸收了染色剂的对象)，并检测荧光。通常，对于荧光成像，使用一组单独的光源(例如，一个或更多个发光二极管)以已知的激发波长对样品照明。124.如参考pollak的us 2019/0302099(其通过引用并入本文)描述的，对于一些应用，属于组52的样品室(用于显微术测量)具有彼此不同的高度，以便辅助使用各样品室的显微图像测量不同的测量对象(measurands)，和/或不同的样品室用于各样品类型的显微分析。例如，如果血液样品和/或由样品形成的单层具有相对低的红细胞密度，则可以在样品载体的具有较大高度的样品室内(即，样品载体的样品室相对于具有相对较低高度的不同样品室具有较大高度)进行测量，使得存在足够的细胞密度，和/或使得在由样品形成的单层内存在足够的细胞密度，以提供统计学上可靠的数据。这样的测量可以包括例如红细胞密度测量、其他细胞属性的测量(诸如异常红细胞的计数、包括胞内体(例如病原体、豪-乔小体)的红细胞的计数，等)和/或血红蛋白浓度。相反，如果血液样品和/或由样品形成的单层具有相对高密度的红细胞，则这样的测量可以对样品载体的具有相对较低高度的样品室进行，例如，使得存在足够稀疏的细胞，和/或使得在由样品形成的细胞单层内存在足够稀疏的细胞，使得可以在显微图像内鉴定细胞。对于一些应用，即使不精确知晓属于组52的样品室之间的高度变化，也可以进行这样的方法。125.对于一些应用，基于被测量的测量对象，选择样品载体内在其上进行光学测量的样品室。例如，样品载体的具有较大高度的样品室可以用于进行白细胞计数(例如，以减少可能由较浅区域中的低计数引起的统计学误差)、白细胞分化和/或检测更罕见形式的白细胞。相反，为了确定平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，mch)、平均红细胞体积(mcv)、红细胞分布宽度(rdw)、红细胞形态特征和/或红细胞异常，可以从样品载体的具有相对较低高度的样品室获得显微图像，因为在这样的样品室中，细胞相对稀疏地分布在区域的整个面积中，和/或形成细胞相对稀疏地分布在其中的单层。类似地，为了对血小板计数、对血小板分类和/或提取血小板的任何其他属性(诸如体积)，可以从样品载体的具有相对较低高度的样品室获得显微图像，因为在这样的样品室内，在显微图像中和/或在单层中与血小板(完全或部分地)重叠的红细胞较少。126.根据以上描述的实施方案，优选使用样品载体的具有较低高度的样品室来进行用于测量样品(诸如血液样品)内的一些测量对象的光学测量，而优选使用样品载体的具有较大高度的样品室来进行用于测量这样的样品内的其他测量对象的光学测量。因此，对于一些应用，通过对置于属于样品载体的组52的第一样品室内的样品的一部分进行第一光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量样品内的第一测量对象，并且通过对置于样品载体的组52的第二样品室内的样品的一部分进行第二光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量同一样品的第二测量对象。对于一些应用，第一测量对象和第二测量对象相对于彼此进行归一化，例如，使用如zait的us 2019/0145963中描述的技术，其通过引用并入本文。127.通常，为了对样品进行光密度测量，期望尽可能精确知晓对其进行光学测量的样品部分的光路长度、体积和/或厚度。通常，对样品的第二部分(其通常以未稀释的形式放置在第二组54的样品室中)进行光密度测量。例如，组分的浓度和/或密度可以通过对样品进行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量。128.同样参考图3b，对于一些应用，属于组54的样品室(用于光密度测量)通常定义至少第一区域56(其通常较深)和第二区域58(其通常较浅)，样品室的高度以预定义的方式在第一区域与第二区域之间变化，例如，如pollak的us 2019/0302099中描述的，该专利申请通过引用并入本文。样品室的第一区域56和第二区域58的高度由玻璃层定义的下表面和模制组件定义的上表面定义。第二区域处的上表面相对于第一区域处的上表面呈台阶状。在第一区域与第二区域处的上表面之间的台阶提供区域之间的预定的高度差δh，使得即使已知区域的绝对高度未达到足够的准确度(例如，由于制造过程中的公差)，但也已知高度差δh达到足够的准确度，以使用本文描述并如pollak的us 2019/0302099中描述的技术来确定样品的参数，该专利申请通过引用并入本文。对于一些应用，样品室的高度从第一区域56至第二区域58变化，并且然后高度同样从第二区域至第三区域59变化，使得沿着样品室，第一区域56定义最大高度区域，第二区域58定义中等高度区域，并且第三区域59定义最小高度区域。对于一些应用，高度的另外变化沿着样品室的长度发生，和/或高度沿着样品室的长度逐渐变化。129.如上文描述的，在样品置于样品载体中时，使用一个或更多个光学测量装置24对样品进行光学测量。通常，样品通过光学测量装置经由玻璃层进行观察，玻璃至少对光学测量装置通常使用的波长是透明的。通常，在进行光学测量时，将样品载体插入容纳光学测量装置的光学测量单元31中。通常，光学测量单元容纳样品载体，使得模制层置于玻璃层上方，并且使得光学测量单元置于样品载体的玻璃层下方，并且能够经由玻璃层对样品进行光学测量。样品载体通过将玻璃层粘附至模制组件而形成。例如，玻璃层和模制组件可以在制造或组装期间彼此结合(例如使用热结合(thermal bonding)、溶剂辅助结合(solvent-assisted bonding)、超声波焊接、激光焊接、热铆接、粘合剂、机械夹紧和/或另外的物质)。对于一些应用，玻璃层和模制组件在制造或组装期间使用粘合层46彼此结合。130.对于一些显微术应用，使用多于一种不同的成像模式来获取成像视野的显微图像。例如，如上文描述的，可以在样品在几个各自不同的波长波段的照明下获取明视野图像。可以在细胞(例如，细胞单层)聚焦或离焦时获取明视野图像。可选地或另外地，荧光成像通过以下来获取：在已知的激发波长(即，如果用在这些波长的光激发，则已知染色的对象发出荧光的波长)将光导向样品来激发样品内的染色的对象(即，已经吸收了染色剂的对象)，并且检测荧光。各自的荧光图像通过以下来获取：用各自不同的波长波段的光激发样品，或者通过用特定波长波段的光激发样品，并且然后使用发射滤光器来过滤从样品发射的各波长波段的光。131.通常，计算机处理器分析与样品相关的显微图像和/或其他数据(例如，光学吸收测量值)，以便确定样品的特性。对于一些应用，计算机处理器另外地经由输出装置34向用户输出样品的图像。然而，对于人类观察者来说，从图像中提取有用信息可能是具有挑战性的，特别是如果该信息包含在使用各自不同的成像模式获取的图像之间的重叠中，并且这些图像作为黑白或灰度图像彼此重叠。例如，为了验证要素是红细胞内寄生虫，观察其中寄生虫候选物可见并且红细胞可见的单幅图像可能是有帮助的。红细胞通常在明视野图像(例如，在紫光照明下获取的明视野图像)中可见，而寄生虫通常在荧光图像中可见。因此，观察彼此重叠、但是其中来自各自成像模式的要素可见而不会彼此干扰的这样的图像是有帮助的。类似地，为了观察白细胞的形态特征(这可以有助于将要素分类为白细胞和/或特定类型的白细胞)，观察在彼此重叠的各自荧光照明条件下获取的各自荧光图像通常是有帮助的。132.因此，根据本发明的一些应用，获取血液样品的显微成像视野的多于一幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取。通常，所述图像中的至少一幅是在紫光照明条件下(例如，在400nm-450nm范围内的波长的光照明下)获取的明视野图像。对于一些应用，明视野图像是在紫光照明条件下获取的离焦图像。此外，通常，所述图像中的至少一幅是荧光图像。计算机处理器组合来自多于一幅图像中的每一幅的数据，以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。通常，使用一个或更多个色彩模型，诸如rgb、cie、hsv和/或其组合来生成人工彩色显微图像。133.通常，在明视野紫光照明条件下获取的图像被映射至人工彩色显微图像的红色通道。此外，通常，在映射至红色通道之前，将图像转换为负反差图像。对于一些应用，映射至在明视野紫光条件下获取的图像的负反差图像的结果是红细胞具有与彩色涂片图像中的红细胞外观类似的外观(例如，类似于使用giemsa或wright-romanowsky涂片染色产生的外观)。通常，在紫光照明条件下获取的明视野图像以上述方式使用，因为紫光被血红蛋白强烈吸收，并且因此在将图像反差为负并将图像映射至红色通道后红细胞呈现为红色。134.对于一些应用，在各自的成像模式下获取三幅图像。例如，除了在明视野紫光照明条件下获取的图像之外，还可以获取两幅荧光图像。例如，可以在用各自波长波段的光激发血液样品之后获取两幅荧光图像。可选地，可以在用相同波长波段的光激发样品之后但使用各自不同的发射滤光器获取两幅荧光图像。通常，将第二幅图像映射至人工彩色显微图像的第二色彩通道，并且将第三幅图像映射至人工彩色显微图像的第三色彩通道。例如，当使用rgb色彩模型时，可以将第一幅图像映射至红色通道(如以上描述的)，将第二幅图像映射至绿色通道，并且将第三幅图像映射至蓝色通道。对于一些应用，在使用使细胞核(例如，细胞核的dna)发出荧光的光(例如，uv光)激发样品时，获取第二幅图像和第三幅图像之一。可选地或另外地，在使用使rna和/或细胞质发出荧光的光(例如，蓝光)激发样品时，获取第二幅图像和第三幅图像中的第二幅图像。对于一些应用，使用的成像模式类似于使用giemsa或wright-romanowsky涂片染色生成的图像中使用的模式。135.对于一些应用，荧光图像中的每一幅使用相对长的曝光时间来获取。例如，这可以用于观察网织红细胞以及血小板。可选地，荧光图像中的一幅可以使用相对长的曝光时间来获取，并且荧光图像中的另一幅可以使用相对短的曝光时间来获取。长曝光和短曝光荧光图像通常包含不同的信息。使用短曝光获取的图像通常被优化以提供与白细胞和其他高强度对象相关的数据，而使用长曝光时间获取的图像通常被优化以提供与低强度对象(诸如网织红细胞、血小板、寄生虫、血影细胞等)相关的数据。136.对于一些应用，短曝光时间图像与长曝光时间图像组合为单幅荧光图像(例如，通过将长曝光时间图像中的过曝光区域替换为短曝光时间图像中的对应区域)。对于一些应用，将所得复合图像(和/或使用不同的复合图像生成技术生成的复合图像)映射至人工彩色图像的通道之一，例如，使用上文描述的技术。137.对于一些应用，使用神经网络来生成人工彩色图像。在一些情况下，使用上文描述的方法生成的人工彩色图像可以具有不同于本领域通常使用的图像类型的特征。例如，这样的图像可以在色彩、强度分辨率、阴影等方面与标准图像不同。对于一些应用，使用卷积神经网络来生成与视野中的标准图像更类似的图像，使得该图像具有与彩色涂片图像外观类似的外观(例如，类似于使用giemsa或wright-romanowsky涂片染色生成的图像)。138.对于一些应用，映射至彩色图像的一幅或更多幅图像被归一化。例如，可以通过将图像除以背景图来对图像进行归一化。可选地或另外地，图像的函数(诸如光密度)可以用于彩色图像。对于一些应用，所显示的彩色图像被归一化，使得相关特征在所有通道中具有类似的量级(magnitude)。对于一些应用，原始图像中的一幅或更多幅和/或所显示的彩色图像通过以下进行归一化：确定图像内的最大强度，并且去除具有小于最大强度的特定比例(例如，小于最大强度的一半)的强度的所有像素，以及将像素强度如下文描述重新归一化。对于一些应用，原始图像和/或所显示的彩色图像中的一幅或更多幅以以下方式归一化。生成图像的强度直方图。对于图像内具有至少等于最大强度的一半的强度的每个像素，在强度直方图中鉴定具有大于图像内最大强度的一半的强度的最近局部最大值。然后基于最大强度与局部最大值的强度之间的差对像素的强度进行归一化。例如，可以基于以下公式为特定像素指定强度：139.对于v最小《＝ip《＝v最大，inp＝n*(ip–v最小)/(v最小-v最大)；140.对于ip》v最大，inp＝n；141.对于ip《v最小，inp＝0142.其中：143.inp是像素的归一化强度，144.n是整数(例如，255)，145.ip是像素的原始强度，[0146]v最大是图像内的最大强度，并且[0147]v最小是具有大于图像内最大强度的一半的强度的最近最大值(the closest maximum)的强度。[0148]现在参考图4a-图4d，图4a-图4d是示出根据本发明的一些应用，根据上文描述的技术进行的方法的步骤的流程图。[0149]参考图4a，对于一些应用，在步骤100中，获取血液样品的显微成像视野的多于一幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取。随后，在步骤102中，组合来自多于一幅图像中的每一幅的数据，以便生成看起来像彩色涂片图像的显微成像视野的人工彩色显微图像。步骤102通常由计算机处理器28进行。[0150]参考图4b，对于一些应用，在步骤110中，使用显微镜获取血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取，并且三幅图像中的第一幅图像在紫光明视野成像下获取。随后，在步骤112中，显微成像视野的人工彩色显微图像通过以下步骤生成：将三幅图像中的第一幅图像映射至人工彩色显微图像的红色通道(子步骤114)，将三幅图像中的第二幅图像映射至人工彩色显微图像的第二色彩通道(子步骤116)，并且将三幅图像中的第三幅图像映射至人工彩色显微图像的第三色彩通道(子步骤118)。步骤112和子步骤114-118通常由计算机处理器28进行。[0151]参考图4c，对于一些应用，在步骤120中，使用显微镜获取血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取。随后，在步骤122中，显微成像视野的人工彩色显微图像通过以下步骤生成：生成所述图像中的每一幅的归一化形式，以便去除图像内具有低于阈值的强度的像素(子步骤124)，并且将所述图像中的每一幅的归一化形式映射至相加色模型内的各自不同的通道(子步骤126)。步骤122和子步骤124-126通常由计算机处理器28进行。[0152]参考图4d，对于一些应用，在步骤130中，使用显微镜获取血液样品的显微成像视野的三幅图像，所述图像中的每一幅使用各自不同的成像条件获取。随后，在步骤132中，显微成像视野的人工彩色显微图像通过以下步骤生成：将所述图像中的每一幅映射至相加色模型内的各自不同的通道，以生成初始彩色图像(子步骤134)，并且生成初始彩色图像的归一化形式，以便去除图像内具有低于阈值的强度的像素(子步骤136)。步骤132和子步骤134-136通常由计算机处理器28进行。[0153]对于一些应用，本文描述的设备和方法作必要修改后应用于生物样品，诸如，血液、唾液、精液、汗液、痰、阴道液、粪便、母乳、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、眼泪和/或鼻分泌物(nasal discharge)。生物样品可以来自任何生物，并且通常来自温血动物。对于一些应用，生物样品是来自哺乳动物的样品，例如来自人体的样品。对于一些应用，样品取自任何家养动物、动物园动物和农场动物，包括但不限于犬、猫、马、牛和绵羊。可选地或另外地，生物样品取自用作疾病载体(disease vector)的动物，包括鹿或大鼠。[0154]对于一些应用，本文描述的设备和方法应用于非身体样品。作必要修改后，对于一些应用，样品是环境样品，诸如水(例如地下水)样品、表面拭子、土壤样品、空气样品或其任何组合。在一些实施方案中，样品是食品样品，诸如肉类样品、乳制品样品、水样品、洗涤液样品、饮料样品和/或其任何组合。[0155]对于一些应用，如本文描述的样品是包括血液或其组分的样品(例如，稀释或未稀释的全血样品、主要包括红细胞的样品、或主要包括红细胞的稀释样品)，并确定与血液中的组分(诸如血小板、白细胞、异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、豪-乔小体等)相关的参数。[0156]本文描述的本发明的应用可以采取从计算机可用介质或计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)可访问的计算机程序产品的形式，该介质提供由计算机或任何指令执行系统(诸如计算机处理器28)使用的程序代码或结合计算机或任何指令执行系统(诸如计算机处理器28)使用的程序代码。出于本说明的目的，计算机可用介质或计算机可读介质可以是任何可以包括、存储、通信、传播或传输程序的设备，所述程序由指令执行系统、设备或装置使用或结合指令执行系统、设备或装置使用。介质可以是电子、磁、光学、电磁、红外或半导体系统(或设备或装置)或传播介质。通常，计算机可用介质或计算机可读介质是非瞬时性计算机可用介质或非瞬时性计算机可读介质。[0157]计算机可读介质的实例包括半导体或固态存储器、磁带、可移动计算机磁盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、硬磁盘和光盘。目前光盘的实例包括光盘只读存储器(cd-rom)、光盘读/写(cd-r/w)和dvd。[0158]一种适于存储和/或执行程序代码的数据处理系统将包括通过系统总线直接或间接耦合至存储器元件(例如，存储器30)的至少一个处理器(例如，计算机处理器28)。存储器元件可以包括实际执行程序代码期间使用的本地存储器、大容量存储器和高速缓存存储器，所述高速缓存存储器提供至少一些程序代码的瞬时性存储，以便减少在执行期间必须从大容量存储器中检索代码的次数。系统可以读取程序存储装置上的本发明指令，并且遵循这些指令来执行本发明实施方案的方法。[0159]网络适配器可以耦合至处理器，以使得处理器能够通过介入的专用或公共网络变得耦合至其他处理器或远程打印机或存储装置。调制解调器、电缆调制解调器和以太网卡仅是目前可用的网络适配器类型中的几种。[0160]用于进行本发明的操作的计算机程序代码可以用一种或更多种编程语言的任何组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言诸如java、smalltalk、c++等和常规程序编程语言诸如c编程语言或类似编程语言。[0161]应当理解，本文描述的算法可以通过计算机程序指令来实现。这些计算机程序指令可以被提供至通用计算机的、专用计算机的或其他可编程数据处理设备的处理器以生产机器，使得经由计算机处理器(例如，计算机处理器28)或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令创建用于实施在本技术描述的算法中指定的功能/操作的装置。这些计算机程序指令还可以存储在计算机可读介质(例如，非瞬时性计算机可读介质)中，该介质可以指导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作，使得存储在计算机可读介质中的指令产生包括实现流程图框和算法中指定的功能/操作的指令装置的产品。计算机程序指令还可以加载到计算机或其他可编程数据处理设备上，以使得在计算机或其他可编程设备上进行一系列操作步骤，以产生计算机实现的处理，使得在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在本技术中描述的算法中指定的功能/操作的处理。[0162]计算机处理器28通常是用计算机程序指令编程以产生专用计算机的硬件装置。例如，在被编程以进行本文描述的算法时，计算机处理器28通常用作专用人工图像生成计算机处理器。通常，本文描述的由计算机处理器28进行的操作根据所使用的存储器的技术将存储器30(其为真实的物理物品)的物理状态转换为具有不同的磁极性、电荷等。[0163]本文描述的设备和方法可以结合以下任一专利或专利申请中描述的设备和方法使用，所有这些专利或专利申请都通过引用并入本文：[0164]bachelet的us 9,522,396；[0165]greenfield的us 10,176,565；[0166]pollak的us 10,640,807；[0167]pollak的us 9,329,129；[0168]pollak的us 10,093,957；[0169]yorav raphael的us 10,831,013；[0170]bachelet的us 10,843,190；[0171]yorav raphael的us 10,482,595；[0172]eshel的us 10,488,644；[0173]eshel的wo 17/168411；[0174]pollak的us 2019/0302099；[0175]zait的us 2019/0145963；以及[0176]yorav-raphael的wo 19/097387。[0177]本领域技术人员将理解，本发明不受限于上文特别示出和描述的内容。而是，本发明的范围包括上文描述的各种特征的组合和子组合二者，以及它们在现有技术中不存在的变化和修改，本领域技术人员在阅读前述描述时将会想到这些。









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